一種丹紅注射液水沉過程在線檢測方法
【專利摘要】本發明提供一種丹紅注射液水沉過程在線檢測方法，通過設計近紅外在線檢測裝置，在線采集丹紅注射液水沉液的近紅外透射光譜及水沉液樣本，采用高效液相色譜法測得水沉液樣本中各質控指標信息，選擇近紅外光譜建模波段，采用偏最小二乘回歸法建立各質控指標模型，并采用各模型評價指標考察模型性能，將已建模型用于水沉過程在線檢測。本發明將近紅外在線分析技術引入到丹紅注射液的水沉過程各化學指標成分的測定，實現對丹參素、原兒茶醛、迷迭香酸和丹酚酸B等各質控指標的實時監測，有利于提高丹紅注射液水沉過程的質量控制水平，充分保證產品質量穩定、可靠。
【專利說明】一種丹紅注射液水沉過程在線檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于近紅外在線檢測領域，具體涉及一種丹紅注射液水沉過程在線檢測方法。
【背景技術】
[0002]丹紅注射液是由中藥丹參、紅花按科學配方提取的復方制劑，能夠明顯緩解心絞痛癥狀，改善心肌缺血情況。中藥丹參的主要功效是紅血化瘀，理氣止痛，丹參中水溶性酚酸類成分，如丹參素、原兒茶醛、迷迭香酸和丹酚酸B等，是其主要的活性成分；而紅花具有活血通絡、祛瘀止痛之功效，有效成分主要集中在水溶性紅花黃色素，如羥基紅花黃色素A等，二者均為治療胸痹的常用藥。水沉過程是丹紅注射液生產過程的常規操作，其目的是讓不溶于水的化合物在水中析出，降溫冷卻形成硬質顆粒，通過顆粒自由沉降以去除經醇沉精制后丹紅浸膏中的以丹參酮II A為主的脂溶性雜質。
[0003]目前，水沉工藝的質量控制主要依靠人工經驗來判斷，且基本不考慮生產過程中有效成分濃度變化情況，如在水沉過程中，少部分脂溶性雜質溶出的同時，也伴隨小部分有效成分的包裹損失，工況波動會導致酚酸類物質降解。人工操作的生產模式缺乏對體系中有效成分實時監測的手段，很容易造成不同批次水沉液質量的不穩定，導致產品批次不均，影響產品最終的質量和療效，對原藥材、能源、時間造成了浪費。故研究發展丹紅注射液水沉過程中關鍵質控指標的在線檢測方法，有助于解決丹紅注射液水沉過程中關鍵控制指標的質量控制問題，對于中藥工業技術進步和產品質量升級具有重大現實意義。
[0004]近紅外光譜位于中紅外和可見光范圍之間，是由美國材料與試驗協會(ASTM)定義為在78(T2526 nm范圍內的電磁波，近紅外的光譜信息來源于含氫基團(C_H、0_H、N-H)分子內部振動的倍頻與合頻吸收，因此其適用于絕大部分物質的快速檢測。不需樣品預處理就可在復雜背景下進行多組分的快速無損分析，被稱為分析的“巨人”，目前已逐漸受到中藥制藥領域的認可，在原藥材快速檢測、產品質量控制和生產過程監控中得到廣泛應用。從近年來研究進展情況看來，近紅外光譜分析技術是最有希望在中藥生產過程實現在線檢測及質量控制的過程分析技術之一。在中藥質量控制及生產應用領域，近紅外光譜作為一種在線檢測技術應用于指標成分的測定已有相關專利文獻，如專利(CN02137234.9，CN200710022408.9,CN200810050095.2 和 CN200410090617.3)等。但是這些專利均為離線采集近紅外光譜，也并沒有將所建模型真正應用于在線分析。
[0005]目前近紅外光譜檢測中常用的模型建立方法為偏最小二乘(PLS)。偏最小二乘法是一種數學優化技術，它的組成類似于多元線性回歸分析+典型相關分析+主成分分析，通過最小化誤差的平方和找到一組數據的最佳函數匹配，即用最簡的方法求得一些絕對不可知的真值，而令誤差平方之和為最小，現已成為近紅外光譜定量分析中備受推崇的建模方法。
【發明內容】
[0006]本發明的目的在于提供一種丹紅注射液水沉過程的在線檢測方法。該方法的檢測目標為實現丹紅注射液水沉過程中各質控指標的在線定量分析，為丹紅注射液水沉過程質量控制提供方法。
[0007]本發明是通過以下技術方案實現的:
1.設計近紅外在線檢測裝置:
近紅外在線檢測裝置由以下部分組成:水沉罐(1)，變頻泵(2)，雙聯過濾器(3)，第一流量調節閥(4)，第二流量調節閥(4’)，流通池(5)，近紅外光纖(6)，近紅外光譜儀(7)，取樣閥(8 )，循環管路(9 )，水沉液循環出口( 10 )和水沉液循環入口( 11)，變頻泵(2 )，雙聯過濾器(3)，第一流量調節閥(4)，第二流量調節閥(4’)、流通池(5)、水沉液循環出口(10)和水沉液循環入口(11)以串聯方式連接在循環管路(9)上，流通池(5)通過近紅外光纖(6)連接近紅外光譜儀(7 )，取樣閥(8 )靠近第二流量調節閥(4 ’)，以支路形式連接在循環管路
(9)上。[0008]水沉開始后，打開第一流量調節閥(4)和第二流量調節閥(4’)，連通循環管路9，水沉液通過變頻泵(2 )進入雙聯過濾器(3 )，濾除雜質后到達流通池(5 )，近紅外光譜儀(7 )在線采集流通池內水沉液的近紅外光譜，取樣時，打開取樣閥(8)，收集水沉樣液用于液相分析，取樣結束后，關閉取樣閥(8)，流通池5及循環管路9中水沉液流速控制在120 mL/min，雙聯過濾器3用于濾除水沉液中的大部分固體雜質顆粒，過濾精度為100微米。
[0009]2.近紅外光譜和水沉液樣本在線采集
水沉液樣品采集方法為:將回收乙醇后的丹紅浸膏倒入已清潔合格的水沉罐I內，開始攪拌，保持機械攪拌轉速為300轉/分鐘，流通池內水沉液流速控制在120 mL/min,加注射用水至650L后(設定加入七個不同流速的注射用水(第一階段200L/h加20分鐘，第二階段400L/h加20分鐘，第三階段600L/h加20分鐘，第四階段1000L/h加20分鐘，第五階段1200L/h加20分鐘，第六階段1500L/h加15分鐘，第七階段1800L/h加10分鐘，直至加注射用水至650L)，啟動變頻泵2，將變頻泵效率調至最大，循環后持續lmin，待整個循環管路9內的水沉液形成正常循環后，將變頻泵頻率穩定至20Hz，開始采集光譜和收集樣本，每隔
2min通過取樣閥(8)采集水沉液樣本，直至水沉過程結束。
[0010]采用透射法采集近紅外光譜，光譜范圍為4500 cm_卜12000 cnT1，掃描次數為32次，分辨率為8 cnT1，以空氣為參比。每隔30 s在線采集通過流通池的水沉液近紅外光譜；每隔2 min從取樣閥采集水沉液樣本。采集水沉液樣本的同時采集近紅外光譜。
[0011]3.各質控指標測定
水沉液樣本的各質控指標包括丹參素、原兒茶醛、迷迭香酸和丹酚酸B，采用高效液相色譜法(HPLC)測定。
[0012]水沉液樣本于1500 r/min高速離心機中離心10分鐘,用0.45 Mm微孔濾膜濾過，
取續濾液用于高效液相分析。
[0013]HPLC 色譜條件:Agilent Eclipse-C18 分析柱(250X4.6 mm, 5 μ m);流動相:A為甲醇，B為0.5%甲酸水溶液(v/v)，梯度洗脫程序為:0~20 min, 9% — 39%A ;20~36 min,39%—47%A ;36 ~39 min, 47% ^ 90% A ; 39 ~45 min, 90% A。檢測波長:0~13 min, 280 nm ；13~21 min, 403 nm ;21~45 min, 280 nm ;流速 1.0 mL/min ;柱溫 35 °C ;進樣量 5 μ L。
[0014]4.選擇近紅外光譜建模波段和預處理方法；分別采用一階導數法、二階導數法(Savitzky-Golay平滑)，矢量歸一化和減去一條直線法等光譜預處理方法，用于消除基線漂移、噪音及光程變化或樣本稀釋等情況對近紅外光譜產生的影響，最終確定采用一階導數處理，所得到的模型最為理想。丹紅水沉過程中的主要背景為水，而“水峰”的吸收在4500~5445 6500^7000 cm—1波段；又因為9500^12000 cm—1波段光譜信息較少，因此在建模這些波段需排除。最后，通過光譜和質控指標的相關系數確定建模波段為:5446.2~6101.9 cm'7498.2~9403.6cm^0
