專利名稱：一種組織樣品高分辨率斷層光學顯微成像裝置的制作方法
技術領域：
本發(fā)明為一種基于機械切削實現組織樣品斷層顯微成像的裝置。
背景技術：
對組織樣品進行高分辨率斷層光學顯微成像，再進行三維重建，可以獲得亞細胞結構的三維空間分布，對于神經組織，則可以實現特定神經元樹突和軸突的三維空間分布的追蹤，從而了解神經元之間的相互連接關系。為了實現組織樣品的斷層光學顯微成像，可以采用光學層析成像技術:共聚焦成像技術，通過使用共焦小孔阻擋聚焦面以外的信號，實現層析；雙光子顯微成像技術，利用非線性效應，有效的光學信號只來源于焦點位置，實現層析；另外，也有近年來受到較多關注的光片照明層析技術，將激發(fā)光整形為微米厚度的薄層光片，照明樣品中垂直于探測光軸的一個面，實現層析。這些光學層析成像方法，首先于組織樣品對光的散射和吸收，所能達到的成像深度限制在Imm以內，如果需要對更大的組織樣品進行成像，則需要結合組織樣品的光透明處理以及機械切片過程。機械切片結合光學顯微成像方法理論上不會受制于組織樣品的尺寸和光學特性。結合機械切片與光學顯微成像有多種方式。最為傳統(tǒng)和直接的方式是先對組織樣品進行切片，再將切片轉移到載玻片上進行光學成像。切片和切片的制備過程費時，并且因為很難保證不同切片固定和成像位置的一致性，需要對不同切片的圖像進行空間位置的配準才能進行后續(xù)的三維圖像重建。另一種方式是對組織樣品的表面進行顯微光學成像或者對組織樣品的淺表的幾百微米厚度進行光學成像，再去除(機械切削或激光消融)組織樣品淺表已成像的部分。因為來自表面以下組織樣品信號的干擾，需要借助光學層析成像技術。第三種方式是對組織樣品進行塑性包埋，進行微米厚度的薄切片，同時在切片過程的同時，對切下并貼覆在切削刀具背面的組織樣品切削條進行同步的成像。這種方式切下的組織樣品薄切片與剩余的組織樣品在空間上有一定的分離(取決于刀具的厚度)，但因為對塑性包埋的組織樣品進行薄切片一般使用透明的金剛石刀，使得金剛石刀下方剩余的樣品仍會透過金剛石刀而對光學成像結果造成影響，在圖像中疊加上干擾背景。
發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題是提出一種通過機械切削方式和顯微光學成像實現組織樣品斷層成像裝置。為解決上述技術問題，本發(fā)明首先提出了一種組織樣品高分辨率斷層顯微成像裝置，包括組織樣品切片模塊和光學顯微成像系統(tǒng)；所述組織樣品切片模塊包括三維電控移動平臺，樣品槽和切削刀具，所述樣品槽安裝在所述三維電控移動平臺上，包埋的組織樣品固定于所述樣品槽中，所述切削刀具固定安裝在所述樣品槽上方，所述切削刀具的切削面與所述組織樣品上表面成鈍角相交，所述光學顯微成像系統(tǒng)與所述切削刀具相對位置固定，且聚焦于所述切削刀具頭；所述切削刀具進行不透明處理。
優(yōu)選的，所述切削刀具的不透明處理包括，采用在激發(fā)或照明光波長范圍內不透明的材質制作刀具，或者，對刀具表面進行硬質光學鍍膜處理，通過鍍膜實現激發(fā)或照明光波長范圍內的低透過率或高反射率。所述刀具可以是可見光波段透明的硬質刀具，但對其進行光學鍍膜處理，使其在照明或激發(fā)光波段呈現低透過率。為了得到微米厚度的薄組織切片，使用硬質刀具，如金剛石刀具。