一種免疫磁珠及其在檢測玉米赤霉烯酮中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種免疫磁珠及其在檢測玉米赤霉烯酮中的應用，本發(fā)明免疫磁珠上偶聯(lián)有玉米赤霉烯酮單克隆抗體。本發(fā)明免疫磁珠在檢測玉米赤霉烯酮中具體的應用方法為：將免疫磁珠與待測樣品溶液、PBS緩沖液混勻，室溫振蕩反應，使抗體與抗原充分結合；再加入酶標單抗，室溫振蕩反應，使酶標單抗與抗原充分結合；沉淀免疫磁珠，去除液體，將免疫磁珠洗滌干凈加入AMPPD溶液混勻，檢測發(fā)光強度，根據發(fā)光強度判斷樣品中玉米赤霉烯酮的含量。本發(fā)明免疫磁珠檢測玉米赤霉烯酮靈敏高、特異高、線性寬、檢測時間短。
【專利說明】一種免疫磁珠及其在檢測玉米赤霉烯酮中的應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種免疫磁珠及其在檢測玉米赤霉烯酮中的應用。
【背景技術】
[0002]玉米赤霉烯酮(Zearalenone, ZEN),又稱F2毒素，是由禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)等鐮刀菌產生的一種雌激素類真菌毒素。其化學式為6 (10-羥基-6氧基-十一碳烯基)β -雷羧酸內酯，分子量為318，化學結構式如I所示。它廣泛存在于霉變的玉米、高粱、小麥、燕麥、大麥等谷物作物以及奶制品中。玉米赤霉烯酮可引起動物和人的雌激素過多綜合癥，還具有生殖發(fā)育毒性、免疫毒性、基因毒性和可疑致癌性等。飼料和食品生產中所用的谷物是ZEN產生的最好基質，其次為豆類及其制品，因此，ZEN給畜牧業(yè)帶來很大的經濟損失。
[0003]目前關于玉米赤霉烯酮的檢測存在以下缺點:1、價格昂貴，專業(yè)的技術人員進行檢測；2、檢測方法的線性窄、檢測時間長；3、成本高、靈敏度低、操作繁瑣；因此研究一種高靈敏、高特異、線性寬、檢測時間短的玉米赤烯酮檢測方法已迫在眉睫。
【發(fā)明內容】
[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種免疫磁珠。
[0005]本發(fā)明的另一目的在于提供該免疫磁珠在檢測玉米赤霉烯酮中的具體應用方法。
[0006]本發(fā)明所采取的技術方案是:
一種免疫磁珠，該免疫磁珠上偶聯(lián)有玉米赤霉烯酮單克隆抗體。
[0007]上述免疫磁珠在檢測玉米赤霉烯酮中的應用，其具體的應用方法包括以下步驟:
1)將免疫磁珠與待測樣品溶液、PBS緩沖液混勻，室溫振蕩反應，使免疫磁珠上的抗體與玉米赤霉烯酮抗原充分結合；
2)將上述反應液中加入堿性磷酸酶標記的玉米赤霉烯酮單克隆抗體，室溫振蕩反應，使酶標單抗與抗原充分結合；
3)將2)中的反應體系置于磁性分離器上，使免疫磁珠沉淀，去除液體，將免疫磁珠洗滌干凈，除凈殘液，加入ΑΜΡΗ)溶液混勻，室溫放置進行發(fā)光反應，檢測發(fā)光強度，根據發(fā)光強度判斷樣品中玉米赤霉烯酮的含量。
[0008]進一步的，上述步驟I)中免疫磁珠與樣品溶液、PBS緩沖液體積比為30:30:200。
[0009]進一步的,上述步驟I)中所述振蕩反應的時間為30min。
[0010]進一步的，上述步驟2)中所述堿性磷酸酶標記的玉米赤霉烯酮單克隆抗體與免疫磁珠的體積比為1:1。
[0011]進一步的，上述步驟2)中所述室溫振蕩反應時間為20min。
[0012]進一步的,上述步驟3)中所述發(fā)光反應時間為30min。
[0013]本發(fā)明的有益效果是:
I)本發(fā)明直接利用AMPro新型發(fā)光試劑，對玉米赤霉烯酮進行檢測，建立了一種新的化學發(fā)光磁酶免疫分析方法。
