用于收集激光顯微剖切物的試樣收集器的制造方法
【專利摘要】本發明涉及一種用于激光顯微剖切裝置的激光顯微剖切物試樣收集器(1)，其中該試樣收集器包括用于收集剖切物(111)的收集室(10)，其特征在于，所述收集室(10)在試樣側具有向著環境敞開的、用于容納剖切物(111)的開孔，所述收集室(10)具有第一閥門(102,122)，它在關閉狀態形成收集室(10)的遠離試樣的封堵，用于滯留剖切物(111)，并且在第一閥門(102,122)下游設置毛細管線(107)，它與收集室處于連接以輸送來自所述收集室(10)的剖切物(111)。
【專利說明】用于收集激光顯微剖切物的試樣收集器
【技術領域】
[0001]本發明涉及一個用于激光顯微剖切裝置的激光顯微剖切物試樣收集器和一個這種激光顯微剖切裝置。
【背景技術】
[0002]在激光顯微剖切中為了繼續分析，借助于聚焦的激光射線選擇的組織范圍或者細胞從顯微鏡的組織試樣中分出來或者切下來(“剖切”)。
[0003]申請者的DE 100 18 253 C2，DE 10 2005 028 062 B4和DE 10 2005 008 925 Al
描述了用于在使用顯微鏡的條件下激光顯微剖切的可能的方法和系統。
[0004]基于毛細管的分析儀已經發展到可以在小液滴或溶液中通過毛細系統輸運、分選、分析從組織中分解出來單個細胞或者甚至染色體，并且在分析后也可以繼續使用。以基于毛細管的分析技術例如由公司Fluidigm(http://www.fluidgim.com)和RainDanceTechnplogies (http://www.raindancetechnologies.com)應用和推廣。
[0005]為了可以利用這種技術分析，必需首先分離試樣和單個細胞；這可以通過基于熒光的流式細胞術、激光顯微剖切和移液到相應的用于毛細系統的輸送介質里面實現。
[0006]對于在激光顯微剖切中切割的所謂的“剖切物”提供不同的收集器供使用，例如所謂的“tube-caps”，八聯管條(8er streifen)，八聯管條蓋或者所謂的“口袋實驗室”(英文也稱為:Lab on a Chip)，例如AmpliGrid裝置。在激光顯微剖切過程以后從剖切機中物理地取出這個收集器，并且獨立地繼續處理。為此通常需要離心步驟和移液步驟，直到剖切物在相應的溶液中輸送到分析方法，例如聚合酶-鏈反應(英文:Polymerase ChainReact1n, PCR),逆轉譯PCR (RT-PCR)或者即時或定量PCR(rt_、qPCR)或者質譜儀(MS)。
[0007]這些工作原理的缺陷是，明顯地限制在利用激光顯微剖切分離以后直接用于自動地繼續處理試樣的可能性。此外必需的費事的離心和移液步驟含有高的污染和試樣損失隱串
■/Q1、O
[0008]由EP 2 083 257 Al已知一種用于傳遞顯微的、分離的試樣的方法和裝置。在此微吸盤被定位在試樣上面，試樣從試樣體上在物體臺上切下來。在微吸盤偏轉之前微吸盤主動地從物體臺上吸住試樣，并且接著將試樣在另一位置再吹下來。由此可以將試樣轉移到反應罐里面。但是在抽吸前不可能或者至少不能足夠地視覺地檢查試樣，因為它還被保留的試樣體(試樣從其上被切割下來)包圍。
[0009]DE 10 2009 016 512 B4公開了一個激光切除腔，由一個容器組成，它可以從上面通過玻璃蓋氣密地封閉，要被檢查的試樣位于其底面上。該容器具有用于輸送氣體(例如氬氣)的輸入管和排出管。首先實現試樣檢查，且確定利用激光切除要去除的部位。通過激光顯微剖切儀在充分利用這種儀器的高分辨率物鏡的條件下進行這種檢查。在確定相應的部位以后利用激光切除從試樣上去除這個部位，并且通過輸入輸送氣體從氣密的容器例如輸送到分析裝置，例如質譜儀。根據分析結果可以分析其它試樣部位。為此可以使用已知的激光顯微剖切，它能夠以高精度以亞微米范圍剖切試樣切片。為了激光顯微剖切，所述激光切除腔被替換為常見的用于激光顯微剖切的試樣容器。
