同時檢測兩種急性白血病標志物電化學傳感器的制備方法及應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種同時檢測兩種急性白血病標志物電化學傳感器的制備方法，步驟如下：將溶菌酶報告探針和γ-干擾素報告探針分別在含有TCEP的溶液中靜置，以打開二硫鍵并分別與溶菌酶適體和γ-干擾素適體形成雙鏈結構；對金電極進行預處理，將處理好的金電極浸在預處理后的溶菌酶報告探針-適體雙鏈和γ-干擾素報告探針-適體雙鏈的混合液中，室溫靜置過夜，之后用二次蒸餾水和清洗液清洗；然后將電極浸在含有MCH的溶液中，以封閉電極，之后用二次蒸餾水和清洗液清洗；將上述步驟處理后的電極作為工作電極，和參比電極、對電極連接在化學工作站上，以得到電化學傳感器。該電化學傳感器可用于兩種急性白血病標志物溶菌酶和γ-干擾素的同時檢測。
【專利說明】同時檢測兩種急性白血病標志物電化學傳感器的制備方法及應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種同時檢測兩種急性白血病標志物電化學傳感器的制備方法及應用，屬于臨床分析及生物電化學傳感【技術領域】。
【背景技術】
[0002]在當今社會中，癌癥是嚴重威脅人類身體健康的疾病之一。癌癥患者的死亡率很高的最主要的原因是，不能進行早期診斷，如果能早期診斷及時治療，1/3的癌癥可以治愈。而血清腫瘤標志物的測定對癌癥的早期診斷起著重要的作用。因此，建立準確、快速檢測血清中腫瘤標志物的分析方法及相應的設備引起了人們的高度重視。
[0003]急性白血病是兒童和青年中最常見的一種惡性腫瘤，對兒童身體健康的危害極大，其早期診斷對有效治療具有十分重要的意義。傳統診斷方法多依靠腫瘤組織或細胞形態上的變化來進行的，但判斷難度大、準確率低，而且一旦在組織及細胞形態上確定癌癥發生，往往已進入中晚期，難以進行有效治療。由于癌細胞變化的過程主要是由復雜的分子水平的變化所誘導的，因此研究分子水平上的差異，對此水平的標志性物質進行靈敏及特異性識別和檢測，有望實現癌癥的高效早期診斷。
【發明內容】
[0004]本發明的目 的在于提供一種同時檢測兩種急性白血病標志物電化學傳感器的制備方法及應用。
[0005]本發明所采用的技術解決方案是:
[0006]一種同時檢測兩種急性白血病標志物電化學傳感器的制備方法，包括以下步驟:
[0007](I)將溶菌酶報告探針和Y -干擾素報告探針分別在含有三(2-氯乙基)磷酸酯的溶液中靜置，以打開二硫鍵；再向溶液中添加溶菌酶適體和Y-干擾素適體，溶菌酶報告探針和溶菌酶適體形成溶菌酶報告探針-適體雙鏈結構，Y-干擾素報告探針和Y-干擾素適體形成Y-干擾素報告探針-適體雙鏈結構；
[0008](2)對金電極進行預處理，將處理好的金電極浸在經過步驟(1)預處理后的溶菌酶報告探針-適體雙鏈和Y -干擾素報告探針-適體雙鏈混合液中，室溫靜置過夜，之后用二次蒸餾水和清洗液清洗；
[0009](3)將步驟⑵處理后的電極浸在含有6-巰基-1-己醇的溶液中，以封閉電極，之后用二次蒸餾水和清洗液清洗；
[0010](4)將步驟(3)處理后的電極作為工作電極，和參比電極、對電極連接在化學工作站上，以得到可同時檢測兩種急性白血病標志物的電化學傳感器。
