專利名稱：黃芪顆粒指紋圖譜的測定方法及其特征指紋圖譜的制作方法
技術領域：
本發明涉及中藥指紋圖譜分析方法，特別是黃芪顆粒HPLC特征指紋圖譜的測定方法以及由此方法所得到的黃芪顆粒的特征指紋圖譜。
背景技術：
我國傳統的中藥及其制劑大多缺乏嚴密的質量標準和科學的檢測手段，難以有效的控制其內在質量，不能保證用藥的安全、有效，也不符合國際醫藥市場的要求，嚴重制約了我國中藥行業的發展。加強中藥材質量控制研究是中藥規范化、標準化的關鍵問題。只有對中藥材進行科學的質量控制，才能保證中藥質量，實現中藥的“安全、有效、穩定、可控”。黃芪顆粒收載于《中藥部頒標準》，標準編號:WS3-B-2224_96，是黃芪藥材全成分提取物，為棕黃色顆粒，該藥療效確切，臨床應用廣泛，對慢性腎病、心血管系統疾病、糖尿病、腫瘤化療放療以及手術后、慢性鼻炎、骨質疏松等疾病具有較好的臨床效果。該標準中主要以薄層色譜定性鑒別方法控制制劑質量，目前市場上生產黃芪顆粒的廠家較多，臨床需求量巨大，現行的質量控制技術標準已經不能滿足黃芪顆粒應用發展之需要。近年來，關于黃芪顆粒質量控制已有一定研究報道，有學者采用分光光度法建立黃芪顆粒中總黃酮的含量測定方法，四川大學華西藥學院對黃芪顆粒中黃芪甲苷和總皂苷含量測定進行了研究，這些研究為黃芪顆粒的質量控制提供了一定參考，具有一定價值。目前，也有一些采用HPLC建立黃芪顆粒的特征指紋圖譜分析方法，比如:公開號為“CN102353729A”、名稱為“一種黃芪藥材的質量檢測方法”的專利文獻中，采用乙腈-水系統作為流動相系統，但得到的指紋圖譜中只有7個共有色譜峰；并且其針對的是黃芪藥材，而不是黃芪顆粒制劑。公告號為“CN101327246B”、名稱為“黃芪藥材、中間體及其制劑的指紋圖譜檢測方法和標準指紋圖譜”的專利文件中，采用80%-95%的甲醇作為提取溶劑，乙腈-水系統作為流動相系統，其得到的指紋圖譜分離度不是很好，只有19個特征色譜峰。
發明內容
本發明的目的在于:提供一種黃芪顆粒指紋圖譜的測定方法及其特征指紋圖譜。本發明通過對黃芪顆粒HPLC指紋圖譜的研究，提供了一種快速評價黃芪顆粒質量的方法，彌補了現有質量控制技術的不足，使黃芪顆粒的質量控制技術更為完善、科學。本發明的技術方案:黃芪顆粒指紋圖譜的測定方法包括以下步驟:( I)供試品溶液的制備:取黃芪顆粒粉碎，過篩，稱取粉末，加甲醇溶液溶解，超聲提取I 2次，每次5 30min，然后冷卻，補足損失重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得供試品溶液；(2)對照品溶液的制備:取減壓干燥至恒重的毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素對照品，分別加入甲醇制成對照品溶液；(3)測定:分別精密吸取供試品溶液和對照品溶液，注入高效液相色譜儀測定，記錄色譜圖；供試品溶液注入高效液相色譜儀后，以甲醇-0.5%甲酸水為流動相進行梯度洗脫；(4)用指紋圖譜軟件對所得的圖譜進行處理，即得到黃芪顆粒特征指紋圖譜。前述黃芪顆粒指紋圖譜的測定方法中，高效液相色譜測定時的色譜條件為:色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱；流動相A為甲醇，流動相B為0.5%甲酸水，A: B=2%-90%: 98%-10% ;流速 ImL.mirT1 ;柱溫 30 °C ;檢測波長 254nm。