[0010]DE 103 29 674 Al的目的是克服UV切除的缺陷，例如在生物組織中的UV射線吸收或者較低的切割質量。為了切割生物材料，在這里建議使用超短皮秒或飛秒范圍的激光脈沖，在激光波長為大于400nm(近紅外)時重復頻率為至少1000Hz，其中激光聚焦在試樣上，用于在那里產生至少1012W/cm2的高強度。由此實現所謂的非共振多光子吸收，它為了切割作用產生離子。在一實施例中切割下來的生物材料通過電離作用與周圍的試樣分開并且落到以賴氨酸覆層的玻璃蓋上。在此例如將試樣通過載有它的薄膜涂覆在玻璃窗的底面上。硅環連接玻璃窗與以賴氨酸覆層的玻璃蓋。切下來的生物材料例如可以通過插入兩個針管通過硅環或者吸出來或者利用流體動力流沖出來并且利用無菌過濾器收集。上玻璃窗、硅環和用于收集切下來的材料的玻璃蓋一起形成封閉的無菌室。
[0011]因此本發明的目的是，在完成激光顯微剖切以后實現自動的試樣處理，尤其具有可視或者說觀察剖切物的可能性。
【發明內容】
[0012]這個目的通過如獨立權利要求所述的用于激光顯微剖切裝置的激光顯微剖切試樣收集器和這種裝置得以實現。在各從屬權利要求和下面的描述中公開了優選的實施例。
[0013]按照本發明的激光顯微剖切物試樣收集器具有能夠檢查的、用于容納剖切物的收集室，其中所述收集室在試樣側具有向著環境基本敞開的、用于容納剖切物的開孔。所述收集室還具有第一閥門，它在關閉狀態形成收集室的遠離試樣的封堵(或底部)，用于尤其暫時滯留剖切物。在第一閥門下游設置毛細管線，它為了輸送來自收集室的剖切物(在閥門打開時)與這個收集室處于連接。
[0014]下面的定義“下游”和“上游”涉及一流動方向，它從收集室的試樣側開孔通過第一閥門指向毛細管線方向，因此流動方向描述了剖切物的輸運途徑。
[0015]所述收集室的“向著環境基本敞開的開孔”要理解為，所述收集室不是氣體或液體隔絕地密封。
[0016]本發明的優點是，按照本發明的試樣收集器收集切下來的試樣(剖切物)，首先在通過關閉的第一閥門形成的底部上滯留，并且接著再導送到且通過毛細管線，無需手動的工作步驟。在剖切物的收集與繼續導送之間必要時可以視覺地檢查或觀察剖切物。在其繼續導送以后剖切物可以輸送到分析。所述試樣收集器對于繼續導送尤其無需手動地取出和/或傾斜。通過這種方式實現試樣處理的自動化，這改善了工作舒適性并且減少工作時間。此外可以避免或者至少減少由于手動的工作步驟帶來的污染和/或材料損失。所述試樣尤其可以通過使用適合的緩沖劑或者溶劑為了沖洗直接在剖切過程以后被保護并且輸送到分析。
[0017]所述收集室可以是試樣收集器的內部表面的一部分。所述收集室與毛細管線的連接可以以直接接頭的形式出現，該接頭包括第一閥門。在此收集室和毛細管線可以作為公共的、單個零部件的分段制成，例如由玻璃或塑料制成。這種分段可以相互連接，或者該零部件可以具有(閥門)段，它設置在兩個上述分段之間。備選地可以使所述收集室和毛細管線由獨立的零部件或者獨立零部件的一部分呈現，它們直接或者通過一個或多個連接部件(第一閥門)相互連接。獨立的零部件可以由同一種材料制成。備選地可以使至少一個零部件含有至少一種材料，而在其它零部件中不含有它。
[0018]所述毛細管線可以是毛細管或管道。
[0019]收集室例如可以用于，收集多個剖切物，然后使它們共同地通過第一閥門穿過毛細管線導引并且從那里供其它反應過程使用。這種收集室還能夠或易于添加輸運/載體物質，例如液體，例如用于通過排出管沖出剖切物。
[0020]在此例如可以設有第二閥門，它有選擇地關閉或打開收集室，只有在打開閥門時剖切物或其它材料才可以落入到收集室里面。由此尤其在收集剖切物以后通過關閉第二閥門防止外來物、如污物擠入收集室里面。因此第二閥門在關閉狀態形成收集室的試樣側的封堵(“蓋”)。
[0021]通過第一閥門可以控制來自收集室且通過毛細管線的剖切物的輸運。因此可以控制剖切物通過毛細管線偏轉并輸送到其它試樣處理或分析的時刻。例如剖切物可以在其切下來以后且在其從收集室輸運前首先視覺地通過使用者檢查。
[0022]在優選的實施例中，所述收集室和/或毛細管線可以具有至少一個注射器，通過它可以輸入載體物質或其它輸運物質。由此例如能夠添加液體，用于通過毛細管線輸運剖切物。備選或附加地可以實現適用于其它試樣處理的物質添加，例如適合的緩沖劑、溶劑、形成膠束的液體或類似物質。下面關于定義“載體物質”，要包括兩種輸入的物質。
[0023]如果所述試樣收集器如上所述包括具有兩個閥門的收集室，有利的是，在兩個閥門之間設置注射器。這能夠在添加物質之前關閉收集室，由此例如不會排出物質的氣味或蒸汽或者不會臟污物質。
[0024]所述試樣收集器可以包括給料器，它最好設置在收集室與毛細管線之間。該給料器最好在收集室下游設置。