由于金剛石的透明特性，可以在刀具表面鍍反射膜，使金剛石刀在成像系統(tǒng)所使用的照明光或激發(fā)光波長范圍內呈現很低的透過率，從而阻擋切削過程中，對刀具下方組織樣品的照明或激發(fā)，從而抑制下方組織樣品對刀面上方組織切片的干擾。所述刀具也可使用其他非透明材質的刀具，從而無需鍍膜處理。所述顯微光學成像模塊包括顯微物鏡和成像部分。顯微物鏡與刀具的相對位置固定，通過調節(jié)顯微物鏡使其光軸垂直于刀具表面，且焦點處于刀具表面。可以對切削過程中刀具表面的組織樣品進行清晰成像。采用落射照明方式，顯微物鏡同時起到聚焦照明光或激發(fā)光于刀具表面組織切片，以及收集組織切片信號光的作用。優(yōu)選的，所述光學顯微成像系統(tǒng)采用掃描成像方式，掃描成像方式通過物鏡將照明光或激發(fā)光聚焦于刀具表面的組織切片，結合光束掃描器件和光探測器實現組織切片的掃描成像。以電控三維移動平臺的位置反饋信號為同步信號，同步掃描成像與切片過程，從而保證各斷層圖像相對位置的一致性。所述顯微光學成像還可以采用的成像方式可以使用寬場照明結合陣列探測器進行成像。因為不透明刀具的使用，可以直接對樣品進行寬場照明(面照明或更為集中的線照明)，同時使用陣列探測器實現顯微圖像的捕捉。因為切片過程中待成像的切片處于運動狀態(tài)，需要通過電控三維移動平臺的位置反饋信號逐行觸發(fā)陣列探測器的曝光和讀出。本發(fā)明的組織樣品高分辨率斷層顯微成像裝置的成像方法，包括以下步驟:步驟1、所述三維電控移動平臺帶動所述樣品槽中的組織樣品相對于所述切削刀具水平運動，所述組織樣品被所述切削刀具切削形成微米厚度的組織樣品切片，在所述組織樣品切片短暫地貼覆于切削刀具上表面滑行的同時，所述光學顯微成像系統(tǒng)對短暫貼覆在所述切削刀具上的組織樣品切片進行顯微光學成像。步驟2、所述三維電控移動平臺帶動所述樣品槽中的組織樣品相對于所述切削刀具水平運動到設定水平極限值后，所述三維電控移動平臺帶動所述樣品槽中的組織樣品退回初始水平位置，然后在垂直方向上向上步進一個切片厚度，再重復步驟I。逐層切削成像即可獲得組織樣品的完整高分辨率斷層顯微光學圖像。有益效果:本發(fā)明將顯微光學成像系統(tǒng)與組織樣品切片系統(tǒng)結合，在切片的同時對貼覆在刀具表面的正在形成的組織切片進行同步的顯微光學成像，實現組織樣品的斷層顯微光學成像。在成像過程中，切片沿刀具表面滑動，滑動的速度與切削運動的速度相同。通過同步匹配圖像采集與切削運動的時序，可以獲得運動中的切片的高分辨率顯微圖像。同時，本發(fā)明采用不透明的刀具將切片與剩余的組織樣品從空間和光信號上分離開來。使所述光學顯微成像系統(tǒng)中的照明光或激發(fā)光，不能透過薄切片和刀具對刀具下方剩余組織樣品進行照明或激發(fā)，消除正在切削的組織切片以外的組織樣品對切片采樣的干擾，從而得到無背景干擾的斷層圖像。
下面結合附圖對本發(fā)明作進一步說明。圖1為機械切削實現組織樣品斷層顯微成像系統(tǒng)的示意圖。圖2為切削刀具與組織樣品切片示意圖。圖3為時序及圖像米集流程圖。圖4為實施例1的結構示意圖。
