番茄潰瘍病菌有活力菌體的流式細胞術計數方法
【專利摘要】本發明公開了一種番茄潰瘍病菌有活力菌體的流式細胞術計數方法。本發明公開一種檢測待測樣品中有活力菌體的方法，包括如下步驟：將待測樣品進行SYTO9染色，使用絕對計數管計數，得到待測樣品的總細胞數或總細胞濃度。本發明公開的流式細胞儀結合絕對計數管的方法，實現了番茄潰瘍病菌的快速、準確定量，解決了有活力的番茄潰瘍病菌的定量檢測問題，該方法既可用于番茄潰瘍病菌的基礎微生物學研究，又可應用于農業生產中病原物的檢測、病害診斷和植物檢疫工作中，在微生物學及植物保護領域應用前景廣闊。
【專利說明】番茄潰瘍病菌有活力菌體的流式細胞術計數方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種活力菌體的計數方法，特別是涉及一種番茄潰瘍病菌有活力菌體的流式細胞術計數方法，屬于微生物學與植物保護學交叉領域。
【背景技術】
[0002]番爺潰瘍病是番爺生產中最為嚴重、具有毀滅性的病害之一。該病于1909年在美國密執安州的溫室番茄上首次發現。20世紀30年代、60年代、80年代，該病先后在美國中西部地區、北卡羅來那州及加拿大安大略地區大流行，造成的產量損失最高達80%以上。1943-1946年期間，該病在英國大流行，使番茄罐頭產業受到嚴重影響。目前，世界上60多個國家報道了該病的發生危害，遍及美洲、歐洲、亞洲、非洲和大洋洲。
[0003]我國于1954年首次有番茄潰瘍病的記載。目前，該病害在北京、天津、黑龍江、吉林、遼寧、內蒙古、新疆、甘肅、寧夏、青海、四川、云南、廣西、海南、河北、山西、山東、河南、安徽、上海等省、市、自治區都有發生，番茄產業受到了不同程度的影響。2007年該病原菌被列入《中華人民共和國進境植物檢疫性有害生物名錄》。
[0004]目前，生產上常用銅制劑或抗生素來防治番茄潰瘍病，但效果并不理想。開展種子健康檢測，從源頭上控制帶菌種子進入生產環節，或是在生產中及早發現并清除病株，是防治番茄潰瘍病的有效手段。因此，快速、特異性定量檢測有活力的番茄潰瘍病菌是種子帶菌檢測的關鍵，也是生產中亟待解決的問題。
[0005]在當前種子或植物材料攜帶有活力番茄潰瘍病菌的檢測中，基于選擇性培養基分離培養的B1-PCR方法是被廣泛采用的標準方法，但該方法不能用于檢測處于損傷(injure)狀態或不可培養(viable but non-culturable, VBNC)狀態的番爺潰瘍病菌，因此可能造成假陰性的結果，給生產帶來潛在風險。
[0006]流式細胞術結合Live/Dead BacLight試劑盒的方法能夠區分細菌的活細胞和死細胞。該方法將兩種核酸染料SYT09和碘化丙啶(PI)混合使用，對細菌菌體進行染色，判斷細胞的活性，其原理是SYT09可以穿過完整的細胞膜，進入菌體內與核酸結合而呈現綠色熒光。PI只能通過破損的細胞膜進入菌體結合核酸而呈現紅色熒光。若使用SYT09和PI對細胞進行雙染，呈現綠色熒光的細胞則為有活性的細胞。隨后，將染色后的細菌經過流式細胞儀計數，從而實現定量檢測有活力的細菌菌體。但由于番茄潰瘍病菌菌體較小、細胞壁偏厚，使用現有的試劑盒并按照說明書提供的方法，并不能很好地區分有活力和失活的菌體。因此，在現有方法的基礎上通過研究和改進，篩選和調整染料和染色方法，獲得有活力番茄潰瘍病菌的計數方法，實現對該病原菌有活力菌體的快速計數，對在生產中控制番茄潰瘍病的傳播蔓延和發生危害具有重要意義。
【發明內容】
[0007]本發明的目的是提供一種番茄潰瘍病菌有活力菌體的流式細胞術計數方法。
[0008]本發明提供一種檢測待測樣品中有活力菌體的方法，包括如下步驟:將待測樣品進行SYT09染色，使用絕對計數管計數，得到待測樣品的總細胞數或總細胞濃度；將待測樣品進行PI染色，使用絕對計數管計數，得到待測樣品的死細胞數或死細胞濃度；用待測樣品的總細胞數減去待測樣品的死細胞數得到待測樣品中有活力菌體的細胞數，或，用待測樣品的總細胞濃度減去待測樣品的死細胞濃度得到待測樣品中有活力菌體的濃度。