[0015]5.使用多元校正算法建立各質控指標模型，并采用各模型評價指標考察模型性倉泛;
多元校正方法為偏最小二乘法。模型評價指標包括:相關系數(R2)、校正集均方根誤差(RMSECV)、相對分析誤差(RPD)、校正集和驗證集預測誤差均方根(RMSEC、RMSEP)、校正集和驗證集相對偏差(RSEC和RSEP)，當R2值接近于1，RPD值大于等于3，RMSEC和RMSEP值接近于0，RSEC和RSEP小于20%時，說明所見模型具有較好的穩定性和預測精度，可以用于丹紅注射液水沉過程的在線檢測。
[0016]6.在線分析分析水沉過程中各質控指標變化 在線采集丹紅注射液水沉液的近紅外光譜圖，將光譜數據輸入到校正模型中，經過計算即可實時得知水沉液中各質控指標的信息。
[0017]本發明將近紅外在線分析技術引入到丹紅注射液的水沉過程，實現對各質控指標(丹參素、原兒茶醛、迷迭香酸和丹酚酸B)的實時監測，有利于提高丹紅注射液水沉過程的質量控制水平，充分保證產品質量穩定、可靠。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0018]圖1是水沉過程近紅外在線檢測系統簡圖。
[0019]圖2是水沉過程中丹參素濃度的實際變化趨勢圖。
[0020]圖3是水沉過程中原兒茶醛濃度的實際變化趨勢圖。
[0021]圖4是水沉過程中迷迭香酸濃度的實際變化趨勢圖。
[0022]圖5是水沉過程中丹酚酸B濃度的實際變化趨勢圖。
[0023]圖6是丹紅注射液水沉液原始近紅外光譜圖。
[0024]圖7是近紅外光譜一階微分光譜和丹酚酸B的相關系數圖。
[0025]圖8是丹參素模型的校正集樣品預測值和實測值相關關系圖。
[0026]圖9是原兒茶醛模型的校正集樣品預測值和實測值相關關系圖。
[0027]圖10是迷迭香酸模型的校正集樣品預測值和實測值相關關系圖。
[0028]圖11是丹酚酸B模型的校正集樣品預測值和實測值相關關系圖。
[0029]圖12是水沉過程丹參素近紅外預測值與實際測定值的趨勢對照圖。
[0030]圖13是水沉過程原兒茶醛近紅外預測值與實際測定值的趨勢對照圖。
[0031]圖14是水沉過程迷迭香酸近紅外預測值與實際測定值的趨勢對照圖。
[0032]圖15是水沉過程丹酚酸B近紅外預測值與實際測定值的趨勢對照圖。
【具體實施方式】
[0033]下面結合附圖和實施例做進一步的說明。[0034]1.設計近紅外在線檢測裝置
參見圖1，近紅外在線檢測裝置由以下部分組成:水沉罐(I)、變頻泵(2)、雙聯過濾器(3)、第一流量調節閥(4)、第二流量調節閥(4’)、流通池(5)、近紅外光纖(6)、近紅外光譜儀(7)、取樣閥(8)、循環管路(9)、水沉液循環出口(10)和水沉液循環入口(11，變頻泵
(2)、雙聯過濾器(3)、第一流量調節閥(4)、第二流量調節閥(4’)、流通池(5)、水沉液循環出口( 10 )和水沉液循環入口( 11)以串聯方式連接在循環管路(9 )上，流通池(5 )通過近紅外光纖(6)連接近紅外光譜儀(7)，取樣閥(8)靠近第二流量調節閥(4’)，以支路形式連接在循環管路(9)上。
[0035]水沉開始后，打開第一流量調節閥(4)和第二流量調節閥(4’)，連通循環管路9，水沉液通過變頻泵(2 )進入雙聯過濾器(3 )，濾除雜質后到達流通池(5 )，近紅外光譜儀(7 )在線采集流通池內水沉液的近紅外光譜，同時，打開取樣閥(8)，收集水沉樣液用于液相分析，取樣結束后，關閉取樣閥(8)，流通池5及循環管路9中水沉液流速控制在120 mL/min。雙聯過濾器3用于濾除水沉液中的大部分固體雜質顆粒，過濾精度為100微米。
[0036]2.近紅外光譜和水沉液樣本的在線采集