具體實施例方式圖1為機械切削實現組織樣品斷層顯微成像系統(tǒng)的示意圖。塑性包埋的組織樣品I放置在樣品槽2中。樣品槽2固定于電控三維移動平臺3上。組織樣品1，樣品槽2和電控三維移動平臺3固定為一個整體。可以隨電控三維移動平臺3進行整體的三維移動。刀具4始終處于固定位置。當電控三維移動平臺3沿方向5運動時，塑性包埋的組織樣品塊朝固定的刀具4做相對運動，從而實現切片過程。產生的微米厚度的組織樣品切片6就短暫地貼覆于刀具4的上表面并隨著切片運動沿刀具4的表面滑行。物鏡7相對于刀具4固定，其光軸與刀具4上表面垂直。物鏡7 —方面將激發(fā)光聚焦于組織樣品切片6上,另一方面將切片6的后向散射光或發(fā)射光(對熒光樣品)進行收集。如圖2所示，組織樣品塊沿方向5相對刀具4的運動切片過程可以得到薄組織切片6。對于塑性包埋硬度到達要求的組織樣品包埋塊1，組織切片6在靠近刀鋒的位置處會短暫地貼覆于刀具4的上表面，并隨著切片過程的進行沿方向12順著刀具4的上表面滑行一段距離后再逐漸脫離刀具4上表面。位置7附近樣品切片6相對于刀具4處于比較穩(wěn)定的貼覆和滑行的狀態(tài)，對位置7附近的切片區(qū)域進行反復成像，則隨著切片6的滑行運動，在切片過程完成的同時可以獲得切片6的完整圖像。在位置7附近，切片6相對于剩余的組織樣品I在空間上有一定的距離。另一方面，可以對刀具4的上表面10或下表面11進行光學鍍膜。光學鍍膜的特性在于其在成像系統(tǒng)所使用的照明光或激發(fā)光波長范圍內具有很低的透過率，沿光軸9方向傳播的照明光或激發(fā)光無法透過刀具4照明或激發(fā)刀具4下方的組織樣品I，使得位置7附近對組織切片6的成像不會受到組織樣品I其余部分的干擾，達到圖像的層析效果。也可通過選擇刀具4的材質為在照明或激發(fā)光波長范圍內具有低透過率的材料，實現切片6與組織樣品I的光學隔離。圖3所示為切片運動與圖像采集的時序。切片過程由電控移動平臺的兩個運動階段13組成:即樣品朝向刀具運動的進刀過程，和樣品原理刀具運動的退刀過程。在進刀過程實現切片。在電控移動平臺的運動過程中給以產生與平臺運動位置相關的觸發(fā)信號14。平臺每次運動指定的距離15之后開始給出位置觸發(fā)信號。之后根據成像像素分辨率的需要，每運動距離16即產生一次觸發(fā)信號。該觸發(fā)信號用于觸發(fā)圖像的逐行采集過程17。距離16即決定了切片圖像每行像素的尺寸。根據組織樣品的大小，組織切片的圖像由N行像素組成。N=L/S，其中L為切片的總長度，S為圖像中一行像素的實際大小，也即為距離16的大小。在逐行圖像采集的過程中對各行圖像數據進行組合重建和圖像數據的存儲過程18，從而得到一個組織切片的斷層顯微光學圖像。重復上述過程可以逐層得到組織樣品的斷層顯微光學圖像。
實施例1如圖4所示為對綠色熒光蛋白(GFP)標記的組織樣品的機械切削高分辨率斷層光學顯微成像系統(tǒng)。激光器19輸出波長為488nm的激光,經過柱透鏡20,將光束在柱透鏡20的焦距位置聚焦為線光源。經過筒鏡21和物鏡8，在組織切片6上形成一條激發(fā)線。該激發(fā)線位置激發(fā)的樣品熒光信號經物鏡8和筒鏡21成像于線陣列探測器24的光敏面上，得到切片6熒光圖像中的一行。隨切片運動的進行，切片6沿刀具4表面滑行，并被488nm的激發(fā)線逐行激發(fā)，電控平臺沿方向5運動過程中，每運動切片6上一行的距離即產生一個觸發(fā)信號，控制線陣探測器24的曝光和數據讀出，從而逐行得到切片6的完整熒光圖像。使用金剛石刀具4，為了實現滿意的斷層成像效果，在金剛石刀具下表面鍍488nm的高反射膜25。在光路中二向色分束鏡21用于實現488nm激發(fā)光和GFP熒光的分離，為了消除組織切片6、金剛石刀具4和高反射膜25三者反射的488nm激發(fā)光，在線陣探測器24之前放置488nm的截止片23。具體的，如果使用40x物鏡8，成像像素大小設為0.5 μ m，則可以采用像素尺寸為20 μ m的線陣相機為探測器24。電控移動平臺3配置光柵尺為位置傳感器，使其每運動
