一種電致化學發光成像裝置及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種電致化學發光成像裝置，包括物鏡、光傳輸通道、單光子檢測電子倍增CCD和電致化學發光發生器，所述電致化學發光發生器包括ITO電極、銀電極和電壓發生器，其中，所述物鏡、光傳輸通道和單光子檢測電子倍增CCD依次連接；所述ITO電極與電壓發生器相連的正極連接，所述銀電極與電壓發生器的負極連接。本發明還提出了一種上述電致化學發光成像裝置在可視化檢測雙氧水中的應用以及該裝置在可視化檢測單細胞表面外泄雙氧水和可視化檢測細胞表面分子上的應用。本發明的電致化學發光成像裝置組成簡單，可進行平行快速檢測，檢測通量大，操作簡便，發光效率高。
【專利說明】一種電致化學發光成像裝置及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物化工【技術領域】，具體地涉及一種電致化學發光成像裝置及其應用。
【背景技術】
[0002]應用電化學技術對單細胞進行成像研究可以得到細胞表面化學組分和局部活性等重要生物信息，目前最通用的顯微儀器為電化學掃描顯微鏡。這個顯微鏡是利用一根微電極掃描單一活細胞的表面來檢測具有電活性的化學物種。通過降低電極尺寸至納米級別可使得電化學掃描顯微鏡的空間分辨率達到納米級別。該技術的缺陷在于:每一個細胞表面必須單一獨立檢測，因此檢測的通量被嚴重限制。作為除了電化學掃描顯微鏡的另一種選擇，近期發展的基于表面等離子共振的電化學成像技術利用了局部的電化學信號和表面等離子共振信號之間的關系來進行單細胞成像。雖然這種新技術通過對多細胞的平行檢測提高了檢測通量，但是表面等離子共振技術由于自身檢測靈敏度差，因此很難對單細胞中外泄的生物分子或者細胞表面低豐度分子進行檢測。
[0003]電致化學發光是一種高靈敏的電化學方法。它利用電化學反應激發的物質從激發態回到基態的同時，發射光來實現對分子的檢測。鑒于整個電極表面生物分子產生的光都會被單光子檢測電子倍增電子耦合元件(CCD)接收，因此基于電致化學發光的成像技術具有高通量和高靈敏度的優勢，具備目前兩種單細胞用電化學成像技術的優點。現有電致化學發光成像已經用于對電極表面的模糊指紋和蛋白質層的成像。最新技術可對微球表面的抗原成像。該技術通過引入濃度高達毫摩爾級別的共反應物，就可以在0.4微米的區域中產生能夠檢測到的光信號，進而將空間分辨率推到亞微米級別。
[0004]雖然電致化學發光成像技術顯示具有對細胞表面抗原成像的潛力，我們在將此項技術用于對單細胞分子外泄過程進行成像時受到了挑戰。因為釋放出的分子濃度非常低，通常是在微摩級別。雖然在魯米諾存在的情況下，這些釋放出的分子通過其氧化酶而轉變成可電致化學發光的雙氧水，但要實現在亞微米的區域中，且加上秒級別的采樣時間(時間分辨率)范圍內，對如此低濃度的生物分子獲取可檢測的光信號，還是不太可能的。
【發明內容】
[0005]發明目的:為解決現有技術中存在的技術問題，本發明提出一種構造簡單，收光效率高，可實現對單細胞中外泄的生物分子或者細胞表面低豐度分子進行檢測的電致化學發光成像裝置及其應用。
[0006]技術內容:為實現上述技術目的，本發明提出一種電致化學發光成像裝置，包括物鏡、光傳輸通道、單光子檢測電子倍增CCD和電致化學發光發生器，所述電致化學發光發生器包括ITO電極銀電極和電壓發生器，其中，所述物鏡、光傳輸通道和單光子檢測電子倍增CCD依次連接；所述ITO電極與電壓發生器的正極相連，所述銀電極和電壓發生器的負極相連。[0007]其中，所述物鏡為5倍鏡、10倍鏡、20倍鏡、40倍鏡和100倍鏡中的任意一種，物鏡的N.A.越大越好。優選地，所述物鏡為N.A.為0.50的20倍鏡。根據對空間分辨率的要求選擇合適的物鏡及其N.A值。
