一種檢測cip清洗系統沖洗水中殘留細菌的方法
【專利摘要】本發明公開了一種檢測CIP清洗系統沖洗水中殘留細菌的方法。包括如下步驟：（1）取至少3份CIP清洗系統沖洗水置于無菌試劑瓶中，分別量取不等量的CIP清洗系統沖洗水，分別經無菌濾膜進行過濾，過濾完畢后將無菌濾膜放入樣品杯中，然后在無菌濾膜上滴加復合熒光試劑，再將樣品杯置于ATP熒光檢測儀中測定各熒光值；（2）分別量取與步驟（1）中等量的CIP清洗系統沖洗水，經無菌濾膜進行過濾，過濾完畢后洗脫無菌濾膜上的細菌，測定CIP清洗系統沖洗水中的菌落總數得到菌落總數與熒光值之間的標準曲線；（3）取待測的CIP清洗系統沖洗水，根據（1）得到熒光值，根據標準曲線即得到待測CIP清洗系統沖洗水中菌落總數。本發明方法對于測定方式的發明創新，簡化了操作程序，減少了誤差來源。
【專利說明】一種檢測CIP清洗系統沖洗水中殘留細菌的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種檢測CIP清洗系統沖洗水中殘留細菌的方法，屬于食品安全檢測方面微生物檢測領域。
【背景技術】
[0002]食品加工企業，諸如乳品、飲料、酒類等行業在產品生產加工過程中需要涉及到設備、管道等的衛生清洗工作，任何一個環節的疏忽都可能帶來難以挽回的經濟損失和惡劣的社會影響。CIP (Cleaning In Place)就地清洗,是指不用拆開或移動裝置，即采用高溫、高濃度的洗凈液，對設備裝置加以強力作用，把與食品的接觸面洗凈，對衛生級別要求較嚴格的生產設備的清洗、凈化，是近幾年食品加工行業為適應大規模生產，符合高品質衛生要求，降低清洗成本而發展起來的清洗技術。隨著食品企業現代化程度的逐步提高，CIP清洗系統未來將會應用到各類食品加工企業當中。CIP工作后要求要對氣味、設備的視覺外觀、微生物污染幾個方面進行評定，其中微生物污染的檢查是難點，也是食品加工的衛生關鍵控制點，如果清洗完畢之后CIP系統沖洗水中殘留細菌過高，會對后期食品加工帶來微生物污染的隱患，而且CIP過程后殘留菌多為耐熱菌，食品加工后期的高溫滅菌措施也難以將其完全殺滅，因此，CIP系統沖洗水中殘留菌的檢測對于食品生產加工衛生管控具有重大的指導意義，必須嚴格控制。
[0003]CIP清洗效果要求達到微生物清潔度或無菌清潔度，根據調研，CIP過程完畢后，食品企業的內控指標要求CIP系統殘留水中細菌總數低于菌落總數國標方法(GB4789.2)的檢測范圍，所以國標方法無法直接檢測與評價CIP清洗后的微生物污染狀況，所以要尋找其他的檢測方法。目前行業內對CIP系統殘留菌的檢測方法有兩種:一是大體積抽濾后再進行平板培養計數。此方法的優點是能夠利用濾膜富集細菌，但是濾膜截留細菌依然要轉入培養基上進行48小的培養，結果雖然較為準確，但是效率太低，CIP清洗之后不可能讓加工設備閑置48小時等待測定結果。二是鏡檢法，此法也是與大體積抽濾結合，方法的優點是縮短了檢測時間，然而鏡檢法把濾膜放在適量的無菌水中，搖動、振蕩，然后再用顯微鏡檢測洗脫水中微生物的數量，程序復雜易被外源微生物污染，在洗脫濾膜截留細菌及轉移過程中帶來的誤差較大且難以避免。從上述方法可見，目前業內缺少測定CIP清洗水殘留菌的標準方法，而替代方法也存在效率低或程序復雜操作誤差較大的缺點，因此，仍有必要開發一種能夠快速、準確、簡單的檢測CIP系統沖洗水中殘留細菌的方法。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是提供一種檢測CIP清洗系統沖洗水中殘留細菌的方法，本發明的方法能夠快速測定CIP系統沖洗水等含菌量極低液體樣品中殘留細菌總數，能及時對CIP系統清洗效果進行評估、對衛生清洗工作進行指導。
