一種用于atp檢測的方法及其配套的光學適配子傳感器的制造方法
【專利摘要】本發明公開了一種用于ATP檢測的方法及其配套的光學適配子傳感器。將完整的ATP適配子被分成單鏈DNA，即S1和S2。S1被固定在帶孔DNA結合板表面；S2和用于產生信號的核酸鏈S3被固定在以PNS/AuNPs納米復合物為信號放大載體的表面，在被檢測物ATP存在時，S1和S2通過ATP分子而連接，從而將信號放大載體固定在帶孔DNA結合板表面，然后負載在PNS/AuNPs納米復合物表面的S3與加入的鉀離子和血紅素形成四鏈體結構DNA酶，催化底物，得到可用于檢測的光學信號。本發明具有很高的靈敏度和特異性，對ATP的響應范圍為0.01–1nmol·L-1，檢測限為1.35pmol·L-1。
【專利說明】—種用于ATP檢測的方法及其配套的光學適配子傳感器
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物分析檢測【技術領域】，具體涉及一種用于ATP檢測的方法及其配套的光學適配子傳感器。
【背景技術】
[0002]三磷酸腺苷(ATP)是體內組織細胞所需能量的主要來源，在細胞的多種代謝過程中扮演者重要的角色，是維持生物體正常機能無可替代的物質，并且細胞中ATP的含量還和許多疾病如貧血、低血糖、心血管疾病以及癌癥等有著密切的關系，因此發展一種聞效靈敏的方法去檢測ATP分子有著非常重要的意義。
[0003]傳統上，有大量的方法可以檢測ATP分子，如色譜法(J.Chromatogr.，Biomed.Appl.，1994，662，15 - 20)、生物發光法(Cancer, 1993，71，1613 - 1620)、電化學方法(Talanta, 2009，78，954 - 958)以及熒光法(Chem.Commun.，2011，47, 6066 - 6068)等。但是這些方法或多或少存在有操作麻煩、檢測時間長、性能不穩定以及靈敏度較低等問題。
[0004]近年來，適配子傳感器因其對目標分子的高親合力以及良好的特異性而受到科研工作者的廣泛研究，而基于光學方法發展的超靈敏適配子傳感器更是因為低成本以及高靈敏度而備受青睞。自組裝寡肽納米球因其良好的生物相容性、高的均相度以及表面易于修飾等優點而引起人們的關注，但是將自組裝寡肽納米球作為信號放大載體用于構建超靈敏光學適配子傳感器還未見報道。
【發明內容】
[0005]本發明的目的就是基于上述不足，提供一種基于自組裝寡肽納米球構建的光學適配子傳感器及其用于ATP檢測的方法，該光學適配子傳感器設計簡單、成本低廉且穩定性好，更重要的是具有高的靈敏度。本發明的目的是通過以下方式實現的:
[0006]一種用于ATP檢測的方法，包括以下步驟:
[0007](I)將設計合成的含巰基的寡肽自組裝成寡肽納米球；
[0008](2)將制備的金納米粒子通過Au - S鍵固定到寡肽納米球的表面，得到用于信號放大的PNS/AuNPs納米復合物載體；
[0009](3)將用于產生信號的核酸鏈S3和ATP單鏈適配體S2固定到PNS/AuNPs納米復合物上，ATP單鏈適配體SI固定在帶孔DNA結合板上，板表面空隙位置用牛血清蛋白封閉；
[0010](4)通過加入不同濃度的ATP分子將負載有S3和S2的PNS/AuNPs納米復合物連接到帶孔DNA結合板上；
[0011](5)往上述帶孔DNA結合板中加入鉀離子和血紅素后，PNS/AuNPs納米復合物表面的S3與鉀離子和血紅素形成四鏈體結構的DNA酶，從而可催化底物反應得到具有光學信號產物。
[0012](6)制作標準曲線后，用于檢測ATP樣品。
[0013]所用寡肽序列為含有半胱氨酸或蛋氨酸，和苯丙氨酸的短肽單元，序列通式為:Cys-Phe-AniBn,或者 Met-Phe-AniBn, A 為 Phe, Trp 及 His 中的任何一種，其中 m=l 或 2 ;B 為Gly、Leu、Val、Ala及Met中的任何一種，其中n=0,1或2。
[0014]所述寡肽納米球是將0.5?10mg/mL的寡肽溶液放置在室溫條件下，反應12?48h。
[0015]所述金納米粒子的粒徑范圍為2.5_15nm，金納米粒子溶液的濃度范圍為0.01?lg/L。
