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一種利用石墨烯組裝多層生物酶傳感器提高檢測性能的新方法
【專利摘要】本發(fā)明的目的是提出一種利用石墨烯組裝多層生物酶傳感器提高檢測性能的新方法，以期利用一種帶有大π環(huán)端基的試劑芘丁酸，通過與生物酶（以葡萄糖氧化酶為例）表面的氨基基團(tuán)的酰胺化反應(yīng)，對其進(jìn)行改造，得到表面具有大π環(huán)端基的葡萄糖氧化酶。改造后的葡萄糖氧化酶利用石墨烯通過層層組裝的方法固定在電極的表面，制備出層數(shù)可控、靈敏度高的生物酶傳感器。通過π-π疊加作用將改性酶與石墨烯進(jìn)行層層組裝，從而解決了層數(shù)可控、結(jié)構(gòu)有序、性能穩(wěn)定的生物傳感器組裝問題，能大大提高此生物酶傳感器的檢測靈敏度和檢測范圍。
【專利說明】—種利用石墨烯組裝多層生物酶傳感器提高檢測性能的新方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]該方法涉及一種新型生物酶生物傳感器的制備方法，我們通過生物酶表面的氨基基團(tuán)，把一種帶有大H環(huán)端基的試劑芘丁酸連接在其表面使之被改造。改造后的生物酶(如葡萄糖氧化酶)利用石墨烯通過層層組裝的方法固定在電極的表面，制備出層數(shù)可控、靈敏度高的生物酶傳感器，屬于電化學(xué)分析研究領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]生物酶傳感器是一類特殊的化學(xué)傳感器，它是以生物酶作為生物敏感基元，通過各種物理、化學(xué)型信號轉(zhuǎn)換器捕捉目標(biāo)物與敏感基元之間的反應(yīng)，然后將反應(yīng)程度用離散或連續(xù)的電信號表達(dá)出來，是一種對被測目標(biāo)具有高度選擇性的檢測器。與傳統(tǒng)測試分析方法相比，生物酶傳感器的主要特點(diǎn)是:選擇性好，能夠直接對復(fù)雜樣品進(jìn)行測定，響應(yīng)速度快，靈敏度高，體積小，可實(shí)現(xiàn)在線監(jiān)測。由于其具有高度的特異性、靈敏性等特點(diǎn)，生物酶傳感器廣泛應(yīng)用于環(huán)境監(jiān)測、食品分析、生物醫(yī)學(xué)、軍事等領(lǐng)域。
[0003]現(xiàn)階段，國內(nèi)外有大量關(guān)于生物酶傳感器的研究，但是生物酶傳感器的實(shí)際應(yīng)用還具有很多可以改進(jìn)的方面，比如生物酶傳感器的制備方法復(fù)雜、酶的活性受環(huán)境條件影響很大，因此其貯存和使用都會(huì)受到不同程度的限制。目前國內(nèi)外組裝生物酶傳感器的方法很多，主要是將特定的生物酶或改性生物酶分子固定在高分子材料、納米材料和有序的陣列結(jié)構(gòu)單元等載體上，從而組裝各式各樣的生物酶傳感器。
[0004]石墨烯是一種新型的排列得像蜂窩狀的單層芳香碳原子片狀納米材料。因其具有原子級的厚度、優(yōu)異的導(dǎo)電性能、巨大的比表面積(2630 m2/g)、出色的電化學(xué)和熱力學(xué)穩(wěn)定性，在超級計(jì)算機(jī)、超硬超輕材料、電池電極材料、柔性導(dǎo)電材料、催化劑載體材料、納米電子器件、光子傳感器、晶體管和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。石墨烯是目前已知導(dǎo)電性能最好的材料，10納米以下的石墨烯的導(dǎo)電性仍然十分穩(wěn)定。石墨烯是一種理想的生物酶載體材料。生物酶是由活細(xì)胞產(chǎn)生的具有催化作用的有機(jī)物，大部分為蛋白質(zhì)，而蛋白質(zhì)是由氨基酸組成的，因此每個(gè)生物酶分子上都會(huì)有若干氨基，其中有些分布在酶的表面，可用于對生物酶的改性。