[0011]優選的，步驟⑴中:所述溶菌酶報告探針為5’ -巰基-06-6了6046460^46了4八(:1'(^604(:-亞甲基藍-3’，所述溶菌酶適體為5’-41^ AGG GCT AMGAG TGC AGA GTT ACT TAG-3’，所述 Y -干擾素報告探針為 5’-巰基-C6-TTCAACCAACTTTTTTTTTTCAACACCCAT-二茂鐵-3’，所述 Y -干擾素適體為 5’-GGG GTT GGT TGT GTT GGG TGTTGT GT-3’。
[0012]優選的，步驟(I)中:所述溶液中溶菌酶報告探針-適體雙鏈的濃度為I μ mol/L，Y -干擾素報告探針-適體雙鏈的濃度為I μ mo I/L ;所述溶液中含有0.5 μ L10mmol/L三(2-氯乙基)憐酸酯，還含有 20mmol/L Tris-HCl> 140mmol/L NaCl、20mmol/L MgCl2 以及20mmol/L KCl，溶液 pH 值為 7.4。
[0013]優選的，步驟(I)中:所述靜置過程在室溫下進行，靜置時間為2小時。
[0014]優選的，步驟(2)中所述金電極的預處理過程如下:金電極用0.3μπι的Al2O3粉打磨成鏡面，二次蒸餾水清洗后，相繼在二次蒸餾水和乙醇溶液中超聲50s ;將清洗干凈的金電極在0.5mol/L的硫酸溶液中循環伏安掃描至穩定,掃描電壓為0.2?1.65V,掃描速度為
0.lV/s，然后用二次蒸餾水沖洗干凈，室溫晾干。
[0015]優選的，步驟(3)中:所述溶液中MCH的濃度為2mmol/L，溶液中還含有20mmol/LTris-HClU40mmol/L NaCl、20mmol/L MgCl2 以及 20mmol/L KC1，溶液 pH 值為 7.4。
[0016]優選的，步驟(2)與步驟(3)中:所述清洗液為濃度lOmmol/L的Tris-HCl緩沖溶液，溶液PH值為7.4。
[0017]上述制備的電化學傳感器用于兩種急性白血病標志物溶菌酶和Y-干擾素的同時檢測。
[0018]上述檢測方法具體包括以下步驟:
[0019](I)溶菌酶和Y-干擾素檢測溶液的制備:溶菌酶和Y-干擾素在溶液中配制成濃度分別為0.5?500nmol/L和0.5?500nmol/L，儲存在4°C下備用；所述溶液中包含有 20mmol/LTris-HCl、140mmol/L NaCl、20mmol/L MgCl2 以及 20mmol/L KC1，溶液 pH 值為7.4；
[0020](2)將所制備的傳感器工作電極浸泡在50 μ L步驟⑴配制的溶菌酶和Y -干擾素檢測溶液中，37°C下靜置lh，之后用二次蒸餾水和清洗液清洗，得到組裝的工作電極；
[0021](3)將參比電極、對電極和組裝的工作電極連接在電化學工作站上，在電解槽中加入 40 ?60 μ L 的溶液，溶液中含有 20mmol/L Tris-HClU40mmol/L NaCl、20mmol/L MgCl2以及20mmol/L KC1，溶液pH值為7.4，然后用差分脈沖伏安法檢測組裝的工作電極的電流響應，根據所得電流響應與兩種急性白血病標志物的標準溶液濃度之間的關系，繪制工作曲線；
[0022](4)將待測樣品溶液代替兩種標志物的標準溶液，按照所述兩種急性白血病標志物的工作曲線的繪制方法進項檢測。
[0023]優選的，步驟⑵中，所述清洗液為濃度lOmmol/L的Tris-HCl緩沖溶液，溶液pH為 7.4。
[0024]本發明的工作原理及有益效果如下:
[0025]在患病初期，溶菌酶、Y干擾素等與急性白血病相關的標志物會發生變化，對它們的同時檢測可輔助進行早期診斷及分型，對急性白血病的早期診斷具有非常大的意義。本發明基于核酸適體識別技術，建立電化學生物傳感器實現溶菌酶(其濃度有助于區分急性早幼粒細胞白血病、急性粒單核細胞白血病等亞型)和Y干擾素(其濃度可反映急性白血病患者的細胞免疫水平及機體免疫功能)兩種急性白血病相關物質的同時、高靈敏檢測，用于急性白血病早期診斷。