[0016]所述PNS/AuNPs納米復合物是將0.1?IOmL制備的0.01?lg/L金納米粒子溶液加入到I?20mL制備的0.5?10mg/mL的寡肽納米球溶液中，震蕩條件下反應I?6h。
[0017]所述S2和S3的濃度分別為0.5?5μ M和2?ΙΟμΜ，往制備的PNS/AuNPs納米復合物表面固定時，所加入的S2和S3溶液體積比為1:1?1:10，所用S2和S3溶液，與PNS/AuNPs納米復合物溶液體積比例為1:0.5?1:5。
[0018]S2和S3固定在PNS/AuNPs納米復合物的表面，結合時間為6?24h，離心將未反應的S2和S3移除。
[0019]步驟(4)中向各孔中加入10-30 μ L的待檢測的ATP和80-120 μ L修飾有S2和S3的PNS/AuNPs納米復合物溶液。
[0020]完整的ATP適配子被分成兩段單鏈DNA，其序列分別為:S1:5' -NH2-TTT TTT ACCTGG GGG AGTAT-3'和S2:5/ -HS-TTT TTT TGC GGA GGA AGG T-3/，用于產生信號的核酸鏈為 S3:5' -HS-TTT TTT GGTTGG TGT GGT TGG-3'。
[0021]所述的用于ATP檢測的方法及其配套的光學適配子傳感器，包括:含巰基的寡肽自組裝成的寡肽納米球、金納米粒子、用于產生信號的核酸鏈S3、ATP單鏈適配體S2、ATP單鏈適配體S1、帶孔DNA結合板、鉀離子、血紅素、底物、牛血清蛋白。
[0022]本發明是將完整的ATP適配子分成兩段單鏈DNA，即SI和S2。SI被固定在帶孔DNA結合板表面，板表面空隙位置用牛血清蛋白(BSA)封閉；S2和S3被固定在以PNS/AuNPs納米復合物為信號放大載體的表面，在被檢測物ATP存在時，SI和S2可以通過ATP分子而連接起來，從而將信號放大載體固定在帶孔DNA結合板表面，然后負載在PNS/AuNPs納米復合物表面用于產生信號的核酸鏈S3與加入的鉀離子和血紅素形成具有過氧化氫酶的功能的四鏈體結構DNA酶。該DNA酶可以催化過氧化氫去氧化底物3，3'，5，5'-四甲基聯苯胺(TMB)，從而得到可用于檢測的光學信號。
[0023]本發明所述寡肽納米球(PNS)是將0.5?10mg/mL凍干的Cys-Phe-AmBn,或者Met-Phe-AmBn, (A 為 Phe> Trp 及 His 中的任何一種，其中 m=l 或 2 ;B 為 Gly、Leu、Val、Ala及Met中的任何一種，其中n=0，I或2)寡肽溶液放置在室溫條件下，反應12?48h。優選的寡肽濃度為2mg/mL。優選的反應時間為24h。
[0024]本發明所述金納米粒子(AuNPs)粒徑范圍為2.5_15nm，金納米粒子溶液的濃度范圍為0.01?lg/L。具體配制可以是將0.1?5mLl%的氯金酸溶液加入到50mL雙蒸水中，劇烈攪拌5?lOmin，再加入0.5mLl%的檸檬酸鈉溶液，混勻后，加入0.5mL0.05?0.15%的硼氫化鈉溶液，劇烈攪拌5?lOmin，后放于4°C下保存備用。優選的加入1%的氯金酸溶液的量為0.5mL，優選的硼氫化鈉溶液濃度為0.075%。
[0025]本發明所述PNS/AuNPs納米復合物是將0.1?IOmL制備的0.01?lg/L金納米粒子溶液加入到I?20mL制備的0.5?10mg/mL的寡肽納米球溶液中，震蕩條件下反應I?6h。優選的加入AuNPs溶液的量為0.5?2mL。優選的PNS溶液體積為I?5mL。優選的反應時間為2?4h。
[0026]本發明所述S2和S3的濃度分別為0.5?5 μ M和2?10 μ M，往上述制備的PNS/AuNPs納米復合物表面固定時，所加入的兩者體積比為1:1?1:10，所用S2和S3溶液，與PNS/AuNPs納米復合物溶液體積比例為1:0.5?1:5。優選的S2和S3的濃度分別為I μ M和5 μ Μ。優選的加入的S2和S3體積比為1:4?1:6。優選的S2和S3溶液，與PNS/AuNPs納米復合物溶液體積比例為1:1?1:3。
[0027]本發明所述SI的濃度為0.1?5 μ M。封閉用的BSA濃度為0.5%?10%。優選的SI的濃度為0.5 μ Μ。優選的BSA濃度為2%。