[0005]我們利用用石墨烯作為載體材料，用芘丁酸通過酯化反應(yīng)在溫和的反應(yīng)條件下對酶進(jìn)行改造，使酶表面具有大η環(huán)的基團(tuán)，然后通過疊加作用將生物酶和石墨烯組裝成層數(shù)可控、靈敏度高的生物酶傳感器。用石墨烯作為生物酶的層間媒介有利于增強(qiáng)酶與電極之間的電子傳遞，使所組裝的生物傳感器具有響應(yīng)速度快，靈敏度高等特點(diǎn)。本方法將會(huì)極大地豐富生物傳感器的制備方法，并能解決生物傳感器存在的測量范圍小、靈敏度低、響應(yīng)慢和不穩(wěn)定等關(guān)鍵技術(shù)問題，將會(huì)有力的推進(jìn)先進(jìn)生物酶傳感器的研發(fā)。
[0006]
【發(fā)明內(nèi)容】
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本發(fā)明的目的是提出一種利用石墨烯組裝多層生物酶傳感器提高檢測性能的新方法，以期利用一種帶有大η環(huán)端基的試劑芘丁酸，通過與生物酶(以葡萄糖氧化酶為例)表面的氨基基團(tuán)的酰胺化反應(yīng)，對其進(jìn)行改造，得到表面具有大H環(huán)端基的葡萄糖氧化酶。改造后的葡萄糖氧化酶利用石墨烯材料通過層層組裝的方法固定在電極的表面，制備出層數(shù)可控、靈敏度高的生物酶傳感器。通過疊加作用將改性酶與石墨烯進(jìn)行層層組裝，從而解決了層數(shù)可控、結(jié)構(gòu)有序、性能穩(wěn)定的生物傳感器組裝問題，能大大提高此葡萄糖氧化酶電極的檢測靈敏度和檢測范圍。
[0007]發(fā)明是通過下述方式實(shí)現(xiàn)的，包括下列步驟:
(O利用石墨烯作為載體材料，用芘丁酸通過酯化反應(yīng)在溫和的反應(yīng)條件下對生物酶(以葡萄糖氧化酶為例)進(jìn)行改造，使酶表面具有大H環(huán)的基團(tuán)，然后通過疊加作用將生物酶和石墨烯組裝成的方法組裝成層數(shù)可控、靈敏度高的生物酶傳感器。(附圖1)
(2)不同層數(shù)葡萄糖氧化酶傳感器檢測性能測定:通過電化學(xué)工作站的循環(huán)伏安法，對其檢測性能進(jìn)行測定。分別制備1，2，3，4層的葡萄糖氧化酶傳感器，配制50 mM/L的葡萄糖溶液，將組裝的不同層數(shù)的生物酶電極浸泡在溶液中，利用循環(huán)伏安法掃描，得到不同層數(shù)的生物酶傳感器的檢測能力。(附圖2)
(3)葡萄銅氧化酶傳感器檢測靈敏度及檢測范圍的測定:通過電化學(xué)工作站的循環(huán)伏安法，對其檢測性能進(jìn)行測定。制備3層的葡萄糖氧化酶傳感器，配制濃度分別為1，10，20，30，50，80，100 mM/L的葡萄糖溶液，利用組裝的傳感器分別測試不同濃度的葡萄糖溶液的循環(huán)伏安曲線，并分析其靈敏度和線性檢測范圍。(附圖3)
[0008]【專利附圖】

【附圖說明】:
圖1是用芘丁酸改性生物酶和石墨烯通過自組裝的方法制備生物傳感器的示意圖；
圖2是不同層數(shù)(A，B，C，D分別是1，2，3，4層)的氧化酶的改性電極在相同葡萄糖濃度溶液中的循環(huán)伏安曲線圖；
圖3 Ca)三層葡萄糖氧化酶改性的傳感器分別測試不同濃度葡萄糖溶液(A-G分別為1，10，20，30，50，80，100 mM/L)的循環(huán)伏安曲線圖；
圖3 (b)是三層葡萄糖氧化酶改性的傳感器分別測試不同濃度葡萄糖溶液的循環(huán)伏安峰電流對葡萄糖溶液的線性擬合圖。
[0009]
[0010]【具體實(shí)施方式】:
實(shí)施例1.(I)用芘丁酸對生物酶(以葡萄糖氧化酶為例)進(jìn)行改造，使其表面帶有大環(huán)端基:取葡萄糖氧化酶5 mg，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)IOmg, N-輕基丁二酰亞胺(NHS) 2 mg溶于9.5 mL pH=7.4的磷酸緩沖溶液中。取2 mg花丁酸溶于I mL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中。將0.5 mL芘丁酸溶液緩慢的滴加到上葡萄糖氧化酶溶液中，室溫下攪拌10小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后，通過在磷酸緩沖溶液中透析去除未反應(yīng)的小分子，得到芘丁酸改性的葡萄糖氧化酶。