[0025]這種給料器能夠使剖切物包括在液滴里面。各個液滴最好可以在排出管中分選。例如可以使含有剖切物的液滴與其它液滴分開。沒有剖切物的液滴例如可以輸送到再使用或其它應用(例如通過試樣收集器的注射器重新注射)，而含有剖切物的液滴可以導引到分析運算。
[0026]通過毛細管線可以輸運最小體積的液體。所述毛細管線可以具有分支。所述分支可以由分選交叉口構成，在其上含有剖切物的液滴自動地(例如利用電場梯度)與沒有剖切物的液滴分開。由此可以提高剖切物在分析溶液中的濃度并由此改善例如利用DAN富集的分析。在使用分選交叉口時離開的毛細管線用于輸運剖切物，而另一離開的毛細管線使載體物質導回到儲罐，它隨后可以利用泵例如通過注射器輸入到收集室。
[0027]在適宜的實施例中，在所述收集室的開孔的上游設置能夠檢查的流出裝置，其流出部與收集室的開孔處于連接。在這種情況下剖切物不直接落入到收集室里面，而是首先落入到流出裝置，在其中例如可以視覺或通過相機檢查。從流出裝置流出的剖切物接著通過收集室的開孔進入到收集室。
[0028]在優選的實施例中，所述流出裝置包括沖洗裝置和/或排出或抽吸裝置。所述沖洗和/或排出或抽吸裝置可以用于，使剖切物可靠地從流出裝置輸送到毛細管線里面。由此也可以監控從收集室輸運剖切物的時刻。
[0029]在沖洗裝置情況下這個沖洗裝置可以調整成，使流出裝置已經在例如剖切物落入之前和/或連續地加濕，并由此易于輸運落入的剖切物。備選地可以調整沖洗裝置，只有在收集剖切物以后才饋入液體到收集裝置里面，這能夠實現剖切物的事先可視化。在此可以自動地在給定的時間間隔以后自動地或者手動地通過使用者激活饋入。通過這種方式一方面給使用者在剖切物沖洗到毛細管線里面之前視覺地檢查剖切物的時間，另一方面可以首先收集多個剖切物到收集裝置，在它們共同地沖洗到毛細管線里面之前。
[0030]在尤其具有沖洗裝置的實施例中，所述流出裝置由通過加大的側面邊緣限定的收集面構成。由此可以收集輸入的液體并且通過收集面相對于水平面的傾斜控制液流方向。所述剖切物尤其可以有目的地沖洗到收集室的開孔。
[0031]在特別有利的實施例中，在第一閥門下游在這個閥門后面設置一過濾器，其中所述過濾器設置為能夠使剖切物通過。所述過濾器尤其直接設置在毛細管線前面的第一閥門后面，或者設置在毛細管線本身里面。穿過過濾器的剖切物通過毛細管線繼續輸運。
[0032]所述過濾器尤其對于上述的載體物質是可透過的，而滯留其它尤其固態的剖切物之外的物質。尤其薄膜碎片屬于這種剖切物之外的物質。在激光顯微剖切時通常使用所謂的薄膜物體支架。要剖切的材料涂覆到適合的(通常吸收UV激光的)薄膜上，其中激光顯微剖切系統的激光也一起切割試樣與薄膜。因此所述剖切物物理地從薄膜與包圍的試樣的總復合中完全分開。其結果是，提取的試樣(剖切物)還與同樣提取的表面(表面碎片)連接。薄膜碎片可能堵塞試樣收集器的毛細管線和/或影響下面的反應。
[0033]下面要假設，這種過濾器直接設置在在收集室的第一閥門后面毛細管線前面。為了分離剖切物與薄膜碎片可以使用下面的方法:在收集室里面收集剖切的試樣，在那里必要時可以檢查剖切物。通過注射器將裂解液給到收集室，它使剖切物與薄膜碎片分開。試樣通過裂解液或者裂解液中的消化酶也完全裂解/消化，由此使以前固態的試樣的組成部分位于溶液(裂解液)里面，而薄膜保持其初始的固態形狀。通過打開第一閥門(裂解的)剖切物通過過濾器進入到毛細系統，而以前剖切的薄膜碎片被過濾器滯留。
[0034]為了凈化過濾器的薄膜碎片存在不同的方法:首先可以換下整個收集室連同閥門和過濾器并且通過一個新的來替換。備選地只換下過濾器并且通過一個新的來替換。附加地或備選地能夠在更換過濾器或全部收集室之前(或者也為了避免這種更換)，沖洗過濾器。為此例如在打開第一閥門時在相反方向上沖洗過濾器，由此使薄膜碎片進入到收集室里面。薄膜碎片例如可以利用注射器(或者利用已經設置在那里的注射器)吸出。
[0035]在優選的實施例中，按照本發明的試樣收集器組合到激光顯微剖切裝置里面。這個裝置還包括用于產生激光射線的激光源、用于偏轉激光射線的偏轉裝置、作為聚焦透鏡的顯微鏡物鏡和用于容納物體支架的顯微鏡臺。所述激光射線利用顯微鏡物鏡聚焦在位于物體支架上的試樣上。利用偏轉裝置使激光射線沿著切割線在試樣內部導引。所述試樣收集器最好固定在物體支架下面并且這樣對準，使被激光射線切下來的剖切物落到試樣收集器的收集室(或者前置的流出裝置)里面。