[0028]本發明SI的固定過程可以是:在96孔DNA結合板的各孔中加入100 μ LSI (0.5 μ Μ), 37°C下放置lh，將溶液移除后用PBS清洗兩次；再加入300 μ Ll%的BSA，37 °C下放置Ih,將溶液移除后用PBS清洗三次。
[0029]本發明制作標準曲線的過程可以是:向各孔中加入10-30 μ L的不同濃度的ATP和80-120 μ L修飾有S2和S3的PNS/AuNPs納米復合物溶液，室溫下放置lh，將溶液移除后用PBS清洗三次。加入50 μ L0.1%的KCl溶液和50 μ LI μ M的血紅素，室溫下放置Ih后加入100 μ L800 μ M 的 TMB 和 10 μ Ll% 的 H2O2,反應約 15min 后加入 10 μ L 的 HCl (200 μ Μ)，然后在450nm下測定紫外吸光度。以450nm處吸光度值對ATP濃度的自然對數作圖。ATP濃度在0.01 -1nM范圍內時，兩者之間呈現良好的線性關系，可實現該濃度范圍內ATP分子的定量檢測。
[0030]本發明的優點在于:
[0031]I)本發明檢測ATP分子時具有高的靈敏度和優異的選擇性，對ATP的檢測濃度范圍為0.01 -1nM，檢測限為1.35pM ；
[0032]2)本發明的制作工藝簡單、成本低且性能穩定；
[0033]3)本發明基于PNS/AuNPs納米復合物構建的適配子傳感器有望成為一種通用的構建適配子傳感器的方法。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0034]圖1為本發明的ATP檢測方法原理示意圖；
[0035]圖2㈧為實施例1中寡肽自組裝得到的PNS原子力顯微鏡圖，圖2 (B)為實施例1中AuNPs負載到PNS表面后Au的XPS圖譜；
[0036]圖3為實施例2中構建的光學適配子傳感器對ATP檢測的標準曲線圖，從左到右，ATP濃度分別為0.01,0.025、0.05,0.1,0.5、Inmol.L—1，橫坐標為ATP濃度取自然對數，縱坐標為吸光度；
[0037]圖4為實施例2中構建的光學適配子傳感器對ATP的選擇性。
【具體實施方式】:
[0038]以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。
[0039]實施例1:PNS/AuNPs納米復合物的制備
[0040]2mg/mL的Cys-Phe-Phe寡肽溶液放置于室溫下，反應24h,得到PNS。[0041]將0.5mLl%的氯金酸溶液加入到50mL雙蒸水中，劇烈攪拌5min，再加入0.5mLl%的檸檬酸鈉溶液，混勻后，加入0.5mL0.075%的硼氫化鈉溶液，劇烈攪拌5min，得到AuNPs。
[0042]將ImL制備的AuNPs溶液加入到2mL制備的PNS溶液中，震蕩條件下反應4h后，離心將未反應的AuNPs移除，得到PNS/AuNPs納米復合物。
[0043]實施例2:光學適配子傳感器構建及用于檢測ATP分子
[0044]50 μ L S2 (I μ Μ)和 200 μ L S3 (5 μ Μ)同時加入到 400 μ L 上述制得的 PNS/AuNPs納米復合物溶液中，反應12h后，在8000rpm的條件下離心lOmin，移除未反應的S2和S3，重復三次，得到修飾有S2和S3的PNS/AuNPs納米復合物。
[0045]在96孔DNA結合板的各孔中加入IOOyL SI (0.5 μ M)，37°C下放置lh，將溶液移除后用PBS清洗兩次；再加入300 μ Ll%的BSA，37°C下放置lh，將溶液移除后用PBS清洗三次。然后向各孔中加入20 μ L的不同濃度的ATP和100 μ L修飾有S2和S3的PNS/AuNPs納米復合物溶液，室溫下放置lh，將溶液移除后用PBS清洗三次。加入50 μ L0.1%的KCl溶液和50 μ LI μ M的血紅素，室溫下放置Ih后加入100 μ L800 μ M的TMB和10 μ Ll%的H2O2,反應約15min后加入IOyL的Ηα(200μΜ)，然后在450nm下測定紫外吸光度。以450nm處吸光度值對ATP濃度的自然對數作圖，ATP濃度在0.01 -1nM范圍內時，兩者之間呈現良好的線性關系，可實現該濃度范圍內ATP分子的定量檢測。并且在檢測ATP分子時不受其他一些ATP類似物的干擾，如:GTP、CTP及UTP等。在上述ATP類似物存在的條件下，該光學適配子傳感器對ATP分子仍具有良好的選擇性和靈敏度(圖4)。