將回收乙醇后的丹紅浸膏倒入已清潔合格的水沉罐I內，開始攪拌,保持機械攪拌轉速為300轉/分鐘，流通池5內水沉液流速控制在120 mL/min，設定加入七個不同流速的注射用水(第一階段200L/h加20分鐘，第二階段400L/h加20分鐘，第三階段600L/h加20分鐘，第四階段1000L/h加20分鐘，第五階段1200L/h加20分鐘，第六階段1500L/h加15分鐘，第七階段1800L/h加10分鐘)，直至加注射用水至650L后，啟動變頻泵2，將變頻器效率調至最大，待整個管路循環后持續lmin，隨后緩慢降低頻率至20Hz，開始采集光譜和收集樣品，近紅外在線檢測系統參見附圖1。
[0037]采用透射法采集近紅外光譜，光譜范圍為4500 cm_卜12000 cnT1，掃描次數為32次，分辨率為8 cnT1，以空氣為參比。每隔30 s在線采集通過流通池的水沉液近紅外光譜；每隔2 min從取樣口采集水沉液樣本。采集水沉液樣本的同時采集近紅外光譜。所取樣本分別用于丹參素、原兒茶醛、迷迭香酸和丹酚酸B的測定。共收集5批水沉過程中的水沉液樣品，其中I批為預實驗，3批作為校正集用于建立模型，I批為預測集，驗證模型穩定性。
[0038]3.指標成分濃度的測定
采用高效液相色譜法測定水沉液樣本中丹參素、原兒茶醛、迷迭香酸和丹酚酸B的濃度。
[0039]HPLC 色譜條件:Agilent Eclipse-C18 分析柱(250X4.6 mm, 5 μ m);流動相:A為甲醇，B為0.5%甲酸水溶液(v/v)，梯度洗脫程序為:0~20 min, 9% — 39%A ;20~36 min,39%—47%A ;36 ~39 min, 47% ^ 90% A ; 39 ~45 min, 90% A。檢測波長:0~13 min, 280 nm ；13~21 min, 403 nm ;21~45 min, 280 nm ;流速 1.0 mL/min ;柱溫 35 °C ;進樣量 5 μ L。
[0040]水沉液樣本于1500 r/min高速離心機中離心10分鐘，再稀釋成不同倍數，用0.45Mffl微孔濾膜濾過，取續濾液用于液相分析。水沉過程中各質控指標變化趨勢參見圖2~5。
[0041] 從圖2飛中可以看出，原兒茶醛和迷迭香酸的濃度變化趨勢吻合較好，說明批次間差異較小，工藝流程對這兩個指標的影響較小。而丹參素和丹酚酸B，其在第一批水沉過程的濃度趨勢高于其余四批。鑒于丹紅注射液本身有效成分的不穩定，最好保證連續性生產，以利于保證產品最終的質量。[0042]4.選擇近紅外光譜預處理方法和建模波段
分別采用一階導數法、二階導數法(Savitzky-Golay平滑),矢量歸一化和減去一條直線法等光譜預處理方法，用于消除基線漂移、噪音及光程變化或樣本稀釋等情況對近紅外光譜產生的影響，最終確定采用一階導數處理，所得到的模型最為理想。
[0043]分別采用一階導數法、二階導數法(Savitzky-Golay平滑),矢量歸一化和減去一條直線法等光譜預處理方法，用于消除基線漂移、噪音及光程變化或樣本稀釋等情況對近紅外光譜產生的影響。根據表1結果，采用一階導數處理，所得到的模型的RMSECV、R2、以及因子數都較為理想。
【權利要求】
1.一種丹紅注射液水沉過程在線檢測方法，其特征在于，通過以下步驟實現:(1)設計近紅外在線檢測裝置，由水沉罐(1)、變頻泵(2)、雙聯過濾器(3)、第一流量調節閥(4)、第二流量調節閥(4’)、流通池(5)、近紅外光纖(6)、近紅外光譜儀(7)、取樣閥(8)、循環管路(9 )、水沉液循環出口( 10 )和水沉液循環入口( 11)構成，變頻泵(2 )、雙聯過濾器(3 )、第一流量調節閥(4)、第二流量調節閥(4’)、流通池(5)、水沉液循環出口(10)和水沉液循環入口( 11)以串聯方式連接在循環管路(9 )上，流通池(5 )通過近紅外光纖(6 )連接近紅外光譜儀(7 )，取樣閥(8 )靠近第二流量調節閥(4 ’)，并以支路形式連接在循環管路(9 )上； (2)近紅外光譜和水沉液樣本在線采集 水沉液樣品采集:將回收乙醇后的丹紅浸膏倒入已清潔合格的水沉罐(I)內，開始攪拌，保持機械攪拌轉速為300轉/分鐘，流通池(5)內水沉液流速控制在120 