前述黃芪顆粒指紋圖譜的測定方法中，供試品溶液的制備過程為:取黃芪顆粒粉碎，過60目篩，精密稱取粉末1.0g,加入10%甲醇溶液IOmL溶解，超聲提取5min，然后冷卻，補足損失重量，搖勻，濾過，取續濾液過0.45 μ m微孔濾膜，即得供試品溶液。前述黃芪顆粒指紋圖譜的測定方法中，對照品溶液的制備為:取減壓干燥至恒重的毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素對照品，分別加入甲醇，制成每ImL分別含0.562mg毛蕊異黃酮苷、0.254mg芒柄花苷、0.357mg毛蕊異黃酮、0.274mg芒柄花素的對照品溶液。前述黃芪顆粒指紋圖譜的測定方法中，步驟(3)中分別精密吸取供試品溶液和對照品溶液各5-20 μ L，優選為10 μ L0前述黃芪顆粒指紋圖譜的測定方法中，流動相梯度洗脫過程中，洗脫液的A、B相變化為:0 lOmin，A相 2%-2% ；10 15min，A相 2%-3% ；15 20min，A相 3%-10% ;20_25min，A 相 10%-15% ；25-40min, A 相 15%-20% ；40-45min, A 相 20%-30% ；45-50min, A 相 30%-40% ；50-60min, A 相 40%-56% ；60-72min, A 相 56%-70% ；72-80min, A 相 70%-90% ；80-90min, A 相90%-90%。前述黃芪顆粒指紋圖譜的測定方法中，配制好的對照品溶液儲存在4V的冰箱中備用。如前所述黃芪顆粒指紋圖譜的測定方法得到的黃芪顆粒特征指紋圖譜；所述圖譜中的共有峰為23個。與現有技術相比，本發明具有以下優點:1.本發明采用高效液相色譜法，建立黃芪顆粒的特征指紋圖譜分析方法，除了應用常用的相似度分析外，還采用Simca-Pll.5軟件進行主成分分析(PCA)，同時結合SPSS聚類分析對多個批次樣品進行系統分析，能更加全面、客觀、科學評價黃芪顆粒的質量，為黃芪顆粒的合理用藥及進一步藥效研究提供依據與參考。2.本發明建立了黃芪顆粒HPLC特征指紋圖譜共有模式，標定了 23個共有峰，指認了其中4個共有峰，比現有技術指認的色譜峰多，表明其建立的指紋圖譜技術含量高。統計結果顯示，不同生產時間30批次黃芪顆粒被分為兩大類，兩類樣品的色譜峰共有模式具有一定差異，這與黃芪顆粒原料黃芪藥材有兩個法定來源相吻合。因而本發明方法簡便、快捷、準確、穩定、可靠，可用于黃芪顆粒樣品的質量控制。3.由于指紋圖譜不是為了測定某個成分的精確含量，而是要充分反映化學成分的信息。因此，本發明選擇在254nm波長處進行測定，其出峰較多，反映的信息較完全；各個峰吸收值良好，基線平穩，也避免了近紫外雜質峰較大吸收情況。4.本發明方法所得黃芪顆粒指紋圖譜的峰多，峰形好，易于鑒別，相似性高，準確可靠。
下面結合實施例和附圖對本發明做進一步的說明。
圖1是30批次黃芪顆粒指紋圖譜疊加圖；圖2是黃芪顆粒樣品的共有模式圖譜；圖3是不同批次黃芪顆粒樣品主成分分析結果圖；圖4是不同批次黃芪顆粒樣品聚類分析結果圖；圖5是黃芪顆粒樣品的共有模式差異性比較圖；圖6是選用不同提取溶劑的黃芪顆粒HPLC指紋圖譜；圖7是選取不同提取溶劑用量的黃芪顆粒HPLC指紋圖譜；圖8是選取不同超聲提取時間的黃芪顆粒HPLC指紋圖譜；圖9是以甲醇-水為流動相進行梯度洗脫的黃芪顆粒HPLC指紋圖譜；圖10是以乙腈-水為流動相進行梯度洗脫的黃芪顆粒HPLC指紋圖譜；圖11是以甲醇-0.5%甲酸水為流動相進行梯度洗脫的黃芪顆粒HPLC指紋圖譜；圖12是以甲醇-0.1%甲酸水為流動相進行梯度洗脫的黃芪顆粒HPLC指紋圖譜；圖13是以甲醇-0.1%乙酸水為流動相進行梯度洗脫的黃芪顆粒HPLC指紋圖譜；圖14是用色譜柱Diamonsil C18 (4.6mm*150mm, 25 μ m)測得的黃苗顆粒HPLC指紋圖譜；圖15是用色譜柱Hypersil ODS (4.0*250mm，5 μ m)測得的黃芪顆粒HPLC指紋圖