[0036]這種激光顯微剖切裝置包括顯微鏡，其中設有用于耦入激光射線到顯微鏡光程里面的措施。在此它可以是分光器，它對于激光波長是反射的，而它對于顯微鏡的觀察波長是可透過的。此外可以設有用于耦入激光射線的光學元件(透鏡等)。總體上適宜地使用用于使激光射線通過顯微鏡物鏡耦入并聚焦在試樣上的照明裝置。然后激光射線穿過設置在照明裝置里面的偏轉裝置并且入射到作為聚焦透鏡的顯微鏡物鏡上。所述激光射線聚焦在試樣上并且利用相應的通過偏轉裝置的偏轉描繪試樣上的切割線。沿著這個切割線切割試樣，由此產生剖切物。這種布置是特別有利的，因為顯微地(例如利用熒光顯微鏡)檢查試樣并且可以識別要剖切的試樣部位。此外也可以視覺地或者利用照相機觀察且必要時控制激光切割過程，因為顯微鏡臺在激光切割期間不必運動。
[0037]關于上述激光顯微剖切系統(它包括顯微鏡)的原理結構和工作方式請詳細地參閱專利文獻DE 100 18 253 C2。這種系統尤其結合按照本發明的試樣收集器是有利的。為了避免重復，關于該系統的細節在本說明書中引用上述專利文獻的相應公開內容。
[0038]在剖切物處理范圍內可以確定，已經在收集室里面收集給定數量的剖切物。這可以包括獲取已實施的剖切步驟的數量和將所獲取的數量與給定數量比較。通過這種方式例如可以在溶液中達到對于分析運算所需的剖切物濃度。
[0039]當然，上述的和下面還要解釋的特征不僅可以在各給定的組合中應用，而且可以在其它組合中或者單獨地應用，而不離開本發明的范圍。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0040]借助于附圖中的實施例簡示出本發明并且在下面參照附圖詳細地描述。附圖中:
[0041]圖1示例地示出按照本發明的試樣收集器實施例和在其應用時的不同方法步驟，
[0042]圖2A示出按照本發明的試樣收集器的另一可選擇的實施例和其應用，
[0043]圖2B示出剖切物在圖2A的方法延續中的繼續過程，
[0044]圖3A示出按照本發明的試樣收集器的另一可選擇的實施例和其應用的第一步驟，
[0045]圖3B示出在圖3A中所示的試樣收集器應用的另一方法步驟，
[0046]圖4示出具有過濾系統的試樣收集器在不同的應用級別(圖4A至4C)，
[0047]圖5示出可能的過濾系統裝置，
[0048]圖6示出具有組合的試樣收集器的激光顯微剖切系統。
【具體實施方式】
[0049]圖1示出方法的五個步驟，在其中應用按照本發明的試樣收集器I的實施例。
[0050]試樣收集器I包括收集室10，它在所示情況下具有兩個閥門101和102。第一閥門102在關閉狀態形成遠離試樣106的收集室10的封堵(底部)。在第一圖示步驟Sll中打開第二閥門101(蓋)，因此收集部位已經用于容納落下的剖切物111。在其底面上在第一閥門102下游收集室10與毛細管線連接，毛細管線作為用于從收集區輸運剖切物的排出管。通過閥門102監控剖切物從收集室10的收集區繼續導引到排出管。在圖示步驟Sll中閥門102關閉。
[0051]試樣收集器I設置在固定試樣106的物體支架103下方。利用通過顯微鏡物鏡聚焦的激光射線9在步驟Sll中從試樣106切割剖切物111。切下來的剖切物落入到試樣收集器I的收集區(即收集室)10里面。圖6詳細解釋可能的激光顯微剖切裝置。
[0052]如果剖切物落入到收集室里面(步驟S12)，上閥門101可以關閉(步驟S13)。通過重復步驟Sll可以繼續切下其它剖切物并且容納在收集室10里面，直到達到所期望的剖切物數量。下閥門102可以打開，使剖切物可以直接接觸到排出管107 (步驟S14)，它例如可以襯入到微流體的毛細系統里面；在此上閥門101最好關閉。在步驟S15示例表示的剖切物111進入到分選交叉口 108，從那里可以輸送到其確定地點，如同下面還要解釋的那樣。在所有步驟期間或者之前或之后可以通過可選的注射器104添加載體物質，例如適合的緩沖劑、溶劑、形成膠束的液體或類似物質。此外注射器104可以在步驟S14中用于沖出剖切物。
[0053]附加地對于上面簡示的試樣收集器實施例存在可能性，使收集室10與給料器109組合。這樣的實施例在圖2A和2B中示出:除了類似在圖1中示出的特征以外，在圖2A和2B中所示的試樣收集器I包括給料器109。
