一種測試細葉黃皮提取物抑菌活性的方法
【專利摘要】本發明公開了一種測試細葉黃皮提取物抑菌活性的方法，采用紙片擴散法，抑菌測試細葉黃皮果實、葉的乙醇提取物及其石油醚部位、氯仿部位、乙酸乙酯部位對綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、殺螟桿菌、大腸桿菌的抑制作用；通過傾注平板法測定細葉黃皮根乙醇提取物及石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位對綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、殺螟桿菌、大腸桿菌的抑制作用；得出了細葉黃皮果實、葉、根的乙醇提取物及石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草桿菌及殺螟桿菌均有抑制作用，對革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌均有抑制作用，具有廣譜抑菌作用，用于消炎藥、含片、飲料、食品添加劑、濕紙巾等的制作。
【專利說明】一種測試細葉黃皮提取物抑菌活性的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于臨床醫學【技術領域】，尤其涉及一種測試細葉黃皮提取物抑菌活性的方法。
【背景技術】
[0002]細葉黃皮(Clausena anisum-olens (Blanco)Merr.),蕓香科植物，俗稱雞皮果，又名細葉黃皮，為柑桔亞科黃皮屬多年生常綠大灌木或小喬木，主要分布于南亞熱帶地區，主產我國廣西西南部、云南南部、廣東新會及越南北部和菲律賓。細葉黃皮為珍稀佳果，果皮、果肉、果仁均可食用，含有多種氨基酸、維生素及礦物質。在藥用方面，果實可助食消暑、消積去滯、祛痰化氣、疏通腸胃；枝葉可人藥，有引氣、健胃、止痛、跌打刀傷、消風腫、去疳積等功能。
[0003]細葉黃皮果實含17種氨基酸、多種維生素以及豐富的鐵、鈣等營養元素，營養價值高。此外，細葉黃皮枝葉、果實、根莖還具有祛痰化氣、消積消滯等藥效，有很好的保健功效。
[0004]廣西有豐富的細葉黃皮果資源，主要分布在龍州、大新、寧明、扶綏等縣。廣西西南部群眾常將其作調配香料，加工成果皮干、果醬，用于肉類、糕點制作的增香調料。副產品開發種類有限，產品附加值低，為促進當地農民增收，加快少數民族地區脫貧的步伐，對細葉黃皮進行綜合利用、提高資源利用率、深層次的開發研究迫在眉睫。
[0005]目前，有關細葉黃皮的化學成分研究已有報道，(汪云松，沈月毛，何紅平.河口細葉黃皮化學成分研究[J].有機化學，2003，23(增刊):144.)等從細葉黃皮中提取分離了 5 個化合物，分別為 4_ (3-methoxyphenyl_4-0—D-glucopyanoside) _2_butanone,3- (4-hydroxyphenyl)-2-propenoic acid,3_ (3-methoxyphenyl-4-hydroxy)-2-propenoic acid,3_ (3-methoxypheny1-4-hydroxy)-2-propenoic acid,3_(3,4-dihydroxyphenyl)-2-propenoic methyl ester,3-hydroxy-4-methoxybenzoic acid。Wang Yun-song[ffangY S, Huang R, LI N Z al.Coumarins from Clausum-olens Merr[J].Biosci Biotechnol Biochem, 2010, 74(7):100143-1-2.]等從細葉黃皮中提取到 7 個化合物，分別為 anisumarin、isoscopoletin、umbelliferone、anisocoumarin H、capnolactone、aurapten 及 7_[ (E)-7' -hydroxy-3' , I' -dimethylocta-2' ，5-dienyloxy]-coumar。(蘇秀芳.GC-MS法分析雞皮果葉揮發油的化學成分[J].安徽農業科學，2008，36 (25):10956-10957.[5]蘇秀芳，梁振益.GC-MS法分析山黃皮莖根揮發油的化學成分[J].時珍國醫國藥2010，21 (6):1540-1542.)等研究表明，細葉黃皮各個部分都含有豐富的揮發油，其主要成分為:芳香類、烯類及酸類。有關細葉黃皮的抑菌活性研究鮮見有報道。
