一種河豚毒素柱前衍生-高效液相熒光檢測方法及基于該方法的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種河豚毒素柱前衍生-高效液相熒光檢測方法，包括以下步驟：(1)制備待測品的樣品溶液及河豚毒素標準品溶液；(2)取樣品溶液0.4mL，加入0.2mLpH維持液，將溶液pH控制在11.6~11.9區間，然后加入0.1mL衍生試劑1和0.1mL衍生試劑2，混勻，水浴加熱20min，冷卻至室溫，加入0.1mL終止液，使溶液pH呈中性，而后用超純水定容；取樣品溶液，加入河豚毒素標準品溶液混勻，然后進行本步驟操作進行熒光衍生；(3)采用配備熒光檢測器的液相色譜儀對步驟(2)熒光衍生后的樣品溶液和河豚毒素標準品溶液進行分析，對樣品溶液中的河豚毒素進行定性和定量。本發明同時公開適用于該方法的試劑盒。該方法用于定性、定量檢測水產品中河豚毒素，結果可靠、檢測限低。
【專利說明】一種河豚毒素柱前衍生-高效液相熒光檢測方法及基于該方法的試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明涉及河豚毒素檢測方法及試劑盒，具體涉及一種河豚毒素柱前衍生-高效液相熒光檢測方法及基于該方法的試劑盒。
【背景技術】
[0002]河豚毒素(Tetrodotoxin,TTX)是日本學者 Dr.Yoshizumi Tahara 于 1909 年首次從河豚肝臟中提取并發現的一種氨基全喹啉化合物神經毒素，分子量約為319.3Da。普遍存在于河豚、織紋螺、蟹、海星、蝦虎魚等海生生物，蠑螈、蛙、蛇等陸棲動物，甲藻、紅藻等藻類以及細菌等生物中。TTX毒性極強，I mg等于4500MU，對哺乳類靜脈注射半致死劑量LD50為2?10 μ g/kg，皮下注射LD50為10?14 μ g/kg，對人類的最低急性中毒劑量約為
0.2mg，致死攝食劑量0.6?2mg/50kg體重。由于其熱穩定性高，普通烹飪手段如在100°C加熱難以破壞，常常引發吃食河豚、織紋螺等中毒。小鼠生物法、酶聯免疫法(ELISA)、液質聯用法(LC-MS)和高效液相柱后衍生熒光檢測法(HPLC-FLD)等為河豚毒素檢測常用方法，但由于均存在一定的缺陷，如小鼠法不能專一地檢出TTX，ELISA容易出現假陽性，LC-MS檢測成本昂貴，柱后衍生HPLC-FLD需要配備柱后衍生裝置和昂貴聯用質譜儀確證。熒光檢測技術具有背景干擾低、靈敏度高、精確、成本相對低廉的特點，因此開發一種新型熒光檢測手段，將有利于促進河豚毒素的檢測工作。
【發明內容】
[0003]本發明的目的之一是提供一種河豚毒素柱前衍生-高效液相熒光檢測方法，該方法用于定性、定量檢測水產品中河豚毒素(TTX)，結果可靠、檢測限低。
[0004]本發明的目的之二是提供基于上述河豚毒素柱前衍生-高效液相熒光檢測方法的試劑盒。
[0005]本發明的第一個目的是通過以下技術方案來實現:一種河豚毒素柱前衍生-高效液相熒光檢測方法，包括以下步驟:
(1)制備待測品的樣品溶液及河豚毒素標準品溶液；
(2)熒光衍生:取樣品溶液0.4m L，加入0.2m L pH維持液，將溶液pH控制在11.6?11.9區間，然后加入0.1mL衍生試劑I和0.1mL衍生試劑2，混勻，水浴加熱20min，冷卻至室溫，加入0.1mL終止液,使溶液pH呈中性,而后用超純水定容；取樣品溶液，加入河豚毒素標準品溶液混勻，然后進行本步驟操作進行熒光衍生；
(3)定性和定量檢測:采用配備熒光檢測器的液相色譜儀對步驟(2)熒光衍生后的樣品溶液和河豚毒素標準品溶液進行分析，對樣品溶液中的河豚毒素進行定性和定量。