[0054]第一圖示步驟S21對應于圖1的步驟Sll:在此剖切物111從試樣106上切下來并落入到具有收集室10的試樣收集器I里面。現在下閥門102(如同對于步驟S22a所示)可以關閉，或者(如同對于步驟S22b所示)打開。因此剖切物111固定在下閥門102(步驟S22a)上或者直接在給料器109頭部與液體113混合(步驟S22b)。在兩個步驟S22a和S22b中能夠在收集過程之前、之后和/或期間有選擇地通過注射器104有選擇地添加載體物質(未示出)。如果剖切物對應于步驟S22a固定在下閥門102上或者上方，則閥門102緊接著打開，由此使剖切物(如同在步驟S22b中所示那樣)進入到給料器109。
[0055]緊接著步驟S22b可以使下閥門102(如同在步驟S23a中所示那樣)馬上再關閉。備選地可以首先(如同在步驟S23b中所示那樣)通過注射器104實現物質添加114。
[0056]按照圖2B在下一步驟S24中剖切物111離開給料器109，由此使它包圍在一個液滴115里面。在此在視圖中下閥門102(又)關閉，但是它也可以選擇打開，尤其當前面的步驟對應于步驟S23b的時候。液滴115進入到毛細管線107里面。
[0057]在步驟S25液滴115與包圍在其中的剖切物111接近分選交叉口 108。在那里利用施加的電場梯度在步驟S26中使液滴與剖切物111分選，并且在單獨的毛細管117中輸送到所期望的分析，而沒有剖切物的液滴可以在另一毛細管118中分選并回收。回收必要時通過注射器重新注射。在重復過程之前必要時必需使給料器109再充滿(未示出)，例如通過注射器104。在此打開下閥門102，上閥門101同樣可以打開或者也可以關閉。
[0058]圖3A和3B示出可選擇的實施例，其中在試樣收集器I的收集室10的上開孔的上游前置一個通過加大的側面邊緣125限定的收集面124作為流出裝置11。流出裝置最好包括沖洗裝置或排出裝置或者說抽吸裝置，借助于它們可以使收集的剖切物漂移到排出管107。
[0059]在此在第一步驟S31中，通過激光顯微剖切從試樣106上切下剖切物111。剖切物通過重力向下落。在步驟S32收集剖切物到試樣收集器I的流出裝置的收集面124上。收集面124與水平面相比傾斜。在所示實施例中，流出裝置11包括注射器或者沖洗裝置119，通過它們可以添加沖洗液體或者其它物質，一般是載體物質。收集面124的側面邊緣125加大，防止(沖洗)液體溢流并且導引到流出部126。
[0060]在所示情況下在步驟S32中還沒有液體或其它物質導引到收集面124里面。因此可以實現收集面124和剖切物的檢查。備選地可以使收集面124連續地利用沖洗或注射器119濕潤。
[0061]通過以適合的沖洗溶液沖洗，使剖切物111在步驟S33中通過流出部126并且在步驟S34中通過一連接部被沖洗到收集室10，收集室10在所示情況下組合到毛細管腔120里面。對于沖洗備選地可以設想抽吸剖切物。
[0062]所示的毛細管腔120具有自身的收集室10。進入閥121、排出閥122以及可選擇的注射器123。通過打開進入閥121使剖切物111在步驟S35進入到收集室10里面，收集室10的排出閥122關閉，如同在圖3B中所示那樣。
[0063]收集室10 (如同在步驟S36a中所示那樣)直接或者(如同在步驟S36b中所示那樣)通過給料器109連接在排出管107上。如果存在注射器123，可以通過它在兩種情況下在關閉排出閥122時實現添加一種或多種物質。
[0064]從步驟S36a(即在收集室10不連接在給料器的情況下)開始，在步驟37a中打開排出閥122并且轉移剖切物到排出管107里面，它在這里是毛細管。在步驟S38a中剖切物在包圍的液體里面通過毛細管107 (如同例如在圖1中所示的那樣)輸送到其后續分析。關于其它工作方式請參閱圖1或圖2A和2B。
[0065]在收集室10連接在給料器109的情況下(S36b)，剖切物在步驟S37b和S38b中與對于圖2B描述的步驟S23b-S25類似地包括在一個液滴里面，它被與沒有剖切物的液滴分開并且導引到用于分析剖切物的反應地點。
[0066]圖4示出按照本發明的試樣收集器I實施例的工作方式，如同基本已經在圖1中所示的那樣，具有過濾系統，用于分離剖切物111與剖切物之外的物質112，例如薄膜。為此在圖4中對第一閥門102后置過濾器116，其中過濾器116還設置在毛細管線107前面。