-1'Tfe1曰；圖16 是用色譜柱Agilent ZORBAX SB-C18C4.6*250mm, 5 μ m)測得的黃芪顆粒HPLC指紋圖譜；圖17 是用色譜柱 Agilent ZORBAX SB-C18C4.6*150mm, 5 μ m)測得的黃芪顆粒 HPLC指紋圖譜；圖18是用色譜柱Phecda C18 (4.6*250mm, 5 μ m)測得的黃芪顆粒HPLC指紋圖譜；圖 19 是在 210nm、230nm、254nm、270nm、290nm、300nm、330nm 波長處進行測定的黃芪顆粒HPLC指紋圖譜；圖20是柱溫為25°C、30°C、35°C時測得的黃芪顆粒HPLC指紋圖譜。
具體實施例方式本發明的實施例1:黃芪顆粒指紋圖譜的測定方法包括以下步驟:(I)供試品溶液的制備:取黃芪顆粒粉碎，過60目篩，精密稱取粉末l.0g，加入10%甲醇溶液IOmL溶解，超聲提取5min，然后冷卻，補足損失重量，搖勻，濾過，取續濾液過0.45 μ m微孔濾膜，即得供試品溶液；(2)對照品溶液的制備:取減壓干燥至恒重的毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素對照品，分別加入甲醇，制成每ImL分別含0.562mg毛蕊異黃酮苷、0.254mg芒柄花苷、0.357mg毛蕊異黃酮、0.274mg芒柄花素的對照品溶液(儲存在4°C的冰箱中備用)；(3)測定:色譜條件:色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(5 μ mX4.6X 250mm);流動相 A 為甲醇，流動相 B 為 0.5% 甲酸水，A: B=2%-90%: 98%-10% ；流速ImL.miiT1 ;柱溫30°C ;檢測波長254nm ;分別精密吸取供試品溶液和對照品溶液各10 μ L，注入高效液相色譜儀測定，記錄色譜圖；供試品溶液注入高效液相色譜儀后，以甲醇-0.5%甲酸水為流動相進行梯度洗脫；梯度洗脫過程中，洗脫液的Α、B相變化為:
O lOmin，A 相 2%_2% ;10 15min，A 相 2%_3% ;15 20min，A 相 3%_10% ；20-25min, A相 10%-15% ；25-40min, A 相 15%-20% ；40-45min, A 相 20%-30% ；45-50min, A 相 30%-40% ；50-60min, A 相 40%-56% ；60-72min, A 相 56%-70% ；72-80min, A 相 70%-90% ；80-90min, A 相90%-90% ；(4)用指紋圖譜軟件對所得的圖譜進行處理，即得到黃芪顆粒特征指紋圖譜。本發明的實施例2:黃芪顆粒指紋圖譜的測定方法包括以下步驟:(I)供試品溶液的制備:取黃芪顆粒粉碎，過60目篩，精密稱取粉末l.0g，加入10%甲醇溶液IOmL溶解，超聲提取lOmin，然后冷卻，補足損失重量，搖勻，濾過，取續濾液過
