作為抗結核病藥的吡啶并嘧啶化合物的制作方法
【專利摘要】一種作為抗結核病藥的吡啶并嘧啶化合物。本發明涉及小分子化合物及其在治療細菌感染、特別是肺結核中的應用。
【專利說明】作為抗結核病藥的吡啶并嘧啶化合物
[0001]本申請是申請日為2009年6月17日、申請號為200980128440.2、發明名稱為“作為抗結核病藥的吡啶并嘧啶化合物”的發明專利申請的分案申請。
[0002]本發明涉及小分子化合物及其在治療細菌感染、特別是肺結核中的應用。
[0003]發明背景
[0004]肺結核(TB)作為疾病每年持續導致數以百萬計的死亡。化療的不充分應用已經導致抗藥性病例的數量逐步增加。這種情況可能惡化對所有目前已知藥物的極端耐藥性株的出現(Van Rie和Enarson，2006)。國際上推薦的TB控制策略、也稱作直接觀察到的短程化療(DOTS)依賴于5種抗菌藥的組合服用超過6個月的延長期限(http://www.wh0.1nt/tb/dots/en/)。由于使用了數學模型、考慮到了治療期限和TB動力學，所以預測減少治療期限的有益性是顯著的并且能夠極大地促進總體TB負擔下降(Salomon等人，2006)。
[0005]目前化療由通過中和一般信息途徑和關鍵過程(例如RNA聚合和蛋白質合成抑制)或通過干擾分枝桿菌特異性細胞包膜合成直接祀向結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)桿狀菌的化合物組成。最廣泛使用的專用抗結核藥異煙肼、乙硫異煙胺和吡嗪酰胺是第一種需要活化的前體藥物。當活性成分形成時，它們顯示對尚未完全得到表征的廣泛分枝桿菌靶標的抑制活性。就其他慢性感染性疾病(如人免疫缺陷病毒)而言，迄今為止經證實多-療法手段(包括靶向結核分枝桿菌廣泛關鍵特征的藥物)是最成功的策略。因此，可能的情況是具有對結核分枝桿菌不同作用機制的目前藥物抑制劑的組合會解決控制疾病的問題。
[0006]用于研發新抗-TB藥的最具有挑戰性的手段依賴于篩選靶向桿狀菌存活必需的關鍵特征的活性化合物。盡管仍然缺乏對在人體中結核桿菌持久性后面的生物學機制即潛在菌的位置和狀態的理解，但是認為結核分枝桿菌居留于低氧條件下的初期肉芽腫中(Lenaerts等人,2007)并且隱藏于各種類型的細胞內(Houben等人,2006 ;Neyrolles等人，2006)。桿狀菌主要位于吞噬細胞例如巨噬細胞和樹突細胞內部，并且顯然已經確立與胞外條件中的生長相比，結核桿菌采取了宿主巨噬細胞吞噬體內的不同表型(Rohde等人，2007 ;Schnappinger等人,2003)。在感染時,誘導炎癥應答，由此開始募集釋放白細胞介素和細胞因子的T淋巴細胞，由此活化感染的巨噬細胞以便能夠破壞病原體。在適合的觸發后，宿主巨噬細胞由此能夠消除侵入的桿狀菌。這一結果進一步得到如下事實的支持:吸入結核分枝桿菌的人有95%以上不發病，從而啟示在大部分病例中人體宿主應答足以阻止結核分枝桿菌誘導的發病機制。這產生如下推定:小分子化合物可以模擬免疫細胞應答信號并且誘導宿主細胞清除分枝桿菌。
[0007]因此，本發明的一個目的在于研發適合于高流通量篩選的基于表型細胞的測定法，所述高流通量篩選能夠搜索到可以預防結核分枝桿菌在宿主巨噬細胞內部繁殖的化合物。
[0008]迄今為止，這種類型的結核桿菌在宿主細胞內的生長研究依賴于宿主細胞裂解后的菌落形成單位(CFUs)測定、然后是系列稀釋和細菌在瓊脂板上生長所需的3-周溫育期限。已經證實表達熒光素酶的分枝桿菌有效減少實驗期限，不過，仍然需要細胞裂解和熒光素底物添加步驟(Arain等人，1996)。此外，這些類型的實驗不易于進行大規模篩選。
[0009]本發明的另一個目的在于鑒定對細菌感染有效的化合物，特別是可以預防結核分枝桿菌在宿主巨噬細胞內繁殖的化合物。
[0010]本發明的描述
[0011]本發明在一個方面中涉及具有通式VIII的化合物:
[0012]
【權利要求】
1.篩選方法，其包括下列步驟: (a)用經熒光標記的結核分枝桿菌分批感染宿主細胞； (b)除去游離的未結合的分枝桿菌； (c)將待測試的化合物添加到多孔板上； (d)將感染了經熒光標記的結核分枝桿菌的所述宿主細胞接種入包含所述化合物的所述多孔板； (e)溫育包含感染了經熒光標記的結核分枝桿菌的宿主細胞和所述化合物的所述多孔板； (f)熒光標記所述宿主細胞； (g)使用自動化共焦顯微鏡檢查分析所述多孔板。
2.權利要求1的方法，其中所述篩選方法尋找干擾在所述宿主細胞內結核分枝桿菌繁殖的化合物。
3.權利要求1或2的方法，其中所述宿主細胞為巨噬細胞，優選地活巨噬細胞。
4.權利要求1至3中任一項的方法，其中所述自動化共焦熒光顯微鏡檢查測量胞內分枝桿菌生長。
5.權利要求1至4中任一項的方法，其中步驟(g)包括，對于每一種化合物，測量: -總宿主細胞數目，例如總巨噬細胞數目； -被感染的宿主細胞的百分比；和/或 -感染抑制百分比。
6.權利要求5的方法，其中: (i)低的(總)細胞數目表明了所述化合物的毒性和/或在巨噬細胞內結核分枝桿菌的不受限制的生長； (?)高的(總)細胞數目表明了所述化合物是非毒性的并且阻止分枝桿菌生長。
7.前述權利要求中任一項的方法，其包括使用選自下列中的至少一個的對照: -替代步驟(C)中的化合物，添加具有已知的抗結核病活性的化合物(作為陽性對照)，例如異煙肼、利福平、乙硫異煙胺或莫西沙星； -替代步驟(c)中的化合物，添加DMSO或抗生素對照(作為陰性對照)。
8.前述權利要求中任一項的方法，其中所述結核分枝桿菌用GFP進行標記。
9.前述權利要求中任一項的方法，其中所述宿主細胞用SYT060進行標記。
10.前述權利要求中任一項的方法，其中在步驟(b)之后，用抗生素，優選地阿米卡星進行溫育。
11.前述權利要求中任一項的方法，其用于大規模化學品庫的高流通量篩選(HTS)。
12.在權利要求1至11中任一項的方法之中鑒定出的化合物，其干擾在宿主細胞內，優選地在宿主巨噬細胞內結核分枝桿菌的繁殖。
13.權利要求12的化合物，其由下式所示:
N—Nο
【文檔編號】G01N21/64GK103983627SQ201410219962
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2009年6月17日 優先權日:2008年6月17日
【發明者】P·布羅丹, T·克里斯托夫, 盧載成, 金在昇, A·熱諾韋西奧, D·P·C·費尼斯坦, 全希暻, F·A·埃旺, 姜善姬, 李世淵, 徐旼廷, 樸垠錚, M·孔特雷拉斯多明格斯, 南芝娟, 金恩惠 申請人:韓國巴斯德研究所, 國家健康與醫學研究院
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