【發明內容】
[0006]本發明實施例的目的在于提供一種測試細葉黃皮提取物抑菌活性的方法，旨在解決缺少有關細葉黃皮對抑菌活性方法的問題。[0007]本發明實施例是這樣實現的，一種測試細葉黃皮提取物抑菌活性的方法，該測試細葉黃皮提取物抑菌活性的方法包括:
[0008]采用紙片擴散法，抑菌測試細葉黃皮果實、葉的乙醇提取物及其石油醚部位、氯仿部位及乙酸乙酯部位對綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、殺螟桿菌、大腸桿菌的抑制作用；通過傾注平板法測定細葉黃皮根乙醇提取物及其石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位對綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、殺螟桿菌、大腸桿菌的抑制作用；得出了細葉黃皮果實、葉、根乙醇提取物及其石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位對綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草桿菌、殺螟桿菌及枯草桿菌均有抑制作用。
[0009]進一步，采用傾注平板法測試細葉黃皮提取物抑菌活性的方法包括以下步驟:
[0010]步驟一，細葉黃皮根提取物的提取，把細葉黃皮根自然晾干，粉碎，用30%的乙醇浸泡10天，減壓蒸餾至浸膏狀，得到乙醇提取物，一部分留作實驗，一部分依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取，得到各部位浸膏，置4°C冰箱保存備用；
[0011]步驟二，受試液的制備，分別取細葉黃皮根乙醇提取物及其石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位，用溶劑和經滅菌處理的含5% Tween-80的蒸餾水混合，配制成系列濃度受試液，供最低抑菌濃度測定用；
[0012]步驟三，菌液的制備，分別用無菌棉簽蘸取金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、殺螟桿菌、大腸桿菌接種于牛肉膏蛋白胨液體培養基，于35°C下搖床培養18h，進行菌種活化；稀釋活化后的菌懸液，進行活菌計數，取得最佳菌懸液濃度約為IO6Cfu.mL-1濃度的細胞懸浮液；
[0013]步驟四，傾注平板法測定最低抑菌濃度，用移液槍吸取不同濃度的受試液各2mL，分別放于無菌空培養皿內，加入融化后并冷卻的瓊脂培養基13mL，最終體積為15ml，立即混勻，使4種受試液在培養基中的終濃度依次為40mg / mL、20mg/mL、10mg / mL、5mg / mL、
2.5mg / mL、1.25mg / mL、0.63mg/mL、0.31mg / mL、0.16mg/mL ;
[0014]步驟五，待凝固后，用移液槍從5種配置好的菌液中吸取IOOuL,放入到相應的培養皿中，然后進行均勻涂布，于35°C恒溫培養，24h后觀察結果；如果培養皿無菌落形成則說明有抑菌作用，開始明顯長菌則說明該濃度接近MIC值。
[0015]進一步，細葉黃皮根乙醇提取物及其石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位對金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、殺螟桿菌、大腸桿菌都具有較強的抑制作用，三個部位對金黃色葡萄球菌的抑制作用最強，最低抑菌劑量分別為1.25,5.0及2.5mg / mL ;三個部位中石油醚部位對5種供試菌的最低抑菌劑量均為1.25mg / mL，其次是乙酸乙酯部位。
[0016]進一步，采用紙片擴散法測定測試細葉黃皮提取物抑菌活性的方法包括以下步驟:
[0017]步驟一，細葉黃皮提取物的提取，細葉黃皮果實及葉洗凈，陰干，粉碎，用30%的乙醇浸泡15天，減壓蒸餾至浸膏狀，得到乙醇提取物，一部分留作實驗，一部分依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取，得到各部位浸膏；