0.45 μ m微孔濾膜，即得供試品溶液；(2)對照品溶液的制備:取減壓干燥至恒重的毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素對照品，分別加入甲醇，制成每ImL分別含0.562mg毛蕊異黃酮苷、0.254mg芒柄花苷、0.357mg毛蕊異黃酮、0.274mg芒柄花素的對照品溶液(儲存在4°C的冰箱中備用)；(3)測定:色譜條件:色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(5 μ mX4.6X 250mm);流動相 A 為甲醇，流動相 B 為 0.5% 甲酸水，A: B=2%-90%: 98%-10% ；流速ImL.miiT1 ;柱溫30°C ;檢測波長254nm ;分別精密吸取供試品溶液和對照品溶液各
5μ L，注入高效液相色譜儀測定，記錄色譜圖；供試品溶液注入高效液相色譜儀后，以甲醇-0.5%甲酸水為流動相進行梯度洗脫；(4)用指紋圖譜軟件對所得的圖譜進行處理，即得到黃芪顆粒特征指紋圖譜。本發明的實施例3:黃芪顆粒指紋圖譜的測定方法包括以下步驟:(I)供試品溶液的制備:取黃芪顆粒粉碎，過60目篩，精密稱取粉末1.0g，加入10%甲醇溶液IOmL溶解，超聲提取2次，每次30min，然后冷卻，補足損失重量，搖勻，濾過，取續濾液過0.45 μ m微孔濾膜，即得供試品溶液；(2)對照品溶液的制備:取減壓干燥至恒重的毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素對照品，分別加入甲醇，制成每ImL分別含0.562mg毛蕊異黃酮苷、0.254mg芒柄花苷、0.357mg毛蕊異黃酮、0.274mg芒柄花素的對照品溶液；(3)測定:色譜條件:色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱；流動相A為甲醇，流動相B為0.5%甲酸水，A: B=2%-90%: 98%-10% ;流速ImL.mirT1 ;柱溫30°C ;檢測波長254nm ;分別精密吸取供試品溶液和對照品溶液各20 μ L，注入高效液相色譜儀測定，記錄色譜圖；供試品溶液注入高效液相色譜儀后，以甲醇-0.5%甲酸水為流動相進行梯度洗脫；(4)用指紋圖譜軟件對所得的圖譜進行處理，即得到黃芪顆粒特征指紋圖譜。實驗例:1.儀器與試藥1.1 儀器安捷倫1260高效液相色譜儀(Agilent G1315D-1260DAD檢測器);KQ_250B型超聲波清潔器(昆山市超聲儀器有限公司，功率250w);電子分析天平(A1205型，梅特勒-托利多儀器，上海有限公司)。
1.2 試藥甲醇，色譜純；乙腈，色譜純；水為蒸餾水；其他試劑為分析純。毛蕊異黃酮苷、毛蕊異黃酮、芒柄花苷、芒柄花素，其批號分別為:M-020-110119，M-021-101215, C-018-101228, M-013-101116，成都瑞芬思生物科技有限公司提供；黃芪顆粒，貴州漢方制藥有限公司提供的2010-2011年生產的30批次黃芪顆粒，其樣品信息見表
1表I不同批次樣品信息表
權利要求
1.一種黃芪顆粒指紋圖譜的測定方法，其特征在于:包括以下步驟: (1)供試品溶液的制備:取黃芪顆粒粉碎，過篩，稱取粉末，加甲醇溶液溶解，超聲提取I 2次，每次5 30min，然后冷卻，補足損失重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得供試品溶液； (2)對照品溶液的制備:取減壓干燥至恒重的毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素對照品，分別加入甲醇制成對照品溶液； (3)測定:分別精密吸取供試品溶液和對照品溶液，注入高效液相色譜儀測定，記錄色譜圖；供試品溶液注入高效液相色譜儀后，以甲醇-0.5%甲酸水為流動相進行梯度洗脫； (4)用指紋圖譜軟件對所得的圖譜進行處理，即得到黃芪顆粒特征指紋圖譜。