[0009]上述方法中，所述使用絕對計數管計數是采用流式細胞儀結合絕對計數管進行計數的。
[0010]上述任一所述的方法中，所述流式細胞儀的FSC電壓模式為E00，SSC電壓為440V，放大模式為Log型，進樣速度為中速。
[0011]上述任一所述的方法中，所述將待測樣品進行SYT09染色，使用絕對計數管計數時，流式細胞儀檢測時以FLl (530/30nm)作為檢測通道，電壓為640V。
[0012]上述任一所述的方法中，所述將待測樣品進行PI染色，使用絕對計數管計數時，流式細胞儀檢測時以FL2 (585/42nm)作為檢測通道，電壓為625V。
[0013]上述任一所述的方法中，所述待測樣品中菌的濃度為105_107CFU/ml。
[0014]上述任一所述的方法中，所述SYT09染色時SYT09在所述待測樣品中的濃度為50 μ mol/L ；
[0015]所述SYT09染色時染色時間為20-40min，具體為30min。
[0016]上述任一所述的方法中，所述PI染色時PI在所述待測樣品中的濃度為150μπιο1/L ；
[0017]所述PI染色時染色時間為30-60min，具體為50_60min，再具體為60min。
[0018]上述任一所述的方法中，所述菌為番茄潰瘍病菌。
[0019]上述任一所述的方法中，所述待測樣品為番茄潰瘍病菌菌懸液。
[0020]本發明采用流式細胞儀結合絕對計數管的方法，實現了番茄潰瘍病菌的快速、準確定量，解決了有活力番茄潰瘍病菌的定量檢測問題，該方法既可用于番茄潰瘍病菌的基礎微生物學研究，又可應用于農業生產中病原物檢測、病害診斷和植物檢疫工作中，在微生物學及植物保護領域應用前景廣闊。本發明的方法可以間接應用在病害的源頭控制上，減少化學農藥的噴施，具有降低農藥公害和保護生態的作用；可減少農業生產成本，具有一定的經濟效益；服務于社會，具有顯著的生態效益和社會效益。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0021]圖1為流式細胞儀檢測法與平板計數法對番茄潰瘍病菌檢測的相關性。
[0022]圖2為流式細胞儀計數結果與番茄潰瘍病菌樣品稀釋倍數的相關性。
[0023]圖3為SYT09染色的番茄潰瘍病菌的流式細胞檢測圖(FSC通道)。
[0024]圖4為SYT09染色的番茄潰瘍病菌的流式細胞檢測圖(FLl通道)。
[0025]圖5為SYT09染色的番茄潰瘍病菌的流式細胞檢測圖(FL2通道)。
[0026]圖6為SYTO BC和SYTO 9對番茄潰瘍病菌的染色效果。
[0027]圖7為PI染色的番茄潰瘍病菌死細胞的流式細胞檢測圖(FSC通道)。
[0028]圖8為PI染色的番茄潰瘍病菌死細胞的流式細胞檢測圖(FLl通道)。
[0029]圖9為PI染色的番茄潰瘍病菌死細胞的流式細胞檢測圖(FL2通道)。
[0030]圖10為PI對番茄潰瘍病菌死細胞的染色效果。
[0031]圖11為空白對照的流式細胞檢測圖(FSC通道)。
[0032]圖12為空白對照的流式細胞檢測圖(FLl通道)。
[0033]圖13為空白對照的流式細胞檢測圖(FL2通道)。
[0034]圖14為激光共聚焦顯微鏡對SYTO 9 (A)和PI (B)染色的番茄潰瘍病菌的熒光信號觀察。
[0035]圖15為SYT09和PI混合后對番茄潰瘍病菌進行雙染的流式細胞儀檢測圖。
[0036]上述流式細胞儀檢測圖中的Rl區域是絕對計數管中微球的位置，R2區域是番茄潰瘍病菌的位置，R3區域是SYTO染色呈陽性的位置，R4區域是PI染色呈陽性的位置。
【具體實施方式】