[0008]本發明還提出了上述的電致化學發光成像裝置在可視化檢測雙氧水中的應用。
[0009]具體地，所述應用包括如下步驟:在ITO玻璃片的表面粘貼O型圈作為溶液室，以ITO玻璃片為工作電極，銀電極為對電極，將發光試劑和雙氧水加入到O型圈內，在單光子檢測電子倍增CCD曝光的同時向ITO電極施加周期性的發光電壓-恢復電壓，檢測成像效
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[0010]其中，所述的發光試劑為所述的發光試劑為L012、魯米諾、N-(4-氨基丁基)-N-乙基異魯米諾，N-(6-氨基已基)-N-乙基異魯米諾、異硫氰酸異魯米諾中的任意一種，用量為濃度為100 μ M?500 μ Μ，優選地發光試劑為LO12，發光試劑的用量為100 μ M?500 μ Μ，優選地為200 μ M0
[0011]其中，所述雙氧水的檢測范圍為10?200 μ Μ。
[0012]優選地，單光子檢測電子倍增CCD曝光的時間為兩個發光電壓-恢復電壓周期，其中，一個發光電壓-恢復電壓周期為:發光電壓:1.0±0.1V的正電壓下2±ls ;恢復電壓:-1.0±0.1V的負電壓下0.5±0.25s。更為優選地，所述周期性的發光電壓-恢復電壓的一個周期為:發光電壓:1.0V的正電壓下2s ;恢復電壓:-1.0V的負電壓下0.5s。
[0013]本發明還提出了上述裝置在可視化檢測單細胞表面外泄雙氧水中的應用。
[0014]具體地，所述可視化檢測單細胞表面外泄雙氧水的步驟包括:在ITO玻璃片的表面粘貼O型圈作為溶液室，以ITO玻璃片為工作電極，銀電極為對電極，將細胞在溶液室中培養，向溶液室中加入發光試劑，然后加入PMA刺激細胞內的NADPA氧化酶使細胞表面產生雙氧水，在單光子檢測電子倍增CCD曝光的同時向ITO電極施加周期性的發光電壓-恢復電壓，檢測成像效果。
[0015]其中，所述的發光試劑為L012、魯米諾、N-(4_氨基丁基)-N-乙基異魯米諾，N-(6-氨基已基)-N-乙基異魯米諾和異硫氰酸異魯米諾中的任意一種，用量為100 μ M?500 μ Mo優選地發光試劑為L012，發光試劑的用量為ΙΟΟμΜ?500μΜ，優選地為200 μ Μ。
[0016]優選地，單光子檢測電子倍增CCD曝光的時間為兩個發光電壓-恢復電壓周期，其中，一個發光電壓-恢復電壓周期為:發光電壓:1.0±0.1V的正電壓下2±ls ;恢復電壓:-1.0±0.1V的負電壓下0.5±0.25s。更為優選地，所述周期性的發光電壓-恢復電壓的一個周期為:發光電壓:1.0V的正電壓下2s ;恢復電壓:-1.0V的負電壓下0.5s。
[0017]本發明還提出了上述裝置在可視化檢測細胞表面分子上的應用。
[0018]具體地，包括如下步驟:在ITO玻璃片的表面粘貼O型圈作為溶液室，以ITO玻璃片為工作電極，銀電極為對電極，將細胞在溶液室中培養，向溶液室中加入發光試劑，利用細胞表面的待測分子對應的氧化酶將所述待測分子轉化為雙氧水，在單光子檢測電子倍增CCD曝光的同時向ITO電極施加周期性的發光電壓-恢復電壓，檢測成像效果。
[0019]其中，所述的發光試劑為L012、魯米諾、N-(4_氨基丁基)-N-乙基異魯米諾，N-(6-氨基已基)-N-乙基異魯米諾和異硫氰酸異魯米諾中的任意一種，用量為100 μ M?500 μ Mo優選地發光試劑為L012，發光試劑的用量為ΙΟΟμΜ?500μΜ，優選地為200μΜ。