【權利要求】
1.一種用于ATP檢測的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)將設計合成的含巰基的寡肽自組裝成寡肽納米球； (2)將制備的金納米粒子通過Au- S鍵固定到寡肽納米球的表面，得到用于信號放大的PNS/AuNPs納米復合物載體； (3)將用于產生信號的核酸鏈S3和ATP單鏈適配體S2固定到PNS/AuNPs納米復合物上，ATP單鏈適配體SI固定在帶孔DNA結合板上，板表面空隙位置用牛血清蛋白封閉； (4)通過加入不同濃度的ATP分子將負載有S3和S2的PNS/AuNPs納米復合物連接到帶孔DNA結合板上； (5)往上述帶孔DNA結合板中加入鉀離子和血紅素后，PNS/AuNPs納米復合物表面的S3與鉀離子和血紅素形成四鏈體結構的DNA酶，從而可催化底物反應得到具有光學信號產物； (6)制作標準曲線后，用于檢測ATP樣品。
2.如權利要求1所述的用于ATP檢測的方法，其特征在于，所用寡肽序列為含有半胱氨酸或蛋氨酸，和苯丙氨酸的短肽單元，序列通式為=Cys-Phe-AniBn，或者Met-Phe-AniBn, A為Phe、Trp及His中的任何一種，其中m=l或2 ;B為Gly、Leu、Val、Ala及Met中的任何一種，其中η=0，1或2。
3.如權利要求2所述的用于ATP檢測的方法，其特征在于，所述寡肽納米球是將0.5?10mg/mL的寡肽溶液放置在室溫條件下,反應12?48h。
4.如權利要求1所述的用于ATP檢測的方法，其特征在于， 所述金納米粒子的粒徑范圍為2.5-15nm，金納米粒子溶液的濃度范圍為0.01?lg/L。
5.如權利要求1所述的用于ATP檢測的方法，其特征在于， 所述PNS/AuNPs納米復合物是將0.1?IOmL制備的0.01?lg/L金納米粒子溶液加入到I?20mL制備的0.5?10mg/mL的寡肽納米球溶液中，震蕩條件下反應I?6h。
6.如權利要求5所述的用于ATP檢測的方法，其特征在于， 所述S2和S3的濃度分別為0.5?5 μ M和2?10 μ M，往制備的PNS/AuNPs納米復合物表面固定時，所加入的S2和S3溶液體積比為1:1?1:10，所用S2和S3溶液，與PNS/AuNPs納米復合物溶液體積比例為1:0.5?1:5。
7.如權利要求1所述的用于ATP檢測的方法，其特征在于，S2和S3固定在PNS/AuNPs納米復合物的表面，結合時間為6?24h，離心將未反應的S2和S3移除。
8.如權利要求6所述的用于ATP檢測的方法，其特征在于，步驟(4)中向各孔中加入10-30 μ L的待檢測的ATP和80-120 μ L修飾有S2和S3的PNS/AuNPs納米復合物溶液。
9.如權利要求1所述的用于ATP檢測的方法，其特征在于，完整的ATP適配子被分成兩段單鏈 DNA，其序列分別為:S1:5' -NH2-TTT TTT ACC TGG GGG AGT AT-3'和 S2:5' -HS-TTT TTT TGC GGA GGA AGGT-3'，用于產生信號的核酸鏈為 S3:5' -HS-TTT TTTGGT TGG TGT GGT TGG-3'。
10.權利要求1-9任一項所述的用于ATP檢測的方法及其配套的光學適配子傳感器，其特征在于，包括:含巰基的寡肽自組裝成的寡肽納米球、金納米粒子、用于產生信號的核酸鏈S3、ATP單鏈適配體S2、ATP單鏈適配體S1、帶孔DNA結合板、鉀離子、血紅素、底物、牛血清蛋白。
【文檔編號】G01N21/33GK103822890SQ201410068710
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年2月27日 優先權日:2014年2月27日
【發明者】劉又年, 鄧留, 黎世鵬, 郝遠強, 李娟
申請人:中南大學
專業數控銑床產品供應商
20年生產經驗，實力工廠，精工品質，質量有保障