[0006]本發明所述步驟(I)中待測品的樣品溶液的提取和純化采用已有技術即可，例如，將待測品均質，用乙酸溶液在水浴超聲提取后，所得提取液上河豚毒素親和層析柱或WCX固體萃取柱等洗脫，獲得的洗脫液經水浴氮氣吹干后再制成樣品溶液。[0007]本發明所述步驟(1)河豚毒素標準品溶液中河豚毒素濃度為2(T10000ng/ml。
[0008]本發明所述步驟(2)中pH維持液為2mol/L碳酸鈉溶液。
[0009]本發明所述步驟⑵中衍生試劑I的pH約為12，包括a液、b液和c液，a液、b液和c液之間的體積比為5: 2: 3，具體地，所述a液為次溴酸鈉貯備液:0.67g溴酸鈉、3.0g溴化鈉，用蒸懼水溶解并定容至IOmL ;所述b液為5mol/L鹽酸；所述c液為4.81mol/L氫氧化鈉。
[0010]本發明所述步驟⑵中衍生試劑2為20%尿素(w/v)。
[0011]本發明所述步驟⑵中終止液為15%磷酸(w/v)。
[0012]本發明所述步驟(3)中高效液相色譜檢測條件為:色譜柱:反相C-18柱；流動相:50 mmoL/L磷酸二氫銨；檢測信號:激發波長233 nm,發射波長370 nm。
[0013]本發明的第二個目的通過以下技術措施來實現:基于上述河豚毒素柱前衍生-高效液相熒光檢測方法用試劑盒，包括以下試劑:
(1)衍生試劑1:pH約為12，包括a液、b液和c液，a液、b液和c液之間的體積比為5:2: 3，所述a液為次溴酸鈉貯備液:0.67g溴酸鈉、3.0 g溴化鈉，用蒸餾水溶解并定容至IOmL ;所述b液為5mol/L鹽酸溶液，IOmL ;所述c液為4.81mol/L氫氧化鈉溶液，IOmL ；
(2)衍生試劑2:20%尿素溶液(w/v)。 [0014](3) pH維持液:2mol/L碳酸鈉溶液；
(4)河豚毒素標準品貯備液:100μ g/mL河豚毒素溶液，內含lmmol/L的檸檬酸鹽，pH=5.0 ；
(5)終止液:15%磷酸溶液(w/v)。
[0015]本發明與現有技術相比具有以下優點:
(I)本發明首次使用次溴酸鈉和尿素與河豚毒素反應，將其定量地轉化為一種特定的熒光物質，與傳統的使用高濃度堿堿解不同，反應在弱堿性條件下進行，反應條件比較溫和。使用高效液相色譜檢測時，采用柱前衍生方式，不需要配備柱后衍生裝置，檢測成本低。
[0016](2)本發明與已有的將河豚毒素與熒光物質(如鄰苯二醛)相連接的柱前熒光衍生方法不同，不需要具有熒光信號的試劑參與反應，同時不易受其他物質的干擾，具有很強的特異性，可使用高效液相色譜檢測。
[0017](3)本發明將河豚毒素衍生后，檢測信號為激發波長233nm、發射波長為370nm。
[0018](4)以無毒的河豚魚提取液加入TTX標準品0.0?μδ,熒光衍生處理后，定容至ImL，高效液相色譜測定，計算得出色譜峰信噪比為4.2，以3倍信噪比計算出本發明提供的方法的檢測限，最低檢測濃度可達0.008Pg/mL，靈敏度高于現有的河豚毒素檢測方法。
[0019](5)本發明預制所需衍生試劑，形成試劑盒，方便了使用，同時可避免了因配制人員不同造成的試劑誤差。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0020]圖1為河豚毒素熒光衍生反應后熒光掃描圖譜:TTX經熒光衍生后，固定激發波長為233nm，掃描獲得發射光譜，最大發射波長為370nm ;固定發射波長為370nm，掃描獲得激發光譜，最大激發波長為232.9nm ；
圖2為河豚毒素柱前衍生-高效液相熒光檢測色譜圖:衍生物經高效液相色譜反相C-18柱分離，熒光檢測器檢測(激發波長233nm、發射波長370nm)，獲得色譜圖顯示僅有一個主峰，次峰很小可忽略不計，說明熒光衍生物為一種單一物質。
【具體實施方式】
[0021]下面通過具體實施例，對本發明的技術方案做進一步說明。應當理解，本發明的實施并不局限于下面的實施案例，對本發明所做的的任何形式上的變通和/或改變都將落入本發明保護范圍內。