[0026]本發明首先在金電極上固定兩種分別修飾有電活性物質(二茂鐵、亞甲基藍)的標志物的報告探針-適體雙鏈，在溶菌酶和Y -干擾素存在下兩者分別與雙鏈中的適體結合，兩報告探針的構象分別發生變化從而引起相應報告探針鏈上修飾的電活性物質與電極之間的距離變化，從而電流響應發生改變。本發明結合適體識別技術，所制備的傳感器具有極高的選擇性，可以同時實現溶菌酶和Y干擾素的高靈敏度檢測；檢測時僅需對樣品簡單處理，節省了檢測時間，降低了檢測成本，是一種快速、廉價且靈敏的檢測方法，將促進急性白血病早起診斷及分型的發展。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0027]圖1為本發明的原理圖。
【具體實施方式】
[0028]結合附圖，一種同時檢測兩種急性白血病標志物電化學傳感器的制備方法，包括以下步驟:
[0029](I)將 I μ mo I/L 溶菌酶報告探針(5 ’ -巰基-C6-GTGCAGAGCTAAGTAACTCTGCAC-亞甲基藍 _3，)和 I μ mo I/L y -干擾素報告探針(5，-巰基-C6-TTCAACCAACTTTTTTTTTTCAACACCCAT- 二茂鐵-3，)分別在含有0.5 μ L10mmol/L三(2-氯乙基)磷酸酯(TCEP)的50 μ L溶液(20mmol/L Tris-HCl, pH7.4, 140mmol/L NaCl, 20mmol/L MgC12, 20mmol/L KCl)中室溫下靜置2h，以打開二硫鍵。再向溶液中添加I μ mol/L溶菌酶適體(5’ -ATC AGG GCTAAA GAG TGC AGA GTT ACT TAG-3’ )和 I μ mol/L 干擾素適體(5，-GGG GTT GGT TGT GTTGGG TGT TGT GT-3’)，溶菌酶報告探針和溶菌酶適體形成溶菌酶報告探針-適體雙鏈結構，Y-干擾素報告探針和Y-干擾素適體形成Y-干擾素報告探針-適體雙鏈結構，得到預處理后的溶菌酶適體和Y-干擾素適體混合液。
[0030](2)金電極用0.3 μ m的Al2O3粉打磨成鏡面，二次蒸餾水清洗后，相繼在二次蒸餾水和乙醇溶液中超聲50s ;將清洗干凈的金電極在0.5mol/L的硫酸溶液中循環伏安(0.2?1.65V，0.lV/s，)至穩定，然后用二次蒸餾水沖洗干凈，室溫晾干。將處理好的金電極浸在經過步驟(I)預處理后的溶菌酶適體和Y-干擾素適體混合液中，室溫靜置過夜，之后用二次蒸餾水和清洗液(lOmmol/L Tris-HCl, pH7.4)清洗。
[0031](3)將經過步驟⑵處理后的電極浸在含有2mmol/L6-巰基_1_己醇(MCH)的溶液(20mmol/L Tris-HCl, ρΗ7.4，140mmol/L NaCl, 20mmol/L MgCl2, 20mmol/L KCl)中 lh，以封閉電極，之后用二次蒸餾水和清洗液(lOmmol/L Tris-HCl, pH7.4)清洗。
[0032](4)將步驟(3)處理后的電極作為工作電極，和參比電極、對電極連接在化學工作站上，以得到可同時檢測兩種急性白血病標志物的電化學傳感器。
[0033]上述電化學傳感器可用于兩種急性白血病標志物溶菌酶和Y-干擾素的同時檢測，具體包括以下步驟:
[0034](I)溶菌酶和Y -干擾素檢測溶液的制備:溶菌酶和Y -干擾素在溶液(20mmol/L Tris-HCl, pH7.4, 140mmol/L NaCl, 20mmol/L MgCl2, 20mmol/L KCl)中配制成濃度分別為
0.5?500nmol/L和0.5?500nmol/L的混合液溶液，儲存在4°C下備用。[0035](2)將所制備的傳感器工作電極浸泡在50 μ L步驟⑴配制的已知濃度的混合液中，37°C下靜置lh，之后用二次蒸餾水和清洗液(lOmmol/L Tris-HCl, pH7.4)清洗，得到組裝的工作電極。
[0036](3)將參比電極、對電極和組裝的工作電極連接在電化學工作站上，在電解槽中加入 40 ?60μ L 的溶液(20mmol/L Tris-HCl, pH7.4, 140mmol/L NaCl, 20mmol/LMgCl2, 20mmol/L KCl)，然后用差分脈沖伏安法檢測組裝的工作電極的電流響應，根據所得電流響應與兩種急性白血病標志物的標準溶液濃度之間的關系，繪制工作曲線。
[0037](4)將待測樣品溶液代替兩種標志物的標準溶液，按照所述兩種急性白血病標志物的工作曲線的繪制方法進項檢測。
[0038]檢測結果如下:
[0039]1、Y-干擾素的檢測:二茂鐵的信號在400±4mV左右，檢測范圍大約為0.5?500nmol/L,檢測限約為 0.3nmol/L。
[0040]2、溶菌酶的檢測:亞甲基藍的信號在_245±3mV左右，檢測范圍大約為0.5?500nmol/L 檢測限約為 0.2nmol/L。
[0041]由以上檢測數據可看出，本發明傳感器對溶菌酶和干擾素可以實現同時高靈敏度檢測。
【權利要求】
1.一種同時檢測兩種急性白血病標志物電化學傳感器的制備方法，其特征在于包括以下步驟: (1)將溶菌酶報告探針和Y-干擾素報告探針分別在含有三(2-氯乙基)磷酸酯的溶液中靜置，以打開二硫鍵；再向溶液中添加溶菌酶適體和Y-干擾素適體，溶菌酶報告探針和溶菌酶適體形成溶菌酶報告探針-適體雙鏈結構，Y-干擾素報告探針和Y-干擾素適體形成Y-干擾素報告探針-適體雙鏈結構； (2)對金電極進行預處理，將處理好的金電極浸在經過步驟(1)預處理后的溶菌酶報告探針-適體雙鏈和Y -干擾素報告探針-適體雙鏈混合液中，室溫靜置過夜，之后用二次蒸餾水和清洗液清洗； (3)將步驟(2)處理后的電極浸在含有6-巰基-1-己醇的溶液中，以封閉電極，之后用二次蒸餾水和清洗液清洗； (4)將步驟(3)處理后的電極作為工作電極，和參比電極、對電極連接在化學工作站上，以得到可同時檢測兩種急性白血病標志物的電化學傳感器。
2.根據權利要求1所述的一種同時檢測兩種急性白血病標志物電化學傳感器的制備方法，其特征在于，步驟⑴中:所述溶菌酶報告探針為5’ -巰基-C6-GTGCAGAGCTAAGTMCTCTGCAC-亞甲基藍-3 ’，所述溶菌酶適體為 5 ’ -ATC AGG GCT AAAGAG TGC AGA GTT ACT TAG-3’，所述 Y -干擾素報告探針為 5’-巰基-C6-TTCAACCAACTTTTTTTTTTCAACACCCAT-二茂鐵-3’，所述 Y -干擾素適體為 5’-GGG GTT GGT TGT GTT GGG TGTTGT GT-3’。
3.根據權利要求1所述的一種同時檢測兩種急性白血病標志物電化學傳感器的制備方法，其特征在于，步驟(1)中:所述溶液中溶菌酶報告探針-適體雙鏈的濃度為I μ mol/L, Y-干擾素報告探針-適體雙鏈的濃度為I μ mo I/L ;所述溶液中含有0.5 μ L10mmol/L三(2-氯乙基)憐酸酯，還含有 20mmol/L Tris-HCl> 140mmol/L NaCl、20mmol/L MgCl2 以及20mmol/L KCl，溶液 pH 值為 7.4。