0.5 μ m產生一個觸發(fā)脈沖。塑性包埋的組織切片在方向5上的尺寸為10mm，則切片運動過程中，共產生10mm/0.5 μ m=20，000個觸發(fā)脈沖，將這些觸發(fā)脈沖作為線陣相機的曝光觸發(fā)信號，則在切片過程中共進行20，000次曝光，每次曝光得到組織切片6的一行圖像(行高為
0.5μπι)。20，000行圖像的合成即得到組織切片6的完整圖像。金剛石刀具4下表面的高反射膜，使488nm的激發(fā)光不能透過刀具4激發(fā)其下的組織樣品4，因而組織切片6的圖像不會受到組織樣品其余部分熒光信號的干擾，實現斷層效果的顯微成像效果。實施例2成像系統(tǒng)結構如實施例1，如圖4所示。其中刀具4使用不透敏的碳化鎢硬質刀具或黑色金剛石刀具。因為刀具材料自身的不透明性，可以無需在刀具表面進行光學鍍膜處理。成像過程的其他設置及步驟同實施例1，故不再贅述。
權利要求
1.一種組織樣品高分辨率斷層顯微成像裝置，其特征在于，包括組織樣品切片模塊和光學顯微成像系統(tǒng)；所述組織樣品切片模塊包括三維電控移動平臺，樣品槽和切削刀具，所述樣品槽安裝在所述三維電控移動平臺上，包埋的組織樣品固定于所述樣品槽中，所述切削刀具固定安裝在所述樣品槽上方，所述切削刀具的切削面與所述組織樣品上表面成鈍角相交，所述光學顯微成像系統(tǒng)與所述切削刀具相對位置固定，且聚焦于所述切削刀具頭；所述切削刀具進行不透明處理。
2.根據權利要求1所述的組織樣品高分辨率斷層顯微成像裝置，其特征在于，所述切削刀具的不透明處理包括，采用在激發(fā)或照明光波長范圍內不透明的材質制作刀具，或者，對刀具表面進行硬質光學鍍膜處理，通過鍍膜實現激發(fā)或照明光波長范圍內的低透過率或高反射率。
3.根據權利要求1或2所述的組織樣品高分辨率斷層顯微成像裝置，其特征在于，所述光學顯微成像系統(tǒng)采用掃描成像方式，或寬場照明或結合陣列探測器方式實現成像。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于機械切削、在對組織樣品進行薄切片的同時對薄切片進行顯微光學成像，實現組織樣品的高分辨率斷層顯微成像的裝置，該裝置包括組織樣品切片模塊和光學顯微成像系統(tǒng)，切削刀具進行不透明處理。本發(fā)明在切削過程切片和組織樣品的物理分離的同時進行斷層成像圖像采集，同時，切削刀具進行不透明處理使所述光學顯微成像系統(tǒng)中的照明光或激發(fā)光，不能透過薄切片和刀具對刀具下方剩余組織樣品進行照明或激發(fā)，消除正在切削的組織切片以外的組織樣品對切片采樣的干擾。可用于對組織樣品進行快速高分辨率的斷層顯微成像。
文檔編號G01N1/06GK103207150SQ20131009351
公開日2013年7月17日 申請日期2013年3月21日 優(yōu)先權日2013年3月21日
發(fā)明者曾紹群, 駱清銘, 龔輝, 呂曉華, 熊汗青 申請人:華中科技大學
專業(yè)數控銑床產品供應商
20年生產經驗，實力工廠，精工品質，質量有保障