[0020]優選地，單光子檢測電子倍增CCD曝光的時間為兩個發光電壓-恢復電壓周期，其中，一個發光電壓-恢復電壓周期為:發光電壓:1.0±0.1V的正電壓下2±ls ;恢復電壓:-1.0±0.1V的負電壓下0.5±0.25s。更為優選地，所述周期性的發光電壓-恢復電壓的一個周期為:發光電壓:1.0V的正電壓下2s ;恢復電壓:-1.0V的負電壓下0.5s。
[0021]有益效果:與現有技術相比，本發明有如下優點:
[0022](I)本發明的電致化學發光成像裝置組成簡單，收光率高，可進行平行快速檢測，且檢測的空間分辨率可以通過物鏡倍率和單光子檢測電子倍增CCD進行調節，并通過電位調節來促進發光效率，獲取可檢測的信號，同時，可以直接將培養細胞的ITO電極放置于顯微鏡平臺上檢測，不用進一步修飾電極，因此可以方便的將本電致化學發光發光分析技術用于生物研究，且可以同時獲得ITO表面所有細胞的發光信息從而加大了檢測的通量，對于單細胞檢測具有重要意義。
[0023](2)通過在電致化學發光檢測的過程中加載周期性的發光電壓和恢復電壓，可以避免在電極上持續施加高壓會導致電極失活，提高發光效率。
[0024](3)本發明的電致化學發光成像方法可以有效地檢測低濃度的雙氧水，且具有高的電致化學方法精確度，并可以檢測單細胞表面雙氧水的外泄，從而可以為不同狀態下的細胞釋放的雙氧水提供其存在的亞微米分布的證據。
[0025](4)本發明的電致化學發光成像方法可以為藥物分析提供活化膜膽固醇的分布信息，通過對細胞活化膽固醇的成像為細胞膽固醇運輸研究提供了更多的生物學信息。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0026]圖1為本發明的電致化學發光成像裝置的示意圖；
[0027]圖2為組合電壓膜式和恒電壓膜式對雙氧水發光檢測的影響；
[0028]圖3為不同的電壓頻率和不同的曝光時間對成像信噪比的影響；
[0029]圖4為溶液中雙氧水的可視化檢測，其中，A為ITO電極的膠帶覆蓋區域和裸露區域的邊界的明場照片；B為加入200 μ M L012后的發光圖；C為加入200 μ M 1^012和1(^皿雙氧水的發光圖；D為C和B圖的差分偽彩色圖；E為不同濃度雙氧水和發光強度之間的關系圖；
[0030]圖5為細胞表面雙氧水外泄的可視化檢測，其中，A為ITO電極上的Hela細胞圖的明場照片為加入200 μ M L012的發光圖；C為細胞經過PMA刺激的發光圖；D為圖B和C之間的發光差分圖；E為明場照片和差分照片的疊加圖丨為細胞外泄雙氧水的偽彩色圖；
[0031]圖6為ITO電極上的Hela細胞加入PBS緩沖液的檢測示意圖，其中，A為明場照片；B為加入200 μ M L012的發光成像圖；C為200 μ M L012中加入PBS (IOmM)的發光成像圖；D為圖B和圖C的發光成像差分圖；其中，亮度調節到了最佳可視程度；
[0032]圖7為ITO電極上ACAT被抑制的Hela細胞在200 μ M L012存在下的檢測圖像，其中A為明場照片；Β為加入膽固醇氧化酶前后的發光差分圖；C為圖A和B的疊加圖;?為選中的兩個細胞的活化膜膽固醇的分布的偽彩色圖；Ε為ACAT和HMGCoA共同被抑制的細胞在加入膽固醇氧化酶前后的發光差分圖；F為ACAT被抑制的細胞和ACAT、HMGCoA共同被抑制的細胞發光強度柱狀圖；其中，圖中的偏差為圖B和圖E中細胞區域的發光強度的標準偏差;
[0033] 圖8為ITO電極上ACAT、HMGCoA同時被抑制的Hela細胞加入200 μ M L012的檢測圖像，其中，A為明場照片；B為加入IU / ml膽固醇氧化酶前后發光差分圖《為明場圖和差分圖的疊加圖。
【具體實施方式】