[0067]圖4A示出用于激光射線9的聚焦透鏡105，它聚焦在被物體支架103固定的試樣106上。切下來的剖切物在打開第二閥門101時落入到試樣收集器I的收集室10里面。因此參閱對于圖1的解釋。
[0068]激光顯微剖切通常通過所謂的薄膜物體支架進行。為此將試樣106涂覆在適合的薄膜(例如由吸收UV激光的材料制成)上。激光顯微剖切系統的激光9從試樣106切下剖切物111，同時一起切下固定剖切物111的薄膜。結果是，提取的試樣、即剖切物111還與同樣提取的薄膜112連接。這個薄膜112可能堵塞毛細管線107的毛細管或者影響以后的反應。
[0069]圖4B示出在第二閥門101已經關閉以后，剖切物111已經落入到收集室10里面以后，在試樣收集器I里面的狀況。通過注射器104已經將載體物質113給到收集室10的內部。因此在關閉第一閥門102時剖切物111與薄膜112—起位于載體液體里面。在按照圖4B的狀況中可以檢查剖切的試樣。作為載體物質113可以添加裂解液，它至少使剖切物111與薄膜碎片112分開，或者試樣完全在薄膜碎片112保留的條件下溶解/裂解。
[0070]圖4C示出在打開第一(下)閥門102以后的狀況。因為過濾器116對于載體物質(裂解液)113以及對于剖切物111或者溶解的試樣是可透過的，而對于薄膜112不可透過，剖切物111轉移到毛細系統107里面，而一起剖切的薄膜碎片112保留在過濾器116里面。
[0071]圖5以簡示的形式示出凈化過濾系統的方法。
[0072]原則上存在三種凈化過濾系統的可能性。根據結構形式，或者可以更換全部收集室10與閥門101和102以及過濾器116，或者只更換過濾器116。為了盡可能避免或者至少只在較長的時間間隔以后需要時進行這種更換，可以有利地沖洗過濾器116。這個過程在圖5A至5C中簡示。首先通過載體物質或者其它過濾器凈化液體沖洗過濾器116，由此在打開閥門102時使過濾下來的薄膜112或者許多位于那里的薄膜碎片沖洗到收集室10內部。接著再關閉下閥門102(圖5B)。現在排空收集室10內部，其中這一點可以通過設置在那里的注射器、例如注射器104實現。也能夠只抽吸薄膜碎片112，無需完全排空收集室10。圖5C示出在過濾器系統凈化以后的狀態。通過打開上閥門101使用收集器又準備容納剖切物。
[0073]圖6簡示出激光顯微剖切裝置，它如何可以應用于本發明。特別適用于本發明的激光顯微剖切系統在德國專利文獻DE 10 2005 028 062 B4中詳細描述過。因此關于某些下面提及的這個系統的細節請參閱這個文獻，因此在本申請中引用其公開內容。
[0074]激光顯微剖切裝置200包括顯微鏡204，具有可電動移動的χ-y臺、用于容納物體支架103的顯微鏡臺205，在物體支架103上放置要檢查和/或要切割的樣本(試樣)106。以209表示透光照明裝置。試樣106可以以透射光或者以入射光照明。以203表示相應的入射裝置。這個入射裝置203的相應光源可以與激光源201—起安置。也可以使用分開的布置，也具有分開光路。206表不光源,例如齒素燈或者白光LED,具有后置的(未詳細不出的)照明光路，用于產生透射照明光程。這個照明光程利用偏轉鏡207和聚光鏡211從下面對準試樣106。顯微鏡204還包括物鏡105以及未詳細不出的顯微鏡部件,例如放大系統、管透鏡和目鏡。目鏡本身以212表示。
[0075]透過試樣收集器I和試樣106的透射照明光程的光線進入到物鏡105，它檢測部分試樣106，它可以由觀察者以顯微圖形的形式通過目鏡212觀察。附加地使顯微鏡204與照相機217連接，它例如通過CCD芯片可以檢測樣本切片的數字圖形。由照相機217攝取的圖形數據傳遞到計算機220，它本身與顯示面218 (在這里是顯示器)連接，在其上可以顯示攝取的樣本切片圖形。計算機220和照相機217也可以完全或者部分地形成集成單元。
