比色法測定血清中脂肪酶含量的檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種比色法測定血清中脂肪酶含量的檢測試劑盒，由試劑R1和試劑R2組成，所述試劑R1含有1～200mmol/L?pH＝7.6～9.0的緩沖液、1～20mmol/L脫氧膽酸鹽、1～10mg/L共脂肪酶和0.5～2g/L防腐劑；所述試劑R2含有1～200mmol/L?pH＝4.0～6.0的緩沖液、1～20mmol/L脂肪酶底物、0.2～10mmol/L膽酸鹽、1～10ml/L二甲亞砜和防腐劑。本發明的試劑盒底物為脂肪酶的人工合成底物，穩定性佳，有較大的臨床應用價值；通過該試劑盒來檢測血清中的LPS含量，可達到操作簡便、穩定性佳、特異性好，快速、測定結果準確可靠的目的。
【專利說明】比色法測定血清中脂肪酶含量的檢測試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明具體涉及一種比色法測定血清中的脂肪酶(LPS)含量的檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002]脂肪酶(甘油三酯酰基水解酶)是一種糖蛋白，含有420?449個氨基酸殘基，其特異的底物是含長鏈脂肪酸的甘油三酯。血清脂肪酶主要從胰腺細咆分泌而來，胰腺中脂肪酶濃度比肝、十二指腸及小腸中高10倍，比血清中高20000倍，十二指腸與血清間差500-800倍，正常胰腺中脂肪酶活性相當于淀粉酶活性的4.5倍。目前由于選擇用于診斷胰腺炎的脂肪酶測定閾值較低，所有脂肪酶的測定方法臨床靈敏度都很高，而診斷的特異性變化卻很大。在胰腺炎診斷中脂肪酶測定的特異性優于淀粉酶。
[0003]脂肪酶測定是1932年Cherry和CrandalI首先提出的。之后對測定時間、特異性、重復性和靈敏度進行了大量改進。通過改進底物及加入膽酸鹽和共脂肪酶可使血清中非特異性的脂解反應降至最低。比如，用含長鏈脂肪酸的甘油三酯作為底物可增加反應的特異性，減少非特異性酯酶的反應。膽酸鹽可使胰腺脂肪酶固定于底物乳狀液的油水界面上，但過量的膽酸鹽可抑制脂肪酶活性，此抑制過程可被共脂肪酶特異性地逆轉。由于患胰腺炎病人常缺乏共脂肪酶或其活力低于正常值，因此在過量膽酸鹽存在時測定脂肪酶而額外加入共脂肪酶是很重要的，這樣可提高胰腺脂肪酶的特異性。脂肪酶在臨床的意義:正常人血液LPS含量極少，但在急性胰腺炎時，2?12h血液LPS顯著升高，24h至峰值，可達正常值上限的10倍，甚至50倍，至48?72h可能恢復正常但隨后又可持續升高8?15天。由于血液LPS在急性胰腺炎時活性升高的時間早，上升的幅度的大，持續的時間長，故其診斷價值優于淀粉酶。臨床觀察發現，凡血液AMY升高的病例，其LPS均升高；而LPS升高者AMY不一定升高，約有2/3AMY正常的胰腺炎病人，其LPS正常；非胰腺炎的急腹癥有血液AMY升高而LPS不升高。酗酒、乙醇性胰腺炎、慢性胰腺炎、胰腺癌、肝膽疾患等血液LPS可有不同程度的升高。
[0004]目前測定脂肪酶的方法有比濁法、pH-Stat法、免疫測定法和酶偶聯顯色比色法。比濁法是基于三油酸甘油酯轉變為甘油二酯時甘油三酯乳濁液濁度在340或365nm處降低。該方法有某些缺陷，主要與一些樣品早期反應階段的非線性及其線性范圍有關。早期反應階段吸收率的增加常與患者的類風濕因子有關，甘油三酯濃度> 5.5g/L干擾測定，血紅蛋白濃度> 2g/L引起酶活性降低。pH-Stat法是基于脂肪酶水解釋放脂肪酸導致反應液PH降低，采用一支pH電極或一種指示劑如酚酞，進行連續滴定檢測。該方法與免疫化學法相關性很好，但因其費時、費力、難于自動化及需要特殊的儀器，而在一個時期未被廣泛采用。免疫測定法是將脂肪酶特異性抗體固定于試管壁上，使其與脂肪酶結合，連著過氧化物酶及分離的脂肪酶抗原的二抗結合于脂肪酶上，形成一個夾心“三明治”，用一種色素原溶液鏡頭培養，在492nm下測定吸光度的增加率。該法靈敏度高，故較適宜測定胰腺機能不全患者的脂肪酶，但該法較費時，故不適用于急性胰腺炎的檢測。酶偶聯顯色比色法，多用1，