[0034]本發明的電致化學發光成像裝置的示意圖如圖1所示，包括物鏡、光傳輸通道、單光子檢測電子倍增CCD和電致化學發光發生器，所述電致化學發光發生器包括ITO電極、銀電極和電壓發生器，其中，物鏡、光傳輸通道和單光子檢測電子倍增CXD依次連接，所述ITO電極與電壓發生器的正極相連，銀電極和電壓發生器的負極相連。在下述各實施例中，除非另外說明，各個ITO電極上粘貼的作為溶液室的O型圈的直徑均為1cm，檢測的溶液量為600 μ L。
[0035]實施例1溶液中雙氧水的可視化檢測。
[0036](I)檢測條件的確定。
[0037]在實驗中，在氧化銦錫(ITO)玻璃片上粘貼直徑為Icm的O型圈作為溶液室，并以該ITO玻璃片為工作電極，選擇L012作為正電壓下的發光物質。L012是一種魯米諾類似物，在雙氧水存在下具有比魯米諾更高的發光效果，所以被選作正電壓下的發光物質。向O型圈內滴加200 μ M的L012和100 μ M的雙氧水，共計600 μ L。鑒于L012和雙氧水在ITO玻璃電極上的發光峰值電壓為1.0V(其中，1.0V為雙氧水在ITO電極表面上電分解的峰值電壓，然后產生的氧自由基使得L012發光，所以對不同的發光試劑，發光峰值電壓都差不多，因此，對于其他的發光試劑，如魯米諾、N-(4-氨基丁基)-N-乙基異魯米諾，N-(6-氨基已基)-N-乙基異魯米諾、異硫氰酸異魯米諾等的發光電壓均在0.9V?1.1V之間)，因此在CCD曝光的同時在電極上施加1.0V恒電壓使得L012和雙氧水得到最大的發光強度。然而，在電極上持續施加這樣的高壓會導致電極失活，不利于發光。為了避免電極失活，我們在電極上施加一個負電壓-1.0V，使得電極更新恢復。因此電極電壓采用1.0V和-1.0V轉換模式來獲得更多的發光信號。每一個電壓轉換周期包括2s的1.0V電壓,再轉換施加0.5s的-1.0V電壓。和恒電壓模式相比，這種組合電壓模式可以使得L012-雙氧水獲得更強的發光效果(如圖2所示)。這種組合電壓模式對發光效果的放大表明了它對于ECL成像的重要性。發光效果會因為曝光時間的延長進一步得到增強。但是對于單細胞成像來說，最短的曝光時間可以獲得更好的時間分辨率。為了平衡這兩個參數比較了不同的電壓頻率和不同的曝光時間對成像信噪比的影響，如圖3所示。最終我們選擇了 5s的曝光時間，也就是兩個電壓周期作為成像實驗的參數。
[0038](2)電致化學發光成像裝置可視化檢測雙氧水。
[0039]用一張膠帶貼在ITO玻璃片表面，利用加電壓條件下裸露的ITO會發光，而被膠帶覆蓋的地方不會發光這樣的現象，來驗證用本發明的電致化學發光成像裝置來可視化檢測雙氧水是可行的。圖4A顯示了明場下玻璃裸露區域和膠帶區域的邊界。在玻璃裸露區域和膠帶區域的邊界處粘貼Icm的O型圈作為溶液室，使玻璃裸露區域和膠帶區域各占一半。在無雙氧水的情況下，L012會在電壓作用下自發光，向ITO表面的O型溶液室內加入200 μ M的L012，記錄在黑暗環境下L012的背景光。結果如圖4Β所示。和預期的一樣，在ITO裸露區域拍到了微弱的發光，而膠帶區域則是全黑。當加入了 10 μ M的雙氧水之后，繼續在黑暗環境下拍照(圖4C)。為了測定雙氧水產生的發光強度，利用軟件Image J來計算圖4B與圖4C之間的差別，差分圖用偽彩色染色之后，如圖4D所示。由L012和雙氧水產生的反應導致在ITO裸露區域得到更高的光強，證明我們的系統能夠有效的觀測到低濃度的雙氧水。明場照片和發光差分圖的膠帶邊緣形狀的一致性說明電致化學發光成像的精確度。在ITO區域隨機選取直徑為50 μ m的區域計算發光強度，得到的光強相對偏差為2.63%。得到的光強的均一性保證了檢測在ITO不同區域培養細胞，并進行成像分析的精確性。
