使用脂肪組織衍生的干細胞的神經發生篩選方法和系統的制作方法
【專利摘要】本發明提供的是用于鑒定神經發生-調節化合物的方法，包括：在候選化合物存在時培養脂肪衍生的干細胞(ADSC)，和確定ADSC中的神經發生程度；以及用于鑒定神經發生調節化合物的系統。還提供的是促進ADSC中的神經發生的方法。
【專利說明】使用脂肪組織衍生的干細胞的神經發生篩選方法和系統
【技術領域】
[0001] 本公開內容涉及用于鑒定神經發生-調節化合物（例如促進或抑制神經發生的化 合物）的方法。更具體地講，本公開內容涉及使用脂肪衍生的干細胞（ADSC)、更尤其是人脂 肪衍生的干細胞（hADSC)鑒定神經發生-調節化合物的方法。
【背景技術】
[0002] 腦營養素在嬰兒、兒童以及孕婦和哺乳期婦女的飲食中已經成為日益重要的添加 齊U，因為它們能夠促進早期腦發育。另外，一直都在尋找用于治療神經變性性疾病或腦損傷 的化合物。需要鑒定神經毒性化合物，例如環境毒素、工業毒素或飲食毒素，以便除去或減 少對這類化合物的暴露。發現這樣的營養素和毒素的方法通常特別耗時和低效。因此，需 要提供用于鑒定具有神經學開發效益的化合物的可靠、穩定而快速的方法。另外，需要鑒定 對神經有害的化合物。
[0003] 已經證明了干細胞（例如脂肪衍生的干細胞（ADSC))可以以可復制的方式分化為 多種成熟細胞表型，包括神經元細胞。具體地講，在人類脂肪衍生的干細胞（hADSC)中已經 證明了這一點。hADSC是特別有用的研究工具，因為它們容易得自商業來源或抽脂術，并且 它們并不牽涉使用胚胎干細胞所產生的相同可能的爭議。此外，hADSC容易得自單個患者， 因而提供個性化醫療的機會。
【發明內容】
[0004] 本公開內容一方面提供使用ADSC來鑒定神經發生-調節化合物的方法。所述方 法用于鑒定可用于補充嬰兒、兒童、孕婦和哺乳期婦女的飲食的潛在的腦營養素。本方法還 用于鑒定用于治療神經病和神經損傷的潛在藥物候選物。最后，本方法用于鑒定可能具有 神經毒性的化合物，例如對胎兒、嬰兒和兒童的神經發育有害的化合物。神經毒性化合物還 可能促成神經病或可能干擾對神經病和損傷的治療和康復。
[0005] 因此，在某些實施方案中，本公開內容提供用于鑒定神經發生-調節化合物的方 法，包括：在候選化合物存在時培養脂肪衍生的干細胞（ADSC);和確定ADSC中的神經發生 程度。前述方法可以進一步包括在所述候選化合物不存在時培養ADSC，確定在所述候選 化合物不存在時培養的ADSC中的神經發生程度，并且將在所述候選化合物存在時培養的 ADSC中的神經發生程度與在所述候選化合物不存在時培養的ADSC中的神經發生程度進行 比較。在某些實施方案中，所述脂肪衍生的干細胞是人脂肪衍生的干細胞（hADSC)。
[0006] 不受任何具體理論的束縛，認為與在所述候選化合物不存在時培養的ADSC中的 神經發生程度相比，在所述候選化合物存在時培養的ADSC中的神經發生程度增加，表明所 述候選化合物是神經發生-促進化合物。另一方面，與在所述候選化合物不存在時培養的 ADSC中的神經發生程度相比，在所述候選化合物存在時培養的ADSC中的神經發生程度減 少，表明所述候選化合物是神經發生-抑制化合物。
[0007] 在某些實施方案中，所述方法進一步包括在已知神經發生-促進化合物例如 二十二碳六烯酸（DHA)存在時培養ADSC，確定在DHA存在時培養的ADSC的神經發生程度， 并且將在所述候選化合物存在時培養的ADSC中的神經發生程度與在DHA存在時培養的 ADSC中的神經發生程度進行比較，其中與在DHA存在時培養的ADSC中的神經發生程度相 t匕，在所述候選化合物存在時培養的ADSC中的神經發生程度增加，表明所述候選化合物是 神經發生-促進化合物。