2-甘油二酯為底物，在LPS和單酸甘油酯脂肪酶的催化下，水解生成甘油和脂肪酸，甘油通過甘油激酶作用生成3-磷酸甘油，再通過甘油磷酸氧化酶/過氧化物酶體系和4-AAP色素原體系產生紫紅色。于550nm波長連續監測吸光度的變化即可計算LPS活性。此類方法特異性高，通過雙試劑也基本可解決內源性甘油的干擾問題。但是酶偶聯顯色法，工具酶的價格昂貴，而且酶來源少且不穩定。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在于克服上述現有試劑盒存在的缺陷，提供一種比色法測定血清中的脂肪酶(LPS)含量的檢測試劑盒。本發明通過該比色法測試試劑盒來檢測血清中的LPS含量，以達到操作簡便、穩定性佳、特異性好，快速、測定結果準確可靠的目的。
[0006]本發明的目的是通過以下技術方案來實現的:
[0007]本發明涉及一種比色法測定血清中的脂肪酶含量的檢測試劑盒，由試劑Rl和試劑R2組成，所述試劑Rl含有I?200mmol/L pH = 7.6?9.0的緩沖液、I?20mmol/L脫氧膽酸鹽、I?10mg/L共脂肪酶和0.5?2g/L防腐劑；所述試劑R2含有I?200mmol/LpH = 4.0?6.0的緩沖液、I?20mmol/L脂肪酶底物、0.2?10mmol/L膽酸鹽、I?1ml/L 二甲亞砜和0.5?2g/L防腐劑。
[0008]上述試劑Rl中的脫氧膽酸鹽可使胰腺脂肪酶固定于底物乳狀液的油水界面上；共脂肪酶可特異性地逆轉由于脫氧膽酸鹽過量所引起的脂肪酶活性被抑制的過程。試劑R2中一定濃度(I?10ml/L)的二甲亞砜對共脂肪酶有激活作用。
[0009]優選的，所述試劑Rl含有50?150mmol/L pH = 7.0?8.0的緩沖液、I?1mmoI/L脫氧膽酸鹽、I?5mg/L共脂肪酶和0.5?1.0g/L防腐劑；所述試劑R2含有50?150mmol/L pH = 4.0?5.0的緩沖液、10?20mmol/L脂肪酶底物、0.2?5mmol/L膽酸鹽、3?8ml/L 二甲亞諷和0.5?lg/L防腐劑。
[0010]優選的，所述脂肪酶底物為1，2-鄰二月桂基-消旋-甘油-3-戊二酸-(6-甲基試鹵靈)酯。該脂肪酶底物為人工合成，穩定性好。
[0011]優選的，所述試劑Rl、R2中包含的緩沖液分別選自三羥甲基氨基甲烷(TRIS)J磺酸(MOPS)、4_羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、酒石酸、2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)、三乙醇胺(TEA)和檸檬酸鈉中的一種或幾種。
[0012]優選的，所述試劑R1、R2中包含的防腐劑分別選自疊氮化鈉、Proclin300、聚賴氨酸、山梨酸鉀和乙酸鈉中的一種或幾種。
[0013]本發明還涉及一種上述的檢測試劑盒的使用方法，試劑Rl加入樣本后37°C孵育3分鐘，再加入試劑R2，37°C孵育I分鐘，連續監測3分鐘的吸光度變化率，與LPS標準品的脂肪酶含量與吸光度關系曲線進行比較，得到樣本的脂肪酶含量。
[0014]優選的，所述試劑Rl和試劑R2的體積比為2:1或4:1。
[0015]本發明試劑盒的檢測原理為:以1，2_鄰二月桂基-消旋-甘油-3-戊二酸-(6-甲基試鹵靈)酯為底物，在堿性環境并有膽酸和共脂肪酶參與下被脂肪酶水解，生成1，2_鄰二月桂基-消旋-甘油和一個不穩定的中間體戊二酸-?-甲基試鹵靈)酯；該中間體在堿性條件下，繼續水解，產生戊二酸和甲基試齒靈。甲基試齒靈顯示紅色，顯色強度和脂肪酶活力成正比。
[0016]與現有技術相比，本發明具有如下有益效果:
[0017]1、R1試劑中加入了脫氧膽酸鹽和共脂肪酶，可使血清中非特異性的脂解反應降至最低，脫氧膽酸鹽可使胰腺脂肪酶固定于底物乳狀液的油水界面上，但過量的膽酸鹽可抑制脂肪酶活性，而共脂肪酶可特異性地逆轉該抑制過程。
[0018]2、現在市售LPS試劑所使用的樣本和試劑Rl、R2的比例多數為2: 200: 100，而本發明試劑除了能用以上參數進行檢測，還可以用4: 200: 50的參數來進行檢測；而且對于本發明的試劑而言，這兩種方法的檢測結果類似，這樣有效節省了試劑，從而降低成本。
[0019]3、R2試劑中的脂肪酶底物為人工合成，性質穩定，有利于提高試劑37°C穩定性以及效期穩定性；且R2試劑中的二甲亞砜可激活共脂肪酶活性。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0020]通過閱讀參照以下附圖對非限制性實施例所作的詳細描述，本發明的其它特征、目的和優點將會變得更明顯:
[0021]圖1為LPS參考標準的標準曲線，其中X軸表示LPS的含量，Y軸表示吸光度。
[0022]圖2為分別采用本發明試劑和美國貝克曼公司的LPS試劑，采用日立全自動生化分析儀對50份人血清(包含正常和異常標本)按各自參數同時進行測定，對測定值進行相關分析的示意圖；其中，X軸表示的是本發明試劑測定的病人血清結果，Y軸表示的是美國貝克曼公司試劑測定的病人血清結果，相關系數R2 = 0.9921，回歸方程為y =
1.0244X+1.5184。
【具體實施方式】
[0023]下面結合具體實施例對本發明進行詳細說明。以下實施例將有助于本領域的技術人員進一步理解本發明，但不以任何形式限制本發明。應當指出的是，對本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進。這些都屬于本發明的保護范圍。以下實施例中的原料均為現有常用原料，可以直接通過商家購買獲得。本發明以下實施例中沒有特別說明的操作，均可以采用現有常規技術手段。
[0024]實施例1
[0025]測定試劑盒組成如下:
[0026]1.試劑 Rl 為:
[0027]
pH8.0 TRIS 緩沖液 50 mmol/L
脫氧膽酸鹽2 mmol/L
共脂肪酶2mg/L
聚賴氨酸lg/L
[0028]2.試劑 R2 為:
[0029]
【權利要求】
1.一種比色法測定血清中的脂肪酶含量的檢測試劑盒，由試劑Rl和試劑R2組成，其特征在于，所述試劑Rl含有I?200mmol/L pH = 7.0?9.0的緩沖液、I?20mmol/L脫氧膽酸鹽、I?10mg/L共脂肪酶和0.5?2g/L防腐劑；所述試劑R2含有I?200mmol/L pH =4.0?6.0的緩沖液、I?20mmol/L脂肪酶底物、0.2?10mmol/L膽酸鹽、I?10ml/L 二甲亞砜和0.5?2g/L防腐劑。
2.根據權利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑Rl含有50?150mmol/L pH = 7.0?8.0的緩沖液、I?10mmol/L脫氧膽酸鹽、I?5mg/L共脂肪酶和0.5?Ig/L防腐劑；所述試劑R2含有50?150mmol/L pH = 4.0?5.0的緩沖液、10?20mmol/L脂肪酶底物、0.2?5mmol/L膽酸鹽、3?8ml/L 二甲亞砜和0.5?lg/L防腐劑。
3.根據權利要求1或2所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述脂肪酶底物為1，2_鄰二月桂基-消旋-甘油-3-戊二酸-(6-甲基試鹵靈)酯。
4.根據權利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑Rl、R2中包含的緩沖液分別選自TRIS、M0PS、HEPES、酒石酸、MES、TEA和檸檬酸鈉中的一種或幾種。
5.根據權利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑Rl、R2中包含的防腐劑分別選自疊氮化鈉、Proclin300、聚賴氨酸、山梨酸鉀和乙酸鈉中的一種或幾種。
6.一種根據權利要求1?5中任一項所述的檢測試劑盒的使用方法，其特征在于，試劑Rl加入樣本后37°C孵育3分鐘，再加入試劑R2，37°C孵育I分鐘，連續監測3分鐘的吸光度變化率，與LPS標準品的脂肪酶含量與吸光度關系曲線進行比較，得到樣本的脂肪酶含量。
7.根據權利要求6所述的檢測試劑盒的使用方法，其特征在于，所述試劑Rl和試劑R2的體積比為2:1或4:1。
【文檔編號】G01N21/78GK104198474SQ201410401510
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年8月14日 優先權日:2014年8月14日
【發明者】李偉奇, 陳瑛, 房君江, 張秀文, 林清玉 申請人:上海睿康生物科技有限公司
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