[0018]步驟二，細菌懸液的制備，分別用無菌棉簽蘸取供試菌綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、殺螟桿菌、大腸桿菌接種于牛肉膏蛋白胨液體培養基，于35°C下搖床培養18h，進行菌種活化；稀釋活化后的菌懸液，并進行活菌計數；用無菌水將細菌分別配制成約IO6Cfu.mL—1濃度的細胞懸浮液。
[0019]步驟三，抑菌圈的測定，把小濾紙片放入干燥培養皿中，在120°C下滅菌15min ;將培養基倒入培養皿中，待培養基自然冷卻凝固后，用移液槍從每種菌種吸取lOOuL，放入到相應的培養皿中，涂布均勻；將試藥浸泡過的濾紙片置于平板內，于35°C培養，18?24h后觀察結果；有明顯抑菌的測抑菌圈的直徑。
[0020]進一步，細葉黃皮果實及葉的乙醇提取物，濃度為1.32mg /片對綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、殺螟桿菌、大腸桿菌5種供試菌具有較強的抑制作用，果實乙醇提取物的石油醚部位、氯仿部位、乙酸乙酯部位，濃度為1.32mg /片對綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、殺螟桿菌、大腸桿菌5種供試菌有抑制作用；葉乙醇提取物的石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位在相同濃度下對綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、殺螟桿菌、大腸桿菌5種供試菌均有抑制作用。
[0021]進一步，細葉黃皮果實乙醇提取物的石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位劑量為0.103mg/片以上時對金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、大腸桿菌、殺螟桿菌、枯草桿菌均有抑制作用，乙酸乙酯部位抑菌活性最強，對金黃色葡萄球菌及大腸桿菌最敏感，最小抑菌劑量分別為0.006及0.013mg /片；細葉黃皮葉石油醚、氯仿、乙酸乙酯及正丁醇部位對金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、大腸桿菌、殺螟桿菌、枯草桿菌5種供試菌均有抑制作用，其中乙酸乙酯部位對金黃色葡萄球菌抑制作用最強，最小抑菌劑量為0.026mg /片。
[0022]進一步，該細葉黃皮果實、葉、根的乙醇提取物對革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌均有抑制作用，具有廣譜的抑菌作用，基于此，細葉黃皮果實、葉、根用于消炎藥、含片、飲料、果汁、食品添加劑、營養粉、功能食品、飼料、飼料添加劑、茶、洗面奶、早霜、晚霜、乳液、祛痘水、消炎水、面膜、洗發水(露)、洗衣液(乳)、洗衣粉、肥皂、洗手液(乳)、淋浴液(乳)、牙膏、牙膏添加劑、酒類、農藥、殺蟲劑、消毒劑、濕紙巾的制作。
[0023]本發明提供的測試細葉黃皮提取物抑菌活性的方法，采用紙片擴散法，抑菌測試細葉黃皮果實、葉的乙醇提取物及其石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位對綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、殺螟桿菌、大腸桿菌的抑制作用；通過傾注平板法測定細葉黃皮根乙醇提取物及其石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位對金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、殺螟桿菌、大腸桿菌的抑制作用；得出了細葉黃皮果實、葉、根的乙醇提取物及其石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草桿菌、殺螟桿菌及枯草桿菌均有抑制作用，為綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草桿菌及殺螟桿菌類疾病的臨床治療提供了參考依據。本發明的方法簡單，為利用細葉黃皮資源有著非常重要的理論意義和實際應用價值，也可為今后更好地應用于臨床提供科學依據。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0024]圖1是本發明實施例提供的采用傾注平板法測定測試細葉黃皮提取物抑菌活性的方法的流程圖；