[0008] 在某些實施方案中，神經發生程度是通過觀測ADSC的細胞形態學變化而確定。細 胞形態學的變化包括但不限于細胞質收縮、神經突形成、樹突樣突出的形成、軸突形成或其 任何組合。細胞形態學的變化可通過細胞分析或目測的任何方法而確定。例如，細胞形態 學的變化可通過顯微鏡例如相差顯微術而觀測。在其它實施方案中，神經發生程度通過觀 測指示神經發生的細胞生物標記而確定。
[0009] 在任何前述方法中，在所述候選化合物存在時培養ADSC足以發生神經發生的一 段時間，例如大約1至大約5天。此外，可以在升高的溫度例如大約25至大約45°C下培養 ADSC。
[0010] 用于培養ADSC的培養器皿可包含促進或支持神經發生的涂層（coating)，例如模 擬中樞神經環境的涂層。例如，培養器皿可包含包括多聚-L-鳥氨酸和牛纖連蛋白的涂層。 [0011] 在某些實施方案中，用于培養ADSC的培養基促進或支持神經發生。例如，所述培 養基可包含神經基礎培養基、表皮生長因子（EGF)、堿性成纖維細胞生長因子（b-FGF)、N2 補充物和L-谷氨酰胺。
[0012] 在某些實施方案中，所述方法包括在所述候選化合物存在時培養所述細胞之前， 在啟動培養基（priming medium)中啟動ADSC大約1至大約5天。所述啟動培養基可包含 神經基礎培養基、EGF、b-FGF和N2補充物。啟動之后，ADSC可以在包含完全MesenPRO和 所述候選化合物的培養基中培養大約1至大約5天。
[0013] 本公開內容的另一方面提供促進ADSC中的神經發生的方法，包括：在神經發生促 進化合物存在時培養ADSC。在某些實施方案中，所述方法進一步包括確定ADSC中的神經發 生程度。
[0014] 本公開內容的再一方面涉及用于鑒定神經發生-調節化合物的系統，包括：ADSC ; 包含模擬中樞神經系統的涂層的培養器皿；和促進神經發生的培養基。用于培養器皿的涂 層可包含例如，牛纖連蛋白和多聚-L-鳥氨酸。所述培養基可包含神經基礎培養基、EGF、 b-FGF、N2補充物和L-谷氨酰胺。在其它實施方案中，所述系統包括:ADSC、包含模擬中樞 神經系統的涂層的培養器皿、啟動培養基和培養基。所述啟動培養基可包含神經基礎培養 基、EGF、b-FGF和N2補充物，而所述培養基可包含完全MesenPRO。
[0015] 附圖簡沭 圖1是描繪根據本公開內容的實施方案的快速神經元分化平臺（RNDP)的圖解。將 hADSC在合適的培養基和合適量的候選化合物中（處理）培養24-72小時。然后評價hADSC 以確定神經發生程度。
[0016] 圖2是描繪根據本公開內容的實施方案的擴展的神經元分化平臺（ENDP)的圖解。 將hADSC在合適的啟動培養基中培養至多3天。然后將啟動培養基更換為合適的培養基 (分化培養基）和合適量的候選化合物并培養1-5天。然后評價hADSC以確定神經發生程 度。
[0017] 圖3A描繪了對照實驗中的ADSC的相差圖像。圖3B描繪了腦營養素處理后的ADSC 的相差圖像。
[0018] 圖4A是來自細胞表達研究的對照圖像，其中細胞用針對微管相關蛋白2 (MAP2) (一種神經元標記）的抗體染色。圖4B是在MAP2表達研究中的腦營養素處理后圖像。紅 色熒光（用白色條紋指示）顯示MAP2的表達。
[0019] 圖5A是來自細胞表達研究的對照圖像，其中細胞用針對巢蛋白（一種神經元標 記）的抗體染色。圖5B是在巢蛋白表達研究中的腦營養素處理后圖像。紅色熒光（用白 色條紋指示）顯示巢蛋白的表達。