mL/min，加注射用水至650L后，啟動變頻泵(2)，將變頻效率調至最大，循環后持續lmin，待整個循環管路(9)內的水沉液形成正常循環后，將變頻頻率穩定至20Hz，開始收集樣本，每隔2 min通過取樣閥(8)采集水沉液樣本，直至水沉過程結束； 近紅外光譜采集:光譜范圍為4500 cm_卜12000 cnT1，掃描次數為32次，分辨率為8cm-1,以空氣為參比，每隔30 s在線采集通過流通池(5)的水沉液近紅外光譜； (3)各質控指標測定 水沉液樣本的各質控指標為丹參素、原兒茶醛、迷迭香酸和丹酚酸B，水沉液樣本于1500 r/min高速離心機中離心10分鐘，0.45 Mm微孔濾膜濾過，取續濾液用于高效液相色譜法測定， 色譜條件:Agilent Eclipse-C18分析柱，250X4.6 mm, 5 μ m ;流動相:A為甲醇,B為0.5% 甲酸水溶液(v/v)，梯度洗脫程序為:0~20 min, 9% — 39%A ;20~36 min, 39% — 47%A ；36~39 min, 47% ^ 90% A ;39~45 min, 90% A，檢測波長:0~13 min, 280 nm ;13~21 min, 403nm ;21 ~45 min, 280 nm ;流速 1.0 mL/min ;柱溫 35 °C ;進樣量 5 μ L ； (4)選擇近紅外光譜建模波段和預處理方法 采用一階導數處理，建模波段為:5446.2~6101.9 cm'7498.2~9403.6cm_1 ； (5)使用多元校正算法建立各質控指標模型，并采用各模型評價指標考察模型性能； 多元校正方法為偏最小二乘法，模型評價指標為:相關系數(R2)、校正集均方根誤差、相對分析誤差、校正集和驗證集預測誤差均方根、校正集和驗證集相對偏差，當R2值接近于1，相對分析誤差值大于等于3，校正集和驗證集預測誤差均方根值接近于0，校正集和驗證集相對偏差小于20%時，說明所見模型具有較好的穩定性和預測精度，用于丹紅注射液水沉過程的在線檢測； (6)在線分析水沉過程中各質控指標變化 在線采集丹紅注射液水沉液的近紅外光譜圖，將光譜數據輸入到校正模型中，經過計算即可實時得知水沉液中各質控指標的信息。
2.根據權利要求1所述的一種丹紅注射液水沉過程在線檢測方法，其特征在于，水沉開始后，打開第一流量調節閥(4)和第二流量調節閥(4’)，連通循環管路(9)，水沉液通過變頻泵(2 )進入雙聯過濾器(3 )，濾除雜質后到達流通池(5 )，近紅外光譜儀(7 )在線采集流通池內水沉液的近紅外光譜，取樣時，打開取樣閥(8)，收集水沉樣液用于液相分析，取樣結束后，關閉取樣閥(8)，流通池(5)及循環管路(9)中水沉液流速控制在120 mL/min，雙聯過濾器(3)用于濾除水沉液中的大部分固體雜質顆粒，過濾精度為100微米。
3.根據權利要求1所述的一種丹紅注射液水沉過程在線檢測方法，其特征在于，步驟(2)加注射用水，設定加入七個不同流速的注射用水，第一階段200L/h加20分鐘，第二階段400L/h加20分鐘，第三階段600L/h加20分鐘，第四階段1000L/h加20分鐘，第五階段1200L/h加20分鐘，第六階段1500L/h加15分鐘，第七階段1800L/h加10分鐘，直至加注射用水至650L。
4.根據權利要求1所述的一種丹紅注射液水沉過程在線檢測方法，其特征在于，步驟(2)采集水沉液樣本的同時采集近紅 外光譜。
【文檔編號】G01N21/3577GK103913434SQ201410135324
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2014年4月4日 優先權日:2014年4月4日
【發明者】吳永江, 金葉, 劉雪松, 蘇曉濤, 劉象銀, 陸世海, 晁現民, 王振華 申請人:浙江大學, 山東丹紅制藥有限公司
專業數控銑床產品供應商
20年生產經驗，實力工廠，精工品質，質量有保障