[0011](2)石墨烯的制備:石墨粉的氧化:將2 g石墨粉，I g過硫酸鉀，I g五氧化二磷加入到3 ml濃硫酸中，6小時(shí)后得到深藍(lán)色液體。用蒸餾水稀釋，過濾，洗滌，并干燥。取預(yù)氧化的石墨2 g，加入O 1:的濃硫酸46 mL,并逐漸加入6 g高錳酸鉀，此過程中體系溫度需在20 V以下。得到的混合溶液在35 °C下攪拌2小時(shí)，最后加入92 mL蒸餾水，15 min后加入280 mL蒸餾水和5 mL 30%的雙氧水結(jié)束反應(yīng)。混合液用500 mL 10%的鹽酸洗滌，然后干燥得到氧化石墨烯。氧化石墨烯0.1 g溶解到200 mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH=9,加入I mL水合肼，95°C還原2小時(shí)得到石墨烯溶液，然后洗滌，并重新確定石墨烯溶液的濃度。
[0012](3)葡萄糖氧化酶傳感器的組裝:直接將玻碳電極浸泡到0.1 mg/ mL的石墨烯溶液中，用石墨烯納米材料去修飾玻碳電極的表面。然后將石墨烯修飾的玻碳電極浸泡到芘丁酸改名的葡萄糖氧化酶溶液中，通過芘端基與石墨烯之間的疊加作用，將芘丁酸改性的葡萄糖氧化酶固定到石墨烯修飾的電極表面。然后經(jīng)過這種逐步層層組裝的方式來獲得不同層數(shù)、不同活性與靈敏度的葡萄糖氧化酶傳感器。并對葡萄糖溶液進(jìn)行測試，分析傳感器的性能。
【權(quán)利要求】
1.一種利用石墨烯組裝多層生物酶傳感器提高檢測性能的新方法，其主要特征在于: (1)用芘丁酸對生物酶進(jìn)行改造(以葡萄糖氧化酶為例)，使其表面帶有大H環(huán)端基:取葡萄糖氧化酶5mg，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC) 10 mg，N-羥基丁二酰亞胺(NHS)2 mg溶于9.5 mL pH=7.4的磷酸緩沖溶液中；取2 mg花丁酸溶于I mLN，N-二甲基甲酰胺(DMF)中；將0.5 mL芘丁酸溶液緩慢的滴加到上葡萄糖氧化酶溶液中，室溫下攪拌10小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后，在磷酸緩沖溶液中用截留分子量8千的透析袋透析去除未反應(yīng)的小分子，得到芘丁酸改性的葡萄糖氧化酶； (2)葡萄糖氧化酶傳感器的組裝:直接將玻碳電極浸泡到0.1 mg/ mL的常規(guī)的石墨烯分散液中，用石墨烯去修飾玻碳電極的表面；然后將石墨烯修飾的玻碳電極浸泡到芘丁酸改性的葡萄糖氧化酶溶液中，通過芘端基與石墨烯之間的疊加作用，將芘丁酸改性的葡萄糖氧化酶固定到石墨烯修飾的電極表面；然后重復(fù)上述步驟，經(jīng)過這種逐步層層組裝的方式來獲得不同葡萄糖氧化酶和石墨烯層數(shù)、靈敏度可控的葡萄糖氧化酶傳感器。
2.按照權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于:步驟(I)中用芘丁酸改性葡萄糖氧化酶使其表面帶有大η環(huán)端基；然后通過疊加作用將改性酶連接到石墨烯表面，從而解決了葡萄糖氧化酶和石墨烯難以穩(wěn)定組裝的難題。
3.按照權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于:步驟(2)中經(jīng)過這種逐步層層組裝的方式來獲得不同層數(shù)、靈敏度可控的葡萄糖氧化酶傳感器。
4.按照權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于:一般生物酶的表面大都會(huì)有數(shù)個(gè)氨基，通過這些氨基用I所述的方法進(jìn)行改造，使其表面帶有大η環(huán)基團(tuán)，然后用石墨烯組裝其它層數(shù)和靈敏度可控的生物酶傳感器。
【文檔編號】G01N27/26GK103743797SQ201410000397
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2014年1月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月2日
【發(fā)明者】不公告發(fā)明人 申請人:青島大學(xué)