[0020] 圖6A是來自細胞表達研究的對照圖像，其中細胞用針對膠質纖維酸性蛋白 (GFAP)(-種神經元標記）的抗體染色。圖6B是在GFAP表達研究中的腦營養素處理后圖 像。紅色熒光（用白色條紋指示）顯示GFAP的表達。
[0021] 圖7A是來自細胞表達研究的對照圖像，其中細胞用針對β III微管蛋白（一種神 經元標記）的抗體染色。圖7Β是在β III微管蛋白表達研究中的腦營養素處理后圖像。紅 色熒光（用白色條紋指示）顯示β III微管蛋白的表達。
[0022] 實施本發明的最伴方式 本公開內容提供用于鑒定神經發生-調節化合物的方法，包括：在候選化合物存在時 培養脂肪衍生的干細胞（ADSC)，和確定ADSC中的神經發生程度。
[0023] "神經發生"是指在體外或體內自干細胞或祖細胞向神經細胞的分化、產生或增 殖。神經發生程度可通過本領域已知的多種技術來確定，例如通過觀測細胞形態學變化。細 胞分析或目測的任何方法都適用于本方法。例如，可使用顯微鏡技術例如相差顯微術觀測 ADSC的形態學變化。指示神經發生的形態學變化包括但不限于細胞質收縮以及神經突、軸 突和樹突的存在。在其它實施方案中，通過觀測指示神經發生的細胞生物標記，例如通過使 用生物標記表達實驗，確定神經發生程度。這樣的生物標記的實例包括但不限于蛋白質例 如神經絲、髓鞘堿性蛋白、微管相關蛋白2(MP2)、巢蛋白、β-III微管蛋白、膠質纖維酸性 蛋白（GFAP)、S100 (-種鈣結合蛋白）、CNPase和GABA受體。
[0024] "神經發生-調節化合物"是指通過促進或抑制神經發生而影響神經發生的化合 物。因此，在某些實施方案中，神經發生-調節化合物促進神經發生（"神經發生-促進化合 物"），而在其它實施方案中，神經發生-調節化合物抑制或減少神經發生（"神經發生-抑 制化合物")。鑒定為促進神經發生的化合物可以有利地用作嬰兒、兒童、孕婦和哺乳母親的 飲食補充物，以促進和支持早期腦發育。這些化合物也可用于治療神經變性疾病或神經損 傷。鑒定為抑制神經發生的化合物可以是從嬰兒、兒童、孕婦和哺乳期婦女的飲食和環境中 需要避免或去除的潛在毒素。這些化合物還可能干擾神經病或損傷的治療和康復。因此， 在患有神經病或損傷的個體的飲食和環境中也可避免神經發生-抑制化合物。
[0025] "候選化合物"是指用本文所述的方法來測試神經發生-調節特性的任何化合物。 所述候選化合物包括但不限于天然存在的物質、合成的化合物或提取物，例如植物或動物 組織、真菌或細菌的提取物。可以單獨測試所述候選化合物或可與其它候選化合物或已知 的神經發生-調節化合物組合測試，以觀測協同效應或達到更高通量的化合物篩選。
[0026] 在某些實施方案中，所述方法進一步包括提供ADSC的陰性對照培養物，用于與候 選化合物進行比較。因此，所述方法進一步包括在所述候選化合物不存在時培養ADSC，確 定在所述候選化合物不存在時培養的ADSC中的神經發生程度，和將在所述候選化合物存 在時培養的ADSC中的神經發生程度與在所述候選化合物不存在時培養的ADSC中的神經發 生程度進行比較。與在所述候選化合物不存在時培養的ADSC中的神經發生程度相比，在所 述候選化合物存在時培養的ADSC中的神經發生程度增加，表明所述候選化合物是神經發 生-促進化合物。另一方面，與在所述候選化合物不存在時培養的ADSC中的神經發生程度 相比，在所述候選化合物存在時培養的ADSC中的神經發生程度減少，表明所述候選化合物 是神經發生-抑制化合物。陰性對照培養物提供了所述候選化合物的神經發生調節性質的 額外的相關信息。