[0076]所示的激光顯微剖切裝置200還包括激光裝置(在這里入射裝置203)，用于通過激光切刀切割試樣106的激光顯微切割部位。為此使激光源201與顯微鏡204例如通過激光源201的連接耦聯在顯微鏡物鏡208上。由激光源201產生的激光射線9通過還要解釋的部件216，219，214，202和213耦入到顯微鏡204的光軸210里，并且通過顯微鏡物鏡105聚焦在試樣106上用于切割。通過激光射線9與試樣106之間的相對運動可以使相應的剖切部位從樣本上沿著給定的標記(切割線)切下來。盡管這個相對運動可以在激光射線9靜止時通過顯微鏡臺205和相關的物體支架103的相應運動實現，但優選且在這個實施例中反過來，在顯微鏡臺205靜止或者物體支架103靜止時在激光切割期間使激光射線9運動。其最大優點是，在激光顯微切割期間可以直接觀察試樣106。
[0077]為此，使激光射線9通過(可選擇的)削弱單元216 (衰減器)、聚焦光路219以及光圈單元214導引。利用這些元件以公知的方式(詳見已經提過的DE 10 2005 028 062B4)在試樣106中所期望的位置上以所期望的強度和幾何形狀產生激光射線焦點。偏轉元件213用于耦入激光射線9到顯微鏡204的光軸210中。例如UV激光適合于作為激光。
[0078]在圖6中以215表示控制裝置。它可以包括相互分開的單元，如同在圖6中圖示的那樣，但是在實踐中控制裝置通常是一個單元，它尤其也可以集成到計算機220里面。在這個實施例中控制裝置215與激光源201、削弱單元216、聚焦光路219、光圈單元214以及與還要解釋的偏轉裝置202連接，用于可以適合地控制這些元件。與顯微鏡臺205的連接(在這里未示出)也是有意義的，可以移動到或駛過試樣106的不同部位。與照相機217的連接同樣是適宜的，可以調整拍攝參數。其它細節請再次參閱DE 10 2005 028 062 B4。
[0079]為了使激光射線沿著給定標記或切割線運行以切割試樣部位(剖切物)，存在偏轉單元202，它包括成對楔板，其各個楔板相互間以變化的方式對準。通過這種方式可以以公知的方式使來自光軸的激光射線以一偏移量偏轉，由此使它相應偏移地入射試樣106,其中激光射線對于所有的偏轉角穿過物鏡105的物鏡光瞳中心延伸。關于偏轉裝置202的結構和工作原理的細節請參閱德國專利文獻DE 100 18 253 C2。通過適合地控制偏轉裝置202能夠使激光射線焦點沿著任意給定的切割線移動。
[0080]在這里涉及的激光顯微切割裝置200能夠在不同的顯微方法下獲得試樣切片，尤其在物體支架103的靜止的固定位置。能夠實現的透射照明在上面已經解釋了。這里只針對激光裝置解釋的入射裝置203也代表性地用于其它入射照明方法，例如反差方法或者入射熒光方法。適宜地可以使一個樣本切片通過(至少)兩種不同的顯微方法表示，以疊加成顯微圖形并且在疊加圖形中(自動或手動地)定義切割線。計算機220然后通過控制裝置215控制偏轉裝置202，用于以相應的方式由試樣106產生剖切物111。剖切物111進入到按照本發明的試樣收集器1，尤其進入到收集室10內部。
[0081]如上借助于圖1和2詳細解釋的那樣，位于收集室10內部的剖切物111被轉移到毛細管線107里面。為此也可以設有給料器109 (參見圖2)。此外如圖3所示，可以使用流出裝置11。通過分選交叉口 108 (參見圖1)可以分選剖切物111并且輸送到分析裝置(在這里未示出)。多余的載體物質可以通過毛細管系統的另一管線再輸送到其起點(例如也可以是儲罐，從那里可以利用泵再將載體物質送回到其初始的使用地點)。
[0082]為了可以顯微地觀察剖切過程，要注意位于透射照明光程中的試樣接收器I部件盡可能是透光的。否則可以選擇照射觀察。也可以設想可選擇的透射照明和入射照明。
[0083]附圖標記清單
[0084]I試樣收集器
[0085]9激光射線
[0086]10收集室
[0087]11流出裝置
[0088]101 第一閥門
[0089]102 第二閥門
[0090]103物體支架
[0091]104注射器
[0092]105聚焦透鏡，顯微鏡物鏡
[0093]106 試樣
[0094]107排出管，毛細管線
[0095]108分選交叉口，分支
[0096]109給料器
[0097]111剖切物
[0098]112 薄膜
[0099]113載體物質
[0100]114添加物質
[0101]115 液滴
[0102]116過濾器
[0103]117毛細管
[0104]118毛細管
[0105]119沖洗裝置
[0106]120毛細管腔
[0107]121第二閥門，進入閥
[0108]122第一閥門，排出閥
[0109]123注射器
[0110]124收集面
[0111]125側面邊緣