[0037]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0038]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0039]番爺潰瘍病菌(Clavibactermichiganensis subsp.michiganensis)在文獻“羅來鑫，李健強，Hasan Bolkan.番茄細菌性潰瘍病苗期接種新方法的研究[J].植物病理學報，2005，35(2):123-128.”中公開過，公眾可從中國農業大學獲得。
[0040]SYTO 9 購自 Life technologies 公司。
[0041]SYTO BC 購自 Life technologies 公司。
[0042]PI 購自 Life technologies 公司。
[0043]絕對計數管購自BD B1sciences公司。
[0044]流式細胞儀BD FACSCalibur 購自 BD B1sciences 公司。
[0045]實施例1、番茄潰瘍病菌的絕對計數
[0046]—、挑取活化的番茄潰瘍病菌單菌落，添加到1mL LB液體培養基中，置于28°C、140rpm振蕩培養22h至對數生長后期；
[0047]二、取Iml步驟一培養得到的菌液于12000rpm離心3min,收集菌體，用
0.85g/100ml的NaCl水溶液洗滌2次后，再用0.85g/100ml的NaCl水溶液制備不同稀釋倍數的番茄潰瘍病菌菌懸液；
[0048]三、取各稀釋度的菌懸液300μ 1，采用平板計數法進行涂板計數，將涂板后的LB平板置于28°C培養3d，選取合適濃度的平板進行計數，濃度換算公式如下:
[0049]
菌落數(CFU) /皿X稀釋倍數細菌濃度(CFU/ml)=-
涂板液體積(ml)
[0050]四、將稀釋液的剩余700 μ I加入到絕對計數管中，采用流式細胞儀對細胞進行檢測，通過調整流速、各檢測通道的電壓、細胞位置等參數，實現對番茄潰瘍病菌的絕對計數，
濃度換算公式如下:
[0051]
Η檢測到的細胞數(cell) X管中微球數細菌濃度(cell/ml)=-
檢測到的微球數X細胞液體積(ml)
[0052]流式細胞儀的檢測參數設置為:FSC電壓模式為E00，SSC電壓為440，放大模式為Log型,進樣速度為中速。
[0053]以圖4為示例圖，縱坐標SSC通道檢測值反應了細胞的密度，橫坐標FSC通道檢測細胞的大小，Rl區域為絕對計數管中的微球所在的位置，R2區域為番茄潰瘍病菌所在的位置。
[0054]以平板計數法濃度為橫坐標，FCM計數濃度為縱坐標作圖，結果如圖1所示。
[0055]圖1表明，與Line One相比較，Line Two表明流式細胞儀對番茄潰瘍病菌的最佳計數范圍為105-107CFU/ml，在此范圍內，流式細胞儀的計數結果與平板法的計數結果的相關性好，相關系數R2為0.9955。
[0056]流式細胞儀的計數結果與稀釋倍數的相關性如圖2所示，相關系數R2為0.9996。
[0057]實施例2、番茄潰瘍病菌的活菌檢測
[0058]在不同的染色條件下，用實施例1的方法對番茄潰瘍病菌進行絕對計數，并與平板計數法的結果進行比較，根據相關性確定適合的染料種類、染料比例、染色時間、流式細胞儀參數等。
[0059]利用實施例1的流式細胞檢測條件(流式細胞儀的型號為BD FACSCalibur，流式細胞儀的檢測參數設置為=FSC電壓模式為E00，SSC電壓為440V，放大模式為Log型，進樣速度為中速)進行下述步驟一和二的實驗。
[0060]一、篩選文獻中已報道的用于細菌活力檢測的核酸染料，選用SYTO 9和SYTO BC分別對番茄潰瘍病菌染色，設置染料在菌液中的終濃度為50 μ mol/1，細菌在菌液中的終濃度為107CFU/ml (105-107CFU/ml均可)，染色時間設置為20min、30min、40min，用流式細胞儀收集5000個細胞(R2區域有5000個細胞)，流式細胞儀檢測時以FLl (530/30nm)作為檢測通道，電壓為640V。