[0040]本發明電致化學發光成像裝置的空間分辨率由物鏡和CXD控制。盡管擁有較大數值孔徑(N.A.)的高倍率物鏡可以增加收光效率，越高放大倍率會導致每個像素呈現的實際尺寸越小，從而使得每個像素得到的光強降低至檢測限以下。在本檢測體系中，物鏡是N.A為0.50的20倍鏡作為最佳選擇。同時，為了收集弱發光，采用了低分辨率(512X512)的單光子檢測電子倍增CXD (EM (XD)。由于CXD每個像素16 μ m,物鏡為20倍放大，所以計算得到檢測體系的空間分辨率為0.8 μ m。本成像裝置可以通過增大物鏡倍率實現0.4 μ m的成像質量，但是需要通過延長曝光時間或者增加雙氧水濃度來獲得。考慮到我們需要低檢測限和短曝光時間，物鏡的倍率仍然被固定在20倍，所獲取的0.8 μ m的空間分辨率也適合于單細胞分析。
[0041](3)雙氧水的濃度和組合電壓對ECL成像的影響。
[0042]為了檢測雙氧水濃度和發光強度之間的關系，固定L012的濃度為200 μ Μ，在檢測體系中不斷升高雙氧水濃度并完成成像過程。在扣除了沒有雙氧水存在的背景光之后，發光強度根據雙氧水的濃度不同而不同，如圖4Ε所示。發光強度和雙氧水濃度之間的正相關關系表明圖像的光強度可以反映出局部的雙氧水濃度，最低可見的雙氧水濃度為10 μ Μ。作為對比，在電極上施加1.0v的恒電壓的條件下，最低可見雙氧水濃度為50 μ M0這一可視檢測限的改進確定了使用組合電壓用于ECL成像的重要性。
[0043]實施例2單細胞表面外泄雙氧水的可視化檢測。
[0044]單細胞外泄雙氧水成像是將100-5000個Hela細胞培養在ITO玻璃片上的溶液室中，然后用IOyUOng / ml的巴豆醇-12-十四烷酸酯-13-乙酸酯(PMA，Phorbol 12-myristate-13_acetate,簡稱佛波酯,購買自 sigma-aldrich,貨號為 P8139)刺激產生雙氧水。據報導，PMA會刺激細胞內的NADPA氧化酶而使得雙氧水量積累,從而導致雙氧水外泄。根據相同的成像步驟，得到了在L012存在條件下的明場圖和背景圖(圖5A和5B)。在發光圖中，由于細胞貼附在電極表面阻礙了 L012擴散到電極表面，從而呈現為較暗的強度。細胞在PMA刺激以后釋放出雙氧水后，立刻拍照，得到一張發光圖(圖5C)。通過將圖5C扣除背景圖5B，得到圖中細胞變亮(圖OT)。細胞發光應該不是由擴散到細胞上的氧自由基與L012接觸產生的，因為從疊加圖上看在細胞周圍并沒有發光現象(圖5E)。在排除了自由基擴散導致發光的可能性之后，細胞底部存在L012就是對此現象的唯一解釋。對于貼壁細胞，細胞膜的褶皺被認為會在細胞底部和支撐物表面形成微小的空間，從而造成了 L012在細胞和電極之間的存在。經過刺激之后，細胞底部表面釋放的雙氧水在電壓作用下產生自由基，并與細胞底部的L012發生反應，產生發光。采用軟件ImageJ，通過對每個像素光強的計算，參考圖4E中的光強信號，細胞表面拍到的光強通過標記不同顏色來轉換成雙氧水的濃度在10?30 μ M(圖5F)。該結果顯示出雙氧水外泄的不均勻性。
[0045]在對照組實驗中用ρΗ7.4的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)替代ΡΜΑ，使得細胞不會受到刺激。其成像圖片如圖6所示。減去了背景之后的發光圖顯示沒有任何光增強情況出現在細胞區域。對照組細胞沒有任何雙氧水釋放，所以正如預期的，這些細胞沒有發光。發光強度和雙氧水外泄的相關性表明我們的實驗方法是可以為不同狀態下的細胞釋放的雙氧水提供其存在亞微米分布的依據。