[0025]圖2是本發明實施例提供的采用紙片擴散法測定測試細葉黃皮提取物抑菌活性的方法的流程圖。
【具體實施方式】
[0026]為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。
[0027]下面結合附圖及具體實施例對本發明的應用原理作進一步描述。
[0028]本發明提供的測試細葉黃皮提取物抑菌活性的方法，采用紙片擴散法，抑菌測試細葉黃皮果實、葉的乙醇提取物及其石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位對綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、殺螟桿菌、大腸桿菌的抑制作用；得出了細葉黃皮果實的乙醇提取物及其石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位對綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯殺螟桿菌及枯草桿菌均有抑制作用；得出了細葉黃皮葉的乙醇提取物及其石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位對綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯殺螟桿菌及枯草桿菌均有抑制作用；
[0029]通過傾注平板法測定細葉黃皮根乙醇提取物及其石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位對綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、殺螟桿菌、大腸桿菌的抑制作用；
[0030]如圖1所示，本發明實施例的采用傾注平板法測試細葉黃皮提取物抑菌活性的方法包括以下步驟:
[0031]SlOl:把細葉黃皮根自然晾干，粉碎，用30%乙醇浸泡10天，減壓蒸餾至浸膏狀，得到乙醇提取物，一部分留作實驗，一部分依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取，得到各部位浸膏，置4°C冰箱保存備用；
[0032]S102:受試液的制備，分別取細葉黃皮根乙醇提取物及其石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位，用溶劑和經滅菌處理的含5% Tween-80的蒸餾水混合，配制成系列濃度受試液，供最低抑菌濃度測定用；
[0033]S103:菌液的制備，分別用無菌棉簽蘸取金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、殺螟桿菌、大腸桿菌接種于牛肉膏蛋白胨液體培養基，于35°C下搖床培養18h，進行菌種活化。稀釋活化后的菌懸液，進行活菌計數，取得最佳菌懸液濃度約為IO6Cfu.mL-1濃度的細胞懸浮液；
[0034]S104:傾注平板法測定最低抑菌濃度，用移液槍吸取不同濃度的受試液各2mL，分別放于無菌空培養皿內，加入融化后冷卻瓊脂培養基13mL，其最終體積為15ml，立即混勻，使4種受試液在培養基中的終濃度依次為40mg / mL、20mg / mL、10mg / mL、5mg / mL、
2.5mg / mL、L 25mg/mL、0.63mg / mL、0.31mg / mL、0.16mg / mL ；
[0035]S105:待凝固后，用無菌移液槍分別吸取5種新鮮培養的菌液lOOuL。待培養基凝固后，即成含不同濃度受試品的瓊脂平板。用移液槍從5種配置好的菌液中吸取IOOuL,放入到相應的培養皿中，然后進行均勻涂布，于35°C左右恒溫培養，24h后觀察結果。如果培養皿無菌落形成則說明有抑菌作用，開始明顯長菌則說明該濃度接近MIC值。
[0036]本發明的采用傾注平板法測試細葉黃皮提取物抑菌活性的方法具體包括以下步驟:
[0037]1、材料:
[0038]SPH-210A恒溫培養振蕩器；LDZX_50KBS型立式電熱壓力蒸汽滅菌器；ZHJH-Cl214B型垂直流超凈工作臺；GNP_9270型隔水式恒溫培養箱；