[0014]2)利用本發(fā)明免疫磁珠檢測玉米赤霉烯酮，靈敏高、特異高、線性寬、檢測時間短。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0015]圖1為不同免疫磁珠用量的檢測效果；
圖2為不同的免疫磁珠與抗原反應時間的檢測效果；
圖3為不同ALP-玉米赤霉烯酮單克隆抗體用量的檢測效果；
圖4為不同的ALP-玉米赤霉烯酮單克隆抗體與抗原反應時間的檢測效果；
圖5為不同發(fā)光反應時間的檢測效果；
圖6為本發(fā)明免疫磁珠檢測玉米赤霉烯酮的標準曲線。
【具體實施方式】
[0016]下面結合實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但并不局限于此。
[0017]實施例1免疫磁珠的制備方法
I)磁珠的醛基化:將10.0mg帶有氨基修飾的磁珠用戊二醛活化，使磁珠醛基化。
[0018]2)單抗活化磁珠:取上述醒基化的磁珠與0.50 mg玉米赤霉烯酮單克隆抗體,50mLVBS緩沖液混合，室溫振蕩2?4h，再將磁珠用PBS洗滌干凈，重懸于1%牛血清白蛋白溶液(W/V)進行封閉，4°C保存，即可。
[0019]上述抗體與磁珠反應后,溶液中還剩0.1lmg玉米赤霉烯酮單克隆抗體，由此可知磁珠結合玉米赤霉烯酮單克隆抗體的能力為0.39 mg/mg。
[0020]實施例2本發(fā)明免疫磁珠在檢測玉米赤霉烯酮中的應用
1)在取30μ L實施例1中制備的免疫磁珠和30 μ L待測樣品、200 μ L PBS緩沖液混勻，室溫振湯30min ；
2)將上述反應液中加入15μ L ALP (堿性磷酸酶)標記的玉米赤霉烯酮單克隆抗體，室溫震動20min ；
3)將反應后的免疫磁珠置于磁性分離器上沉淀2min，將去除液體，用洗滌液將免疫磁珠洗滌干凈，將殘液拍干，加10 μ L AMPPD溶液混勻室溫放置30min進行發(fā)光反應，檢測發(fā)光強度，根據發(fā)光強度判斷樣品是否含有玉米赤霉烯酮。
[0021]實施例3免疫磁珠的最佳用量
參照實施例2所述的方法對玉米赤霉烯酮標準樣品液(玉米赤霉烯酮濃度為lmg/L)進行檢測，免疫磁珠的用量分別設為0、5、10、15、30、40、60μ L，其他參數條件均與實施例2 —致。檢測結果顯示(如圖1所示)，當免疫磁珠的用量為15?40 μ L，相對發(fā)光強度較高，尤其是當免疫磁珠的用量為30 μ L時，檢測效果最佳，故免疫磁珠的最佳用量為30 μ L。
[0022]實施例4免疫磁珠與抗原的最佳反應時間
參照實施例2所述的方法對玉米赤霉烯酮標準樣品液(玉米赤霉烯酮濃度為lmg/L)進行檢測，免疫磁珠與抗原的反應時間分別設為2、5、10、20、30、60min，其他參數條件均與實施例2 —致。檢測結果顯示(如圖2所示)，當反應時間為20?60min時，相對發(fā)光強度較高，尤其是當免疫磁珠與抗原的反應30min時，檢測效果最佳，故免疫磁珠與抗原的最佳反應時間為30min。
[0023]實施例5 ALP-玉米赤霉烯酮單克隆抗體的最佳用量
參照實施例2所述的方法對玉米赤霉烯酮標準樣品液(玉米赤霉烯酮濃度為lmg/L)進行檢測，ALP-玉米赤霉烯酮單克隆抗體的用量分別設為0、5、10、15、20、30、40yL，其他參數條件均與實施例2 —致。檢測結果顯示(如圖3所示)，當ALP-玉米赤霉烯酮單克隆抗體的用量為15?40 μ L，相對發(fā)光強度較高，尤其是用量為30?40 μ L時，檢測效果最佳，但15?30 μ L單抗的檢測效果與30?40 μ L的效果相差較小，故綜合檢測效果和成本問題，選用15 μ L作為ALP-玉米赤霉烯酮單克隆抗體的最佳用量。