[0005]本發明所提供的一種檢測CIP清洗系統沖洗水中殘留細菌的方法，包括如下步驟:[0006](I)取至少3份CIP清洗系統沖洗水置于無菌試劑瓶中，分別記為I號瓶、2號瓶和3號瓶；分別從所述I號瓶、2號瓶和3號瓶中量取不等量的CIP清洗系統沖洗水，分別經無菌濾膜進行過濾，過濾完畢后將所述無菌濾膜放入樣品杯中，然后在所述無菌濾膜上滴加復合熒光試劑，再將所述樣品杯置于ATP熒光檢測儀中測定各熒光值；
[0007](2)分別從所述I號瓶、2號瓶和3號瓶中量取與步驟(I)中等量的CIP清洗系統沖洗水，經所述無菌濾膜進行過濾，過濾完畢后洗脫所述無菌濾膜上的細菌得到洗脫液，測定所述洗脫液中的菌落總數；進而得到菌落總數與熒光值之間的標準曲線；
[0008](3)取待測的CIP清洗系統沖洗水，經所述無菌濾膜進行過濾，過濾完畢后將所述無菌濾膜放入所述樣品杯中，然后在所述無菌濾膜上滴加所述復合熒光試劑，再將所述樣品杯置于所述ATP熒光檢測儀中測定熒光值；然后根據所述熒光值與所述菌落總數之間的標準曲線即得到待測CIP清洗系統沖洗水中菌落總數。
[0009]上述的方法中，步驟(I)中，可分別從所述I號瓶、所述2號瓶和所述3號瓶中量取10mL、50mL和IOOmL所述CIP清洗系統沖洗水。
[0010]上述的方法中，步驟(I)中，所述無菌濾膜的孔徑可為0.45 μ m。
[0011]上述的方法中，所述復合熒光試劑的主要成分為細菌裂解劑和熒光素酶，如中質賽福(北京)科技儀器有限公司生產的產品編號為ZF0011的復合突光試劑。
[0012]上述的方法中，步驟(2)中，洗脫所述無菌濾膜上的細菌的溶劑可為滅菌生理鹽水。
[0013]本發明具有如下優點:
[0014]本發明首次提出并應用了膜上裂解、帶膜測定的新方法。本發明方法對于測定方式的發明創新，簡化了操作程序，在微生物檢測的過程中，減少一步操作程序，就減少了一個誤差來源。而對于企業來說該方法具有顯著的經濟效益方法(本發明能夠讓企業及時對CIP清洗的程序進行把控，快速檢測還能縮短評估時間提高企業的生產效率，在保證清洗效果的同時最大限度的節約水、清洗液、電等資源，還能節省人力及培養基、培養設備等的投入，明顯降低清洗成本。CIP清洗效果的及時把控，能夠減少企業因清洗殘留菌引起的產品微生物污染帶來的浪費，減少浪費等同于創收。)，同時本發明還具有良好的社會效益(本發明能夠幫助企業識別CIP清洗過程中的細菌殘留，降低生產過程受微生物污染的可能性，對提高食品安全水平意義明顯，食品安全狀況的提高對于社會穩定意義重大。)與環境效益(本方法中不涉及有毒有害試劑，膜上裂解能夠將細菌全部裂解，沒有殘留活菌，不會給操作人員帶來危害，檢測過程也沒有副產物產生，監測器具及一次性耗材皆不用特殊處理也不會污染環境。)。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0015]圖1為本發明實施例1中測定的膜上熒光值(RLU)與待測液細菌總數線性關系圖。【具體實施方式】
[0016]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0017]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0018]實施例1、CIP系統殘留水中細菌總數的測定[0019]儀器及耗材:
[0020]ATP熒光檢測儀(SR)012型)；
[0021]無菌注射器(IOmL?50mL)；
[0022]過濾器(可重復使用，先用75%酒精浸泡，用無菌水反復沖洗，無菌條件下晾干或烘干后備用)
[0023]鑷子(塑料，塑料材質用酒精浸泡再用無菌水沖洗，晾干后備用)；
[0024]無菌濾膜(孔徑:0.45 μ m,尺寸:直徑13mm)；
[0025]復合熒光試劑(中質賽福(北京)科技儀器有限公司，產品編號為ZF0011 )，該復合熒光試劑的主要成分為細菌裂解劑和熒光素酶。
[0026]玻璃試管(滅菌后裝5mL無菌生理鹽水備用)；
[0027](I)標準曲線的制定