[0039]氯化鈉、瓊脂粉、牛肉膏、蛋白胨、氫氧化鈉、丙酮、5% Tween-80的蒸餾水；供試菌種:綠膿桿菌，金黃色葡萄球菌，枯草桿菌，大腸桿菌，殺螟桿菌；細葉黃皮根于2010年5月采自于崇左市，自然晾干，粉碎備用；
[0040]2、方法:[0041 ] 2.1細葉黃皮根提取物的提取:
[0042]把細葉黃皮根自然晾干，粉碎，用乙醇浸泡3天，減壓蒸餾至浸膏狀，得到乙醇提取物，一部分留作實驗，一部分依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取，得到各部位浸膏，置4°C冰箱保存備用；
[0043]2.2受試液的制備:
[0044]分別取細葉黃皮根乙醇提取物及其石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位，用溶劑和經滅菌處理的含5% Tween-80的蒸懼水混合,配制成系列濃度受試液,供最低抑菌濃度(MIC)測定用；
[0045]2.3菌液的制備:
[0046]分別用無菌棉簽蘸取供試菌接種于牛肉膏蛋白胨液體培養基，于35°C下搖床培養18h，進行菌種活化。稀釋活化后的菌懸液，進行活菌計數，取得最佳菌懸液濃度約為IO6Cfu.mL—1濃度的細胞懸浮液；
[0047]2.4傾注平板法測定最低抑菌濃度:
[0048]用移液槍吸取不同濃度的受試液各2mL，分別放于無菌空培養皿內，加入融化后冷卻的瓊脂培養基13mL，其最終體積為15ml，立即混勻，使4種受試液在培養基中的終濃度依次為 40mg / mL、20mg / mL、10mg / mL、5mg / mL、2.5mg / mL> 1.25mg / mL、0.63mg / mL、
0.3Img / mL、0.16mg / mL ;待凝固后，用無菌移液槍分別吸取5種新鮮培養的菌液lOOuL。待培養基凝固后，即成含不同濃度受試品的瓊脂平板。用移液槍從5種配置好的菌液中吸取IOOuL,放入到相應的培養皿中，然后進行均勻涂布，于35°C左右恒溫培養，24h后觀察結果。如果培養皿無菌落形成則說明有抑菌作用，開始明顯長菌則說明該濃度接近MIC值。
[0049]3、結果與分析:
[0050]按照上述試驗方法，用溶劑與含5% Tween-80的蒸餾水混合，將細葉黃皮乙醇提取物及其石油醚、氯仿、乙酸乙酯部位依次對半稀釋，形成8個系列的濃度，做MIC試驗研究。
[0051]實驗結果表明，細葉黃皮根乙醇提取物及其石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位對金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、殺螟桿菌、大腸桿菌、綠膿桿菌都具有較強的抑制作用。三個部位中石油醚部位對金黃色葡萄球菌的抑制作用最強，最低抑菌劑量分別為1.25、5.0及2.5mg / mL ;三個部位中石油醚部位對5種供試菌的低抑菌劑量均為1.25mg / mL，其次是乙酸乙酯部位。
[0052]本發明實施例的采用紙片擴散法測定測試細葉黃皮果實、葉提取物抑菌活性的方法包括以下步驟:
[0053]S201:細葉黃皮提取物的提取，細葉黃皮果實及葉洗凈，陰干，粉碎，用30%的乙醇浸泡15天，減壓蒸餾至浸膏狀，得到乙醇提取物，一部分留作實驗，一部分依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取，得到各部位浸膏。
[0054]S202:細菌懸液的制備，分別用無菌棉簽蘸取供試菌接種于牛肉膏蛋白胨液體培養基，于35°C下搖床培養18h，進行菌種活化。稀釋活化后的菌懸液，并進行活菌計數。用無菌水將細菌分別配制成約IO6Cfu.mL—1濃度的細胞懸浮液。
[0055]S203:抑菌圈的測定,把小濾紙片放入干燥培養皿中，在120°C下滅菌15min。將培養基倒入培養皿中，待培養基自然冷卻凝固后，用移液槍從每種菌種吸取lOOuL，放入到相應的培養皿中，涂布均勻。將試藥浸泡過的濾紙片置于平板內，于35°C左右培養，18~24h后觀察結果。有明顯抑菌的測其抑菌圈的直徑。
[0056]本發明的具體步驟為:
[0057]1、儀器與材料:
[0058]1.1 儀器:
[0059]ZHJH-C1214B型垂直流超凈工作臺；LDZX_50KBS型立式電熱壓力蒸汽滅菌器；GNP-9270型隔水式恒溫培養箱；SPH-211B搖床培養箱。
[0060]1.2 菌種:
[0061]綠膿桿菌，金黃色葡萄球菌，枯草桿菌，大腸桿菌，殺螟桿菌