[0024]實施例6 ALP-玉米赤霉烯酮單克隆抗體與抗原的最佳反應時間
參照實施例2所述的方法對玉米赤霉烯酮標準樣品液(玉米赤霉烯酮濃度為lmg/L)進行檢測，ALP-玉米赤霉烯酮單克隆抗體與抗原的反應時間分別設為2、5、10、20、30、60min，其他參數條件均與實施例2 —致。檢測結果顯示(如圖4所示)，當反應時間為20?60min時，相對發(fā)光強度較高，尤其是當ALP-玉米赤霉烯酮單克隆抗體與抗原的反應20min和60min時，檢測效果最佳，但考慮到時間成本，故ALP-玉米赤霉烯酮單克隆抗體與抗原的最佳反應時間為20min。
[0025]實施例7最佳發(fā)光反應時間
參照實施例2所述的方法對玉米赤霉烯酮標準樣品液(玉米赤霉烯酮濃度為lmg/L)進行檢測，發(fā)光反應時間分別設為0、l、3、5、10、20、30、40、50、60、65min，其他參數條件均與實施例2 —致。檢測結果顯示(如圖5所示)，當反應時間為30?65min時，相對發(fā)光強度最佳，但考慮到時間成本，故選用30min作為最佳發(fā)光反應時間。
[0026]實施例8本發(fā)明檢測方法的靈敏度
將玉米赤霉烯酮標準品稀釋為 0.lng/kg、0.5ng/kg、lng/kg、1.5ng/kg、2ng/kg、3ng/kg、4ng/kg、5ng/kg共8個不同濃度,參照實施例2的方法檢測發(fā)光強度,制作標準曲線。
[0027]標準曲線如圖6所示，標準曲線方程為Y=0.0037X+4.3X 103，R2=0.982，線性范圍為0.20ng/kg?4ng/kg ;故本發(fā)明免疫磁珠檢測玉米赤霉烯酮的檢測限(靈敏度)達
0.20ng/kg。
【權利要求】
1.一種免疫磁珠，其特征在于:該免疫磁珠上偶聯(lián)有玉米赤霉烯酮單克隆抗體。
2.權利要求1所述免疫磁珠在檢測玉米赤霉烯酮中的應用。
3.根據權利要求1所述的所述的應用，其特征在于:具體的應用方法包括以下步驟: 1)將權利要求1所述的免疫磁珠與待測樣品溶液、PBS緩沖液混勻，室溫振蕩反應，使免疫磁珠上的抗體與玉米赤霉烯酮抗原充分結合； 2)將上述反應液中加入堿性磷酸酶標記的玉米赤霉烯酮單克隆抗體，室溫振蕩反應，使酶標單抗與抗原充分結合； 3)將2)中的反應體系置于磁性分離器上，使免疫磁珠沉淀，去除液體，將免疫磁珠洗滌干凈，除凈殘液，加入AMPPD溶液混勻，室溫放置進行發(fā)光反應，檢測發(fā)光強度，根據發(fā)光強度判斷樣品中玉米赤霉烯酮的含量。
4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于:步驟I)中免疫磁珠與樣品溶液、PBS緩沖液體積比為30:30:200o
5.根據權利要求3所述的應用，其特征在于:步驟I)中所述振蕩反應的時間為30min。
6.根據權利要求3所述的應用，其特征在于:步驟2)中所述堿性磷酸酶標記的玉米赤霉烯酮單克隆抗體與免疫磁珠的體積比為1:1。
7.根據權利要求3所述的應用，其特征在于:步驟2)中所述室溫振蕩反應時間為20mino
8.根據權利要求3所述的應用，其特征在于:步驟3)中所述發(fā)光反應時間為30min。
【文檔編號】G01N33/577GK104198711SQ201410422038
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年8月25日 優(yōu)先權日:2014年8月25日
【發(fā)明者】羅勝軍 申請人:廣東省農業(yè)科學院動物衛(wèi)生研究所
專業(yè)數控銑床產品供應商
20年生產經驗，實力工廠，精工品質，質量有保障