[0046]和電化學掃描顯微鏡對細胞雙氧水成像相比，使用電致化學發光成像方法有著裝置簡單和可以平行快速檢測的優勢。對于電致化學發光成像，將培養細胞的ITO電極放置于顯微鏡平臺上檢測，電極不需要進一步修飾。這種簡單的方法可以促進電致化學發光分析技術用于生物研究。同時，可以同時獲得ITO表面所有細胞的發光信息加大了檢測的通量，這對于單細胞檢測是十分有意義的。6個細胞的發光信號顯示的對于平均光強的標準偏差為10.0%，這反映出不同細胞外泄的雙氧水量的波動較小。
[0047]實施例3單細胞表面分子的電致化學發光成像。
[0048]除了可以對細胞釋放的雙氧水進行成像，本發明的電致化學發光成像方法還可以利用細胞表面的分子對應的氧化酶將它們轉化為雙氧水，從而實現對細胞表面分子的成像。為了證明可對細胞表面分子成像，我們選擇了膽固醇作為模板分子，檢測細胞膜活化膽固醇分子的分布。活化膽固醇具有較高的化學勢(逃離趨勢)，它對細胞膜膽固醇運輸具有重要作用。雖然細胞膜膽固醇已經可以利用熒光膽固醇類似物或者flipin來成像，但是因為這些熒光探針無法區分活化膽固醇和非活化膽固醇，因此細胞表面活化膽固醇從未被成功成像。而本發明的電致化學發光方法可以利用活化膽固醇與膽固醇氧化酶反應生成雙氧水這一特性，通過ECL成像的方法來對活化膽固醇進行成像。實驗中，細胞首先在含有sandoz58035 (購買于sigma-aldrich,貨號為S9318)的培養液中處理過夜,通過抑制酰基輔酶 a_ 膽固醇酸基轉移酶(acyl-coA / cholesterol acyltransferase) (ACAT)蛋白，實現更多的膽固醇在細胞膜中積累，從而增加膽固醇的活性。當細胞暴露在膽固醇氧化酶和L012環境中，這兩個物質都會擴散至細胞底部的微小空隙中。當膽固醇氧化酶和活化膽固醇反應產生雙氧水后，施加電壓就會實現電致化學發光成像。明場和加入膽固醇氧化酶之后的發光差異圖分別如圖7A，7B所示。從圖7B來看，細胞表面出現比周圍更亮的光強度，展示我們可以看到細胞表面的活化細胞膜膽固醇。從加入了偽彩色的圖7C和局部放大圖(圖7D)上可以看到細胞表面的活化膽固醇分布存在一定的不均勻度。
[0049]陰性對照組的實驗使用他汀類藥物來對ACAT被抑制的細胞中的3-hydroxy-3_methylglutaryl-CoA(3-輕基-3-甲基戍二酰輔酶A還原酶,HMGCoA)的活性進行抑制,導致減少細胞內的膽固醇合成從而減低細胞膜上的活化膽固醇。發光強度的差分圖如圖7E以及圖8中的明場照片和疊加照片所示。從HMGCoA和ACAT同時被抑制得到細胞發光圖可以知道，雖然這類細胞中的細胞內膽固醇和膜膽固醇總量大大降低，但是活化膽固醇依然存在。和ACAT被抑制的細胞發光相比，HMGCoA, ACAT同時被抑制的細胞產生的弱發光證明了 ECL成像方法可以為藥物分析提供活化膜膽固醇的分布信息。本次對細胞活化膽固醇的成像為細胞膽固醇運輸研究提供了更多的生物學信息。
[0050]綜上所述，本發明采用了一套空間分辨率為0.8 μ m的ECL成像系統對細胞外泄的雙氧水和細胞膜活化膽固醇進行了成像。電極表面細胞發光可以使得多個細胞同時成像，因此這一套簡單的系統擁有高檢測通量。后續研究將著眼于更高效的ECL發光探針來增加發光強度來達到更高的信噪比以獲得更高分辨率的單細胞成像圖。
【權利要求】
1.一種電致化學發光成像裝置，其特征在于，包括物鏡、光傳輸通道、單光子檢測電子倍增CCD和電致化學發光發生器，所述電致化學發光發生器包括ITO電極、銀電極和電壓發生器，其中，所述物鏡、光傳輸通道和單光子檢測電子倍增CXD依次連接；所述ITO電極與電壓發生器的正極相連，銀電極和電壓發生器的負極相連。
2.權利要求1所述的電致化學發光成像裝置在可視化檢測雙氧水中的應用。