[0062]1.3細葉黃皮果實材料的來源:
[0063]細葉黃皮果實及葉摘自廣西龍州縣響水鎮。[0064]2、方法:
[0065]2.1細葉黃皮果實乙醇提取物及各部位提取物的提取:
[0066]細葉黃皮果實及葉洗凈，陰干，粉碎，用30%的乙醇浸泡15天，減壓蒸餾至浸膏狀，乙醇浸膏一部分留做抑菌實驗，一部分依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯及正丁醇萃取，得到各部位浸膏。
[0067]2.2抑菌實驗:
[0068]2.2.1細菌懸液的制備:
[0069]分別用無菌棉簽蘸取供試菌接種于牛肉膏蛋白胨液體培養基，于35°C下搖床培養18h，進行菌種活化。稀釋活化后的菌懸液，并進行活菌計數。用無菌水將細菌分別配制成約IO6Cfu.mL—1濃度的細胞懸浮液。
[0070]2.2.2抑菌圈的測定:
[0071]把小濾紙片^mm)放入干燥培養皿中，在120°C下滅菌15min。將培養基倒入培養皿中，待培養基自然冷卻凝固后，用移液槍從每種菌種吸取IOOuL，放入到相應的培養皿中，涂布均勻。將試藥浸泡過的濾紙片置于平板內，于35°C培養，18~24h后觀察結果。有明顯抑菌的測其抑菌圈的直徑。
[0072]3、結果與討論:
[0073]3.1抑菌活性初篩:
[0074]按照上述試驗方法，發現細葉黃皮果實及葉的乙醇提取物對5種供試菌具有較強的抑制作用，為了了解抑菌物質所存在的部位，特做了乙醇提取物的石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位初步抑菌實驗，結果表明，果實的乙醇提取物的石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位對5種供試菌有抑制作用；葉的乙醇提取物的石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位在相同濃度下對5種供試菌均有抑制作用。
[0075]3.2提取物的最低抑菌劑量研究:
[0076]為了了解乙醇提取物及其各個部位的抑菌活性強弱，用溶劑溶解乙醇提取物及其石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位，稀釋，浸泡濾紙片，按照2.2.2進行抑菌活性檢測，同時算出濾紙片所含的藥液量。
[0077]實驗結果表明，細葉黃皮果實乙醇提取物的石油醚部位、氯仿部位、乙酸乙酯部位劑量為0.103mg/片以上時對金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、大腸桿菌、殺螟桿菌、枯草桿菌均有抑制作用，其中乙酸乙酯部位抑菌活性最強，其對金黃色葡萄球菌及大腸桿菌最敏感，最小抑菌劑量分別為0.006及0.013mg/片；細葉黃皮葉乙醇提取物的石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位對5種供試菌均有抑制作用，其中乙酸乙酯部位對金黃色葡萄球菌抑制作用最強，最小抑菌劑量為0.026mg /片。
[0078]4、結果:
[0079]細葉黃皮果實的乙醇提取物對革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌均有抑制作用，抑菌成分主要在石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位。乙酸乙酯部位對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、殺螟桿菌及枯草桿菌作用較強，最小抑菌劑量為0.006mg /片；細葉黃皮葉乙醇提取物的石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位對5種供試菌均有抑制作用，其中乙酸乙酯部位對金黃色葡萄球菌抑制作用最強，最小抑菌劑量為0.026mg /片。