[0027] 在其它實施方案中，所述方法進一步包括提供陽性對照培養物。因此，所述方法進 一步包括在已知神經發生-促進化合物存在時培養ADSC，和確定在所述神經發生-促進化 合物存在時培養的ADSC中的神經發生程度。例如，DHA已知能促進早期腦發育并且可用作 陽性對照。因此，所述方法可以進一步包括在DHA存在時培養ADSC。與在DHA存在時培養 的ADSC中的神經發生程度相比，在所述候選化合物存在時培養的ADSC中的神經發生程度 增加，表明所述候選化合物是優于DHA的神經發生-促進化合物。
[0028] 在神經發生期間，ADSC可以分化為神經元細胞、神經元細胞的祖細胞和具有神經 元性能的細胞。因此，神經發生程度可通過觀測細胞形態學變化而確定。指示神經發生的 細胞形態學的變化包括但不限于細胞質收縮、神經突形成、樹突樣突出形成、軸突形成或其 組合。指示神經發生的細胞形態學的其它變化包括類似于兩極、三極和多極神經元細胞的 形態學發育。
[0029] 前述細胞形態學的變化可通過顯微鏡技術例如通過相差顯微術來觀測。ADSC的相 差顯微術圖像可在ADSC培養期間多次采集。例如，可在與候選化合物培養之前、在加入候 選化合物之后一次或多次例如之后3小時、和此后每天一次采集圖像。
[0030] 神經發生程度可以進一步通過測定顯示神經元分化的ADSC百分率和細胞中的細 胞質突出例如神經突、軸突和樹突的長度而確定。可使用具有合適插件的Image J開放軟 件測定顯示神經元分化的ADSC百分率和細胞質突出的長度。
[0031] 在神經發生期間發生細胞生物標記的變化。因此，在某些實施方案中，神經元標記 的細胞表達研究用于確定神經發生程度。這樣的生物標記的實例包括但不限于蛋白質例如 神經絲、髓鞘堿性蛋白、巢蛋白、β-ΙΙΙ微管蛋白、膠質纖維酸性蛋白（GFAP)、S100 (-種 鈣結合蛋白）、微管相關蛋白2 (MAP2)、CNPase和GABA受體。確定神經元分化的其它技術 包括神經元標記的免疫組織染色、神經元興奮性測定和用于神經蛋白表達的蛋白質印跡。
[0032] 在某些實施方案中，所述ADSC是人脂肪衍生的干細胞（hADSC)。hADSC可以有利 地維持在培養基中并且容易傳代，以提供多個傳代培養物。此外，hADSC容易得到，因為它 們可分離自在常規抽脂術期間采集的人脂肪組織并可冷凍保存。hADSC具有容易得自個體 患者的額外優勢。這樣獲得的hADSC可用于本文所述的方法以篩選候選化合物，用于個性 化使用。因此，使用本公開內容的方法可以實現個性化和優化營養、藥物治療或對神經毒素 的敏感性的測定。
[0033] 可以培養ADSC足以發生神經發生的時間。神經發生可在不同時間觀測，這取決于 所測的腦營養素。因此，在某些實施方案中，神經發生可以在培養數小時后觀測，而在其它 實施方案中，神經發生可以在培養若干天后觀測。例如，ADSC可以培養大約1小時至大約5 天、大約1小時至大約3天、大約3小時至大約36小時、大約12小時至大約24小時、或大 約24至大約36小時。此外，ADSC的培養可以持續1、2、3或4周，以達到更完全的神經元 分化。ADSC的培養可以進一步在升高的溫度例如高于室溫的溫度下進行。這樣的溫度包括 大約25至大約45°C、大約30至大約40°C、或大約37°C。
[0034] 在前述方法中，ADSC可以在支持或促進神經發生（例如通過引導ADSC分化為神 經元細胞）的培養基中有利地培養。在某些實施方案中，所述培養基包含神經基礎培養基、 表皮生長因子（EGF)、堿性成纖維細胞生長因子b-FGF、N2補充物和L-谷氨酰胺。培養基 的成分是市售來源可得的。例如，神經基礎培養基可以是Neurobasal?培養基，其可得自 Invitrogen。神經基礎培養基?可包括下表1所列出的成分： 表 1 :Neurobasal? 培養基