4.根據權利要求1所述的一種同時檢測兩種急性白血病標志物電化學傳感器的制備方法，其特征在于，步驟(1)中:所述靜置過程在室溫下進行，靜置時間為2小時。
5.根據權利要求1所述的一種同時檢測兩種急性白血病標志物電化學傳感器的制備方法，其特征在于，步驟⑵中所述金電極的預處理過程如下:金電極用0.3μπι的Al2O3粉打磨成鏡面，二次蒸餾水清洗后，相繼在二次蒸餾水和乙醇溶液中超聲50s ;將清洗干凈的金電極在0.5mol/L的硫酸溶液中循環伏安掃描至穩定,掃描電壓為0.2~1.65V,掃描速度為0.lV/s，然后用二次蒸餾水沖洗干凈，室溫晾干。
6.根據權利要求1所述的一種同時檢測兩種急性白血病標志物電化學傳感器的制備方法，其特征在于，步驟⑶中:所述溶液中MCH的濃度為2mmol/L，溶液中還含有20mmol/L Tris-HClU40mmol/L NaCl、20mmol/L MgCl2 以及 20mmol/L KC1，溶液 pH 值為 7.4。
7.根據權利要求1所述的一種同時檢測兩種急性白血病標志物電化學傳感器的制備方法，其特征在于，步驟⑵與步驟(3)中:所述清洗液為濃度lOmmol/L的Tris-HCl緩沖溶液，溶液PH值為7.4。
8.如權利要求1-7中任一權利要求所制備的電化學傳感器用于兩種急性白血病標志物溶菌酶和Y-干擾素的同時檢測。
9.根據權利要求8所述的電化學傳感器用于兩種急性白血病標志物的同時檢測，具體包括以下步驟: (1)溶菌酶和Y-干擾素檢測溶液的制備:溶菌酶和Y-干擾素在溶液中配制成濃度分別為0.5~500nmol/L和0.5~500nmol/L，儲存在4°C下備用；所述溶液中包含有20mmol/L Tris-HClU40mmol/L NaCl、20mmol/L MgCl2 以及 20mmol/L KC1，溶液 pH 值為7.4； (2)將所制備的傳感器工作電極浸泡在50μ L步驟(1)配制的溶菌酶和Y-干擾素檢測溶液中，37°C下靜置lh，之后用二次蒸餾水和清洗液清洗，得到組裝的工作電極； (3)將參比電極、對電極和組裝的工作電極連接在電化學工作站上，在電解槽中加入40~6(^1^的溶液，溶液中含有20臟01/1 Tris-HClU40mmoI/L NaCl、20mmol/L MgCl2 以及20mmol/L KCl，溶液pH值為7.4，然后用差分脈沖伏安法檢測組裝的工作電極的電流響應，根據所得電流響應與兩種急性 白血病標志物的標準溶液濃度之間的關系，繪制工作曲線； (4)將待測樣品溶液代替兩種標志物的標準溶液，按照所述兩種急性白血病標志物的工作曲線的繪制方法進項檢測。
10.根據權利要求9所述的電化學傳感器用于兩種急性白血病標志物的同時檢測，其特征在于，步驟(2)中，所述清洗液為濃度lOmmol/L的Tris-HCl緩沖溶液，溶液pH為7.4。
【文檔編號】G01N27/26GK103940872SQ201410181470
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年4月30日 優先權日:2014年4月30日
【發明者】王宗花, 趙凱, 夏建飛, 宋岱珉, 張菲菲, 夏霖, 遲德玲, 李延輝, 夏延致, 夏臨華 申請人:青島大學
專業數控銑床產品供應商
20年生產經驗，實力工廠，精工品質，質量有保障