[0080]綠膿桿菌為革蘭氏陰性菌，其耐藥性強，難以尋找治療藥物，實驗結果表明，細葉黃皮果實乙醇提取物的氯仿部位、乙酸乙酯部位及細葉黃皮葉乙醇提取物的乙酸乙酯部位對其抑制作用較大。該細葉黃皮果實、葉、根的乙醇提取物對革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌均有抑制作用，具有廣譜的抑菌作用，基于此，細葉黃皮果實、葉、根用于消炎藥、含片、飲料、果汁、食品添加劑、營養粉、功能食品、飼料、飼料添加劑、茶、洗面奶、早霜、晚霜、乳液、祛痘水、消炎水、面膜、洗發水(露)、洗衣液(乳)、洗衣粉、肥皂、洗手液(乳)、淋浴液(乳)、牙膏、牙膏添加劑、酒類、農藥、殺蟲劑、消毒劑、濕紙巾的制作。例如:如只要含有細葉黃皮(Clausena anisum-olens (Blanco)Merr.)果實、葉、根所制作的消炎藥、含片、飲料、果汁、食品添加劑、營養粉、功能食品、飼料、飼料添加劑、茶、洗面奶、早霜、晚霜、乳液、祛痘水、消炎水、面膜、洗發水(露)、洗衣液(乳)、洗衣粉、肥皂、洗手液(乳)、淋浴液(乳)、牙膏、牙膏添加劑、酒類、農藥、殺蟲劑、消毒劑、濕紙巾的制作及其抑菌方法；細葉黃皮為廣西崇左市近幾年大力推廣種植的經濟樹種，市內加工廠有十余家。研究表明，細葉黃皮果實、葉提取物具有廣譜的抑菌作用，其作為一種植物藥，具有安全、無毒的特點，值得深入研究。
[0081]以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
【權利要求】
1.一種測試細葉黃皮提取物抑菌活性的方法，其特征在于，該測試細葉黃皮提取物抑菌活性的方法包括: 采用紙片擴散法，測試細葉黃皮果實、葉的乙醇提取物及石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位對綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、殺螟桿菌、大腸桿菌的抑制作用；通過傾注平板法測定細葉黃皮根乙醇提取物及其石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位對綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、殺螟桿菌、大腸桿菌的抑制作用；得出了細葉黃皮果實、葉、根的乙醇提取物及其石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位對綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草桿菌及殺螟桿菌均有抑制作用。
2.如權利要求1所述的測試細葉黃皮提取物抑菌活性的方法，其特征在于，采用傾注平板法測試細葉黃皮根提取物抑菌活性的方法包括以下步驟: 步驟一，細葉黃皮根提取物的提取:把細葉黃皮根自然晾干，粉碎，用30%乙醇浸泡10天，減壓蒸餾至浸膏狀，得到乙醇提取物，一部分留作實驗，一部分依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取，得到各部位浸膏，置4°C冰箱保存備用； 步驟二，受試液的制備，分別取細葉黃皮根乙醇提取物及其石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位，用溶劑和經滅菌處理的含5% Tween-80的蒸餾水混合，配制成系列濃度受試液，供最低抑菌濃度測定用； 步驟三，菌液的制備，分別用無菌棉簽蘸取綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、殺螟桿菌、大腸桿菌接種于牛肉膏蛋白胨液體培養基，于35°C下搖床培養18h，進行菌種活化；稀釋活化后的菌懸液，進行活菌計數，取得最佳菌懸液濃度約為IO6Cfi^mr1濃度的細胞懸浮液； 步驟四，傾注平板法測定最低抑菌濃度，用移液槍吸取不同濃度的受試液各2mL，分別放于無菌空培養皿內，加入融化后的瓊脂培養基13mL，最終體積為15mL，立即混勻，使受試液在培養基中的終濃度依次為40mg / mL、20mg / mL>IOmg / mL、5mg / mL、2.5mg/mL、1.25mg / mL、0.63mg / mL、0.3Img / mL、0.16mg / mL ； 步驟五，待凝固后，用移液槍從5種配置好的菌液中吸取IOOuL,放入到相應的培養皿中，然后進行均勻涂布，于35°C恒溫培養，24h后觀察結果；如果培養皿無菌落形成則說明有抑菌作用，開始明顯長菌則說明該濃度接近MIC值。