[0022]在本發明中，若非特指，所有設備和原料等均可從市場購得或是本行業常用的。
[0023]以下實施例的河豚毒素柱前衍生-高效液相熒光檢測方法使用試劑盒，包括以下試劑:
(I)衍生試劑I φΗ約為12,包括a液、b液和c液，a液、b液和c液之間的體積比為5:2:3，所述a液為次溴酸鈉忙備液:0.67g溴酸鈉、3.0 g溴化鈉,用蒸懼水溶解并定容至IOmL ;所述b液為5mol/L鹽酸溶液IOmL ;所述c液為4.81mol/L氫氧化鈉溶液IOmL ；
衍生試劑I是現用現配，即使用時取5 mL a液，準確加入2 mL b液，密封混勻，靜置5min后,準確加入3 mL c液,立即混勻，配制成衍生試劑I,其pH約為12。
[0024](2)衍生試劑2:衍生試劑2:20%尿素溶液(w/v) 12mL。
[0025](3) pH維持液:2mol/L碳酸鈉溶液25mL ；
(4)河豚毒素標準品貯備液:100μ g/mL河豚毒素溶液2mL，內含lmmol/L的檸檬酸鹽,pH=5.0 ；
(5)終止液:15%磷酸溶液(w/v)12mL。
[0026]TTX標準溶液:取一定量TTX標準品貯備液用蒸餾水稀釋濃度在20?IOOOOng/mL之間。
[0027]實施例一結合C18固相萃取柱和WCX固相萃取柱純化的待測樣品中河豚毒素的檢測
(I)樣品的提取與純化:稱取均質后的河豚肉樣品2g，加入10 mL0.1%乙酸，于85°C水浴超聲提取10 min,再沸水浴5min,冷卻后于4500 r/min離心5 min,取全部上清液過C18固相萃取柱(使用前依次用3mL甲醇、3mL0.1%乙酸活化)，再用2mL0.1%乙酸洗滌；收集全部濾過液，用氨水調節至pH=7.0，全部過WCX固相萃取柱(使用前依次用3mL10%氨甲醇、ImL水活化)，2mL水洗滌，抽干小柱，用5mL 2%乙酸-甲醇洗脫。洗脫液于80°C水浴氮氣吹干后用I mL水溶解,得樣品液。
[0028](2)熒光衍生:取樣品液0.4mL，加入0.2mL pH維持液，混勻，使pH為11.7，再分別加入0.1mL衍生試劑1、0.ImL衍生試劑2，混勻，于75°C下水浴20min,冷卻，加入0.1mL終止液使溶液PH為中性，加超純水定容至lmL。另取0.4mL樣品液，加入一定量TTX標準液后，按上述操作進行熒光衍生。
[0029](3)檢測:采用配備熒光檢測器的液相色譜儀對步驟(2)熒光衍生后的樣品液和TTX標準品溶液進行分析，檢測信號為:激發波長233nm，發射波長370nm ;使用標準加入法定量。
[0030]高效液相色譜檢測條件為:色譜柱:反相C-18柱；流動相:50 mmoL/L磷酸二氫銨；檢測信號:激發波長233 nm，發射波長370 nm。[0031]實施例二結合河豚毒素親和層析柱純化的待測樣品中河豚毒素的檢測
(I)樣品的提取與純化:稱取均質后的河豚內臟樣品2g，加入10 mL0.1%乙酸，于85°C水浴超聲提取10 min,再沸水浴5min,冷卻后4500 r/min離心5 min,取全部上清液,用
0.5mol/L磷酸氫二鈉溶液調節pH至7.4,以2mL/min速度，全部過河豚毒素親和層析柱(3mL規格)，分別用3mL PBS (0.0lmol/L，pH=7.4)，3mL去離子水洗滌，5mL 1%醋酸洗脫，抽干柱子。洗脫液于90°C水浴氮氣吹干后用I mL水溶解，得樣品液。
[0032](2)熒光衍生:取樣品液0.4mL，加入0.2mL pH維持液，混勻，使pH為11.7，再分別加入0.1mL衍生試劑1、0.ImL衍生試劑2，混勻，于75°C下水浴20min,冷卻，加入0.1mL終止液使溶液PH為中性，加超純水定容至lmL。另取0.4mL樣品液，加入一定量TTX標準液后，按上述操作進行熒光衍生。