3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于，包括如下步驟:將發光試劑和雙氧水加入到O型圈內，在單光子檢測電子倍增CCD曝光的同時向ITO電極施加周期性的發光電壓-恢復電壓，檢測成像效果。
4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，所述的發光試劑為L012、魯米諾、N-(4-氨基丁基)-N-乙基異魯米諾，N-(6-氨基已基)-N-乙基異魯米諾和異硫氰酸異魯米諾中的任意一種，用量為ΙΟΟμΜ?500μΜ。
5.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，所述雙氧水的檢測范圍為10?200μ Μ。
6.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，單光子檢測電子倍增CCD曝光的時間為兩個發光電壓-恢復電壓周期，其中，一個發光電壓-恢復電壓周期為:發光電壓:1.0±0.1V的正電壓下2± Is ;恢復電壓:-1.0±0.1V的負電壓下0.5±0.25s。
7.權利要求1所述的裝置在可視化檢測單細胞表面外泄雙氧水中的應用。
8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于，包括如下步驟:在ITO玻璃片的表面粘貼O型圈作為溶液室，以ITO玻璃片為工作電極，銀電極為對電極，將細胞在溶液室中培養，向溶液室中加入發光試劑，然后加入PMA刺激細胞內的NADPA氧化酶使細胞表面產生雙氧水，在單光子檢測電子倍增CCD曝光的同時向ITO電極施加周期性的發光電壓-恢復電壓，檢測成像效果。
9.根據權利要求8所述的應用，其特征在于，所述的發光試劑為L012、魯米諾、N-(4-氨基丁基)-N-乙基異魯米諾，N-(6-氨基已基)-N-乙基異魯米諾和異硫氰酸異魯米諾中的任意一種，用量為ΙΟΟμΜ?500μΜ。
10.根據權利要求8所述的應用，其特征在于，單光子檢測電子倍增CCD曝光的時間為兩個發光電壓-恢復電壓周期，其中，一個發光電壓-恢復電壓周期為:發光電壓:`1.0±0.1V的正電壓下2± Is ;恢復電壓:-1.0±0.1V的負電壓下0.5±0.25s。
11.權利要求1所述的裝置在可視化檢測細胞表面分子上的應用。
12.根據權利要求11所述的應用，其特征在于，包括如下步驟:在ITO玻璃片的表面粘貼O型圈作為溶液室，以ITO玻璃片為工作電極，銀電極為對電極，將細胞在溶液室中培養，向溶液室中加入發光試劑，利用細胞表面的待測分子對應的氧化酶將所述待測分子轉化為雙氧水，在單光子檢測電子倍增CCD曝光的同時向ITO電極施加周期性的發光電壓-恢復電壓，檢測成像效果。
13.根據權利要求12所述的應用，其特征在于，所述的發光試劑為L012、魯米諾、N- (4-氨基丁基)-N-乙基異魯米諾，N- (6-氨基已基)-N-乙基異魯米諾和異硫氰酸異魯米諾中的任意一種，用量為ΙΟΟμΜ?500μΜ。
14.根據權利要求12所述的應用，其特征在于，單光子檢測電子倍增CCD曝光的時間為兩個發光電壓-恢復電壓周期，其中，一個發光電壓-恢復電壓周期為:發光電壓:`1.0±0.1V的正電壓下2 ± Is ;恢復電壓:-1.0±0.1V的負電壓下0.5±0.25s。
【文檔編號】G01N21/76GK103913447SQ201410126893
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2014年3月31日 優先權日:2014年3月31日
【發明者】方丹君, 江德臣, 周俊宇 申請人:南京醫科大學
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