3.如權利要求2所述的測試細葉黃皮提取物抑菌活性的方法，其特征在于，細葉黃皮根乙醇提取物及其石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位對綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、殺螟桿菌、大腸桿菌都具有較強的抑制作用，三個部位對金黃色葡萄球菌的抑制作用最強，最低抑菌劑量分別為1.25mg / mL、5.0mg / mL及2.5mg / mL ;三個部位中石油醚部位對四種供試菌的最低抑菌劑量均為1.25mg / mL，其次是乙酸乙酯部位。
4.如權利要求1所述的測試細葉黃皮提取物抑菌活性的方法，其特征在于，采用紙片擴散法測試細葉黃皮果實、葉提取物抑菌活性的方法包括以下步驟: 步驟一，細葉黃皮果實、葉提取物的提取:細葉黃皮果實及葉洗凈，陰干，粉碎，用30%的乙醇浸泡15天，減壓蒸餾至浸膏狀，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取，得到各部位浸膏； 步驟二，細菌懸液的制備，分別用無菌棉簽蘸取供試菌綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、殺螟桿菌、大腸桿菌接種于牛肉膏蛋白胨液體培養基，于35°C下搖床培養25h，進行菌種活化，稀釋，并進行活菌計數；用無菌水將細菌分別配制成約IO6Cfu.mL-1濃度的細胞懸浮液； 步驟三，抑菌圈的測定，把小濾紙片放入干燥培養皿中，在120°C下滅菌15min ;將培養基倒入培養皿中，待培養基自然冷卻凝固后，用移液槍從每種菌種吸取lOOuL，放入到相應的培養皿中，涂布均勻；將試藥浸泡過的濾紙片置于平板內，于35°C中培養，24h后觀察結果；有明顯抑菌的測抑菌圈的直徑。
5.如權利要求4所述的測試細葉黃皮提取物抑菌活性的方法，其特征在于，細葉黃皮果實及葉的乙醇提取物，濃度為1.32mg/片對綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、殺螟桿菌、大腸桿菌5種供試菌具有抑制作用；果實乙醇提取物的石油醚部位、氯仿部位及乙酸乙酯部位，濃度為1.32mg/片對綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、殺螟桿菌、大腸桿菌5種供試菌有抑制作用；葉乙醇提取物的石油醚部位、氯仿部位及乙酸乙酯部位在相同濃度下對綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、殺螟桿菌、大腸桿菌5種供試菌均有抑制作用。
6.如權利要求4所述的測試細葉黃皮果實提取物抑菌活性的方法，其特征在于，細葉黃皮果實乙醇提取物的石油醚部位、氯仿部位及乙酸乙酯部位劑量為0.103mg/片以上時對金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、大腸桿菌、殺螟桿菌、枯草桿菌均有抑制作用，乙酸乙酯部位抑菌活性最強，對金黃色葡萄球菌及大腸桿菌最敏感，最小抑菌劑量分別為0.006及0.013mg/片；細葉黃皮葉乙醇提取物的石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位對金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、大腸桿菌、殺螟桿菌、枯草桿菌5種供試菌均有抑制作用，其中乙酸乙酯部位對金黃色葡萄球菌抑制作用最強，最小抑菌劑量為0.026mg/片。
7.如權利要求1所述 的測試細葉黃皮提取物抑菌活性的方法，其特征在于，該細葉黃皮果實、葉、根的乙醇提取物對革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌均有抑制作用，細葉黃皮果實、葉、根用于消炎藥、含片、飲料、果汁、食品添加劑、營養粉、功能食品、飼料、飼料添加劑、茶、洗面奶、早霜、晚霜、乳液、祛痘水、消炎水、面膜、洗發水(露)、洗衣液(乳)、洗衣粉、肥皂、洗手液(乳)、淋浴液(乳)、牙膏、牙膏添加劑、酒類、農藥、殺蟲劑、消毒劑、濕紙巾的制作。
【文檔編號】G01N33/50GK103913564SQ201410142509
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2014年4月11日 優先權日:2014年4月11日
【發明者】蘇秀芳 申請人:蘇秀芳
專業數控銑床產品供應商
20年生產經驗，實力工廠，精工品質，質量有保障