[0033](3)檢測:采用配備熒光檢測器的液相色譜儀對步驟(2)熒光衍生后的樣品溶液和TTX標準品溶液進行分析，檢測信號為:激發波長233nm，發射波長370nm ;使用標準加入
法定量。
[0034]高效液相色譜檢測條件為:色譜柱:反相C-18柱；流動相:50 mmoL/L磷酸二氫銨；檢測信號:激發波長233 nm，發射波長370 nm。
【權利要求】
1.一種河豚毒素柱前衍生-高效液相熒光檢測方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)制備待測品的樣品溶液及河豚毒素標準品溶液； (2)熒光衍生:取樣品溶液0.4m L，加入0.2m L pH維持液，將溶液pH控制在11.6?11.9區間，然后加入0.1mL衍生試劑I和0.1mL衍生試劑2，混勻，水浴加熱20min，冷卻至室溫,加入0.1mL終止液,使溶液pH呈中性，而后用超純水定容；取樣品溶液,加入河豚毒素標準品溶液混勻，然后進行本步驟操作進行熒光衍生； (3)定性和定量檢測:采用配備熒光檢測器的液相色譜儀對步驟(2)熒光衍生后的樣品溶液和河豚毒素標準品溶液進行分析，對樣品溶液中的河豚毒素進行定性和定量。
2.根據權利要求1所述的河豚毒素柱前衍生-高效液相熒光檢測方法，其特征在于，所述步驟(I)河豚毒素標準品溶液中河豚毒素濃度為2(Tl0000ng/ml。
3.根據權利要求1或2所述的河豚毒素柱前衍生-高效液相熒光檢測方法，其特征在于，所述步驟⑵中pH維持液為2mol/L碳酸鈉溶液。
4.根據權利要求3所述的河豚毒素柱前衍生-高效液相熒光檢測方法，其特征在于，所述步驟⑵中衍生試劑I的PH約為12，包括a液、b液和c液，a液、b液和c液之間的體積比為5:2:3，具體地，所述a液為次溴酸鈉貯備液:0.67g溴酸鈉、3.0 g溴化鈉，用蒸懼水溶解并定容至IOmL ;所述b液為5mol/L鹽酸；所述c液為4.81mol/L氫氧化鈉。
5.根據權利要求4所述的河豚毒素柱前衍生-高效液相熒光檢測方法，其特征在于，所述步驟⑵中衍生試劑2為20%尿素。
6.根據權利要求5所述的河豚毒素柱前衍生-高效液相熒光檢測方法，其特征在于，所述步驟(2)中終止液為15%磷酸。
7.根據權利要求1所述的河豚毒素柱前衍生-高效液相熒光檢測方法，其特征在于，所述步驟(3)中高效液相色譜檢測條件為:色譜柱:反相C-18柱；流動相:50 mmoL/L磷酸二氫銨；檢測信號:激發波長233 nm，發射波長370 nm。
8.一種基于權利要求1所述的河豚毒素柱前衍生-高效液相熒光檢測方法用試劑盒，其特征在于，包括以下試劑: (1)衍生試劑1:pH約為12,包括a液、b液和c液，a液、b液和c液之間的體積比為5:2: 3，所述a液為次溴酸鈉貯備液:0.67g溴酸鈉、3.0 g溴化鈉，用蒸餾水溶解并定容至IOmL ;所述b液為5mol/L鹽酸溶液；所述c液為4.81mol/L氫氧化鈉溶液； (2)衍生試劑2:20%尿素溶液； (3)pH維持液:2mol/L碳酸鈉溶液； (4)河豚毒素標準品貯備液:100μ g/mL河豚毒素溶液，內含lmmol/L的檸檬酸鹽，pH=5.0 ； (5)終止液:15%磷酸溶液。
【文檔編號】G01N30/02GK103983706SQ201410181792
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年5月4日 優先權日:2014年5月4日
【發明者】岑劍偉, 李來好, 楊賢慶, 郝淑賢, 魏涯, 辛少平, 周婉君, 黃卉, 楊少玲, 鄧建朝 申請人:中國水產科學研究院南海水產研究所
專業數控銑床產品供應商
20年生產經驗，實力工廠，精工品質，質量有保障