2.根據權利要求1所述黃芪顆粒指紋圖譜的測定方法，其特征在于:高效液相色譜測定時的色譜條件為:色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱；流動相A為甲醇，流動相B為0.5% 甲酸水，A: B=2%-90%: 98%-10% ;流速 ImL.mirT1 ;柱溫 30°C ;檢測波長 254nm。
3.根據權利要求1所述黃芪顆粒指紋圖譜的測定方法，其特征在于:供試品溶液的制備過程為:取黃芪顆粒粉碎，過60目篩，精密稱取粉末1.0g，加入10%甲醇溶液IOmL溶解，超聲提取5min，然后冷卻，補足損失重量，搖勻，濾過，取續濾液過0.45 μ m微孔濾膜，即得供試品溶液。
4.根據權利要求1所述黃芪顆粒指紋圖譜的測定方法，其特征在于:對照品溶液的制備為:取減壓干燥至恒重的毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素對照品，分別加入甲醇，制成每ImL分別含0.562mg毛蕊異黃酮苷、0.254mg芒柄花苷、0.357mg毛蕊異黃酮、0.274mg芒柄花素的對照品溶液。
5.根據權利要求1所述黃芪顆粒指紋圖譜的測定方法，其特征在于:步驟(3)中分別精密吸取供試品溶液和對照品溶液各5-20 μ L0
6.根據權利要求5所述黃芪顆粒指紋圖譜的測定方法，其特征在于:步驟(3)中分別精密吸取供試品溶液和對照品溶液各10 μ L0
7.根據權利要求2所述黃芪顆粒指紋圖譜的測定方法，其特征在于:流動相梯度洗脫過程中，洗脫液的Α、B相變化為:0 lOmin，A相2%_2% ;10 15min，A相2%_3% ；15 20min，A 相 3%_10% ；20-25min, A 相 10%_15% ；25-40min, A 相 15%_20% ；40-45min, A相 20%-30% ；45-50min, A 相 30%-40% ；50-60min, A 相 40%-56% ；60-72min, A 相 56%-70% ；72-80min,A 相 70%-90% ；80-90min, A 相 90%_90%。
8.根據權利要求4所述黃芪顆粒指紋圖譜的測定方法，其特征在于:配制好的對照品溶液儲存在4°C的冰箱中備用。
9.如權利要求1 8中任一項所述黃芪顆粒指紋圖譜的測定方法得到的黃芪顆粒特征指紋圖譜。
10.根據權利要求9所述的黃芪顆粒特征指紋圖譜，其特征在于:所述圖譜中的共有峰為23個。
全文摘要
本發明公開了一種黃芪顆粒指紋圖譜的測定方法，包括以下步驟供試品溶液的制備、對照品溶液的制備、高效液相色譜儀測定及對數據和圖譜的處理，以及由該方法得到的黃芪顆粒特征指紋圖譜。與現有技術相比，本發明所得黃芪顆粒指紋圖譜的峰多，峰形好，峰分離效果好，峰面積較大，易于鑒別，相似性高，準確可靠；本發明方法簡便、快捷、準確、穩定、可靠，可用于黃芪顆粒樣品的質量控制，能更加全面、客觀、科學地評價黃芪顆粒的質量，為黃芪顆粒的合理用藥及進一步藥效研究提供了依據與參考。
文檔編號G01N30/02GK103149300SQ201310068779
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月5日 優先權日2013年3月5日
發明者周欣, 陳華國, 趙超, 龔小見, 趙楊, 鄧杰 申請人:貴州師范大學
專業數控銑床產品供應商
20年生產經驗，實力工廠，精工品質，質量有保障