【權利要求】
1. 用于鑒定神經發生-調節化合物的方法，包括： 在候選化合物存在時培養脂肪衍生的干細胞（ADSC);和 確定ADSC中的神經發生程度。
2. 權利要求1的方法，進一步包括： 在所述候選化合物不存在時培養ADSC， 確定在所述候選化合物不存在時培養的ADSC中的神經發生程度，和 將在所述候選化合物存在時培養的ADSC中的神經發生程度與在所述候選化合物不存 在時培養的ADSC中的神經發生程度進行比較。
3. 權利要求2的方法，其中與在所述候選化合物不存在時培養的ADSC中的神經發生 程度相比，在所述候選化合物存在時培養的ADSC中的神經發生程度增加，表明所述候選化 合物是神經發生-促進化合物。
4. 權利要求2的方法，其中與在所述候選化合物不存在時培養的ADSC中的神經發生 程度相比，在所述候選化合物存在時培養的ADSC中的神經發生程度減少，表明所述候選化 合物是神經發生-抑制化合物。
5. 權利要求1的方法，進一步包括： 在二十二碳六烯酸（DHA)存在時培養ADSC， 確定在DHA存在時培養的ADSC的神經發生程度；和 將在所述候選化合物存在時培養的ADSC中的神經發生程度與在DHA存在時培養的 ADSC中的神經發生程度進行比較，其中與在DHA存在時培養的ADSC中的神經發生程度相 t匕，在所述候選化合物存在時培養的ADSC中的神經發生程度增加，表明所述候選化合物是 神經發生-促進化合物。
6. 權利要求1的方法，其中神經發生程度通過觀測ADSC的細胞形態學變化而確定。
7. 權利要求6的方法，其中細胞形態學的變化是細胞質收縮、神經突形成、樹突樣突 出的形成、軸突形成或其組合。
8. 權利要求6的方法，其中細胞形態學的變化通過顯微鏡術觀測。
9. 權利要求8的方法，其中細胞形態學的變化通過相差顯微術觀測。
10. 權利要求1的方法，其中所述脂肪衍生的干細胞是人脂肪衍生的干細胞（hADSC)。
11. 權利要求1的方法，其中所述ADSC在所述候選化合物存在時培養大約1至大約5 天。
12. 權利要求1的方法，其中所述ADSC在包含神經基礎培養基、EGF、b-FGF、N2補充物 和L-谷氨酰胺的培養基中培養。
13. 權利要求1的方法，進一步包括：在所述候選化合物存在時培養所述細胞之前，在 啟動培養基中啟動ADSC大約1至大約5天。
14. 權利要求13的方法，其中所述啟動培養基包含神經基礎培養基、EGF、b-FGF和N2 補充物。
15. 權利要求13的方法，其中所述ADSC在所述候選化合物存在時培養大約1至大約 5天。
16. 權利要求15的方法，其中所述ADSC在包含完全MesenPRO的培養基中培養。
17. 權利要求1的方法，其中所述細胞在包被有多聚-L-鳥氨酸和牛血漿纖連蛋白的 培養器皿中培養。
18. 促進ADSC中的神經發生的方法，包括： 在神經發生促進化合物存在時培養ADSC。
19. 用于培養干細胞的系統，包括： 干細胞； 干細胞的培養器皿，所述培養器皿上已包被包含多聚-L-鳥氨酸和牛纖連蛋白的涂 層；和 培養基。
20. 權利要求19的系統，進一步包含啟動培養基。
【文檔編號】G01N33/50GK104285147SQ201380011780
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2013年1月25日 優先權日:2012年2月29日
【發明者】C.鄺, Y.肖, Z.朱尼, E.K.佩爾斯, D.洪曼 申請人:Mjn 美國控股有限責任公司
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