[0112]126流出部
[0113]200激光顯微剖切裝置
[0114]201激光源
[0115]202偏轉裝置
[0116]203入射裝置
[0117]204顯微鏡
[0118]205顯微鏡臺
[0119]206 光源
[0120]207偏轉鏡
[0121]208顯微鏡支架
[0122]209透光照明裝置
[0123]210 光軸
[0124]211聚光器
[0125]212 目鏡
[0126]213偏轉元件
[0127]214光圈單元
[0128]215控制裝置
[0129]216削弱單元
[0130]217照相機
[0131]218顯示面
[0132]219聚焦光路
[0133]220計算機
[0134]SI1-S15 方法步驟
[0135]S21-S26 方法步驟
[0136]S31-S38b 方法步驟
【權利要求】
1.一種用于激光顯微剖切裝置的激光顯微剖切物試樣收集器(I)，其中該試樣收集器包括用于收集剖切物(111)的收集室(10)， 其特征在于， 所述收集室(10)在試樣側具有向著環境敞開的、用于容納剖切物(111)的開孔，所述收集室(10)具有第一閥門(102，122)，它在關閉狀態形成收集室(10)的遠離試樣的封堵，用于滯留剖切物(111)，并且 在第一閥門(102，122)下游設置的毛細管線(107)，它與所述收集室處于連接以輸送來自所述收集室(10)的剖切物(111)。
2.如權利要求1所述的試樣收集器，其特征在于，所述收集室(10)具有第二閥門(101，121)，它在關閉狀態形成收集室(10)的試樣側的封堵。
3.如權利要求1或2所述的試樣收集器，其特征在于，所述收集室(10)和/或毛細管線(107)具有至少一個注射器(104)，用于輸入載體物質(113)。
4.如權利要求1或2所述的試樣收集器，其特征在于，在所述收集室(10)的兩個閥門(102，122 ;101，121)之間設置注射器(104)，用于輸入載體物質。
5.如上述權利要求中任一項所述的試樣收集器，其特征在于，所述毛細管線(107)具有分支(108)。
6.如上述權利要求中任一項所述的試樣收集器，其特征在于，在所述收集室(10)與毛細管線(107)之間設置給料器(109)。
7.如上述權利要求中任一項所述的試樣收集器，其特征在于，在所述收集室(10)的開孔上游設置流出裝置(11)，其流出部(126)與收集室(10)的試樣側的開孔處于連接。
8.如權利要求7所述的試樣收集器，其特征在于，所述流出裝置(11)包括沖洗裝置(119)和/或排出或抽吸裝置。
9.如權利要求7或8所述的試樣收集器，其特征在于，所述流出裝置(11)由通過加大的側面邊緣(125)限定的收集面(124)構成。
10.如上述權利要求中任一項所述的試樣收集器，其特征在于，在所述第一閥門(102，122)下游在這個閥門后面設置過濾器(116)，其中所述過濾器被設置成能夠使剖切物(111)通過。
11.如權利要求10所述的試樣收集器，其特征在于，所述過濾器(116)在流動方向上設置在所述毛細管線(107)前面。
12.如權利要求10或11所述的試樣收集器，其特征在于，所述過濾器(116)被設置成使得剖切物之外的物質(112)被滯留。
13.如權利要求10至12中任一項和如權利要求3或4所述的試樣收集器，其特征在于，所述過濾器(116)對于載體物質(113)是可透過的。
14.一個激光顯微剖切裝置(200)，它包括用于產生激光射線(9)的激光源(201)、用于偏轉激光射線的偏轉裝置(202)、用于使激光射線通過顯微鏡物鏡(105)聚焦在試樣(106)上的入射裝置(203)、用于容納用于固定要剖切的試樣(106)的物體支架(103)的顯微鏡臺(205)和設置在物體支架(103)的試樣側的、如上述權利要求中任一項所述激光顯微剖切試樣收集器(I)。
【文檔編號】G01N1/04GK104321632SQ201380026810
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2013年5月22日 優先權日:2012年5月24日
【發明者】F·施勞德拉夫 申請人:萊卡微系統Cms有限責任公司
專業數控銑床產品供應商
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