[0028]取CIP系統最后一道程序完結后的水作為檢測對象，用5個500mL無菌試劑瓶，編號1、2、3、4和5，接待測水儲存備用。取10個過濾器，用鑷子將無菌濾膜放入過濾器，安裝好備用。用注射器吸取I號瓶中水10mL，用安裝好的無菌濾膜和過濾器進行過濾，過濾完畢將無菌濾膜用鑷子取出放入清洗好的樣品杯中，在無菌濾膜上滴加復合熒光試劑，放入ATP熒光檢測儀中測定其熒光值，再用同一注射器再取I號瓶中水IOmL過濾，過濾完畢用無菌鑷子將濾膜取出放入裝有5mL滅菌生理鹽水的玻璃試管中震蕩洗脫細菌，然后按照GB47892-2010方法檢測菌落總數。
[0029]然后分別從2號瓶中取50mL，3號瓶中取100mL，4號瓶中取150mL，5號瓶中取200mL,按照上述操作步驟分別測定各熒光值和菌落總數，將五組對應數據做線性回歸分析得到標準曲線方程Y=aX+b，其中Y代表測得熒光值，X代表菌落總數值(CFU/mL)。
[0030]( 2)樣品的測定與計算
[0031]取50mL待測水用安裝好的無菌濾膜和過濾器過濾，過濾完畢將無菌濾膜用鑷子取出放入清洗好的樣品杯，在無菌濾膜上滴加復合熒光試劑，放入ATP熒光檢測儀中測定熒光值，得熒光值Y，將Y值帶入上述標準曲線方程，即可按照稀釋倍數算出該樣品中細菌總數含量。
[0032]為了驗證本方法的可操作性和準確性，選擇了一家乳品企業實地驗證。按照上述操作方法進行測定。
[0033]試驗參數:
[0034]濃縮:I號空白IOmL無菌水濃縮,2號IOmL待測水濃縮,3號IOOmL待測水濃縮,4號200mL待測水濃縮。
[0035]洗脫參數:5mL無菌生理鹽水洗脫。
[0036]結果如表I所示:
[0037]表I實際樣品測定結果分析-1
【權利要求】
1.一種檢測CIP清洗系統沖洗水中殘留細菌的方法，包括如下步驟: (O取至少3份CIP清洗系統沖洗水置于無菌試劑瓶中，分別記為I號瓶、2號瓶和3號瓶；分別從所述I號瓶、2號瓶和3號瓶中量取不等量的CIP清洗系統沖洗水，分別經無菌濾膜進行過濾，過濾完畢后將所述無菌濾膜放入樣品杯中，然后在所述無菌濾膜上滴加復合熒光試劑，再將所述樣品杯置于ATP熒光檢測儀中測定各熒光值； (2)分別從所述I號瓶、2號瓶和3號瓶中量取與步驟(I)中等量的CIP清洗系統沖洗水，經所述無菌濾膜進行過濾，過濾完畢后洗脫所述無菌濾膜上的細菌，測定CIP清洗系統沖洗水中的菌落總數；進而得到菌落總數與熒光值之間的標準曲線； (3)取待測的CIP清洗系統沖洗水，經所述無菌濾膜進行過濾，過濾完畢后將所述無菌濾膜放入所述樣品杯中，然后在所述無菌濾膜上滴加所述復合熒光試劑，再將所述樣品杯置于所述ATP熒光檢測儀中測定熒光值；然后根據所述熒光值與所述菌落總數之間的標準曲線即得到待測CIP清洗系統沖洗水中菌落總數。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(I)中，分別從所述I號瓶、所述2號瓶和所述3號瓶中量取10mL、50mL和IOOmL所述CIP清洗系統沖洗水。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于:步驟(I)中，所述無菌濾膜的孔徑為0.45 μ m0
4.根據權利要求1-3中任一項所述的方法，其特征在于:所述復合熒光試劑的主要成分為細菌裂解劑和熒光素酶。
5.根據權利要求1-4中任一項所述的方法，其特征在于:步驟(2)中，洗脫所述無菌濾膜上的細菌的溶劑為生理鹽水。
【文檔編號】G01N21/64GK103776807SQ201410030608
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2014年1月22日 優先權日:2014年1月22日
【發明者】侯玉柱, 宋全厚, 尹建軍, 柯潤輝, 張力, 田雨 申請人:中國食品發酵工業研究院
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