[0061]SYT09染色的番茄潰瘍病菌的流式細胞檢測圖(FSC通道)如圖3所示。
[0062]SYT09染色的番茄潰瘍病菌的流式細胞檢測圖(FLl通道)如圖4所示。
[0063]SYT09染色的番茄潰瘍病菌的流式細胞檢測圖(FL2通道)如圖5所示。
[0064]其中，FL2通道為 585/42nm。
[0065]其中圖3和圖4為SYTO 9染色的示例圖，R3區域顯示的是SYTO 9染色呈陽性的細菌。
[0066]SYTO 9和SYTO BC的染色結果如圖6所示。圖6中，橫坐標為染色時間，縱坐標為SYTO染色呈陽性的細胞比例，即R3區域檢測到的細胞數占R2區域檢測到的細胞數的比值。
[0067]圖6表明，在不同的染色時間下，SYTO 9對番茄潰瘍病菌的染色效果均顯著優于SYTO BC，最佳染色時間為30min。
[0068]其中SYTO 9陽性的細菌濃度(cell/ml)可按照如下公式進行計算:
[0069]
_R3區域檢測到的細胞數(cell) X管中微球數細菌濃度(celL/mj)=-
Rl區域檢測到的微球數X細胞液體積(ml)
[0070]二、選用PI對死細菌(番茄潰瘍病菌經80°C加熱20min)染色，設置染料在菌液中的終濃度為150 μ mol/1，死細菌在菌液中的終濃度為107CFU/ml (15-107CFU/ml均可)，染色時間設置為30min、40min、50min、60min，收集5000個細胞(R2區域有5000個細胞)，流式細胞儀檢測時以FL2 (585/42nm)作為檢測通道，電壓為625V。
[0071]PI染色的番茄潰瘍病菌死細胞的流式細胞檢測圖(FSC通道)如圖7所示。
[0072]PI染色的番茄潰瘍病菌死細胞的流式細胞檢測圖(FLl通道)如圖8所示。
[0073]PI染色的番茄潰瘍病菌死細胞的流式細胞檢測圖(FL2通道)如圖9所示。
[0074]其中，FLl通道為 530/30nm。
[0075]其中圖7和圖9為PI染色的示例圖，R4區域顯示的是PI染色呈陽性的細菌。
[0076]PI的染色結果如圖10所示。圖10中，橫坐標為染色時間，縱坐標為PI染色呈陽性的細胞比值，即R4區域檢測到的細胞數占R2區域檢測到的細胞數的比值。
[0077]圖10表明，在不同的染色時間下，PI對番茄潰瘍病菌死菌的最佳染色時間為50_60mino
[0078]其中PI陽性的細菌濃度(cell/ml)可按照如下公式進行計算:
[0079]
R4區域檢測到的細胞數(cell) X管中微球數細菌濃度(ccll/ml)=-
Rl區域檢測到的微球數X細胞液體積(nil)
[0080]三、利用實施例1的流式細胞檢測條件(流式細胞儀的型號為BD FACSCalibur,流式細胞儀的檢測參數設置為=FSC電壓模式為E00，SSC電壓為440V，放大模式為Log型，進樣速度為中速)和本實施例的步驟一和步驟二篩選出的染色條件(SYT0 9終濃度為50μπιΟ1/1，細菌終濃度為107CFU/ml，染色時間為30min，流式細胞儀檢測時以FLl (530/30nm)作為檢測通道，電壓為640V ;PI終濃度為150 μ mol/1，細菌終濃度為107CFU/ml，染色時間為60min，流式細胞儀檢測時以FL2 (585/42nm)作為檢測通道，電壓為625V)，分別用SYTO 9或PI對同一個人工制備的活、死細胞混合的番茄潰瘍病菌樣品(其中未處理的菌和加熱致死的菌的數量比為1:1，制備時為同一番茄潰瘍病菌樣品，一半不做處理，一半經80°C加熱20min成死細胞，再混合)進行染色，流式細胞儀收集5000個細胞，并以不進行任何染色的番茄潰瘍病菌作為空白對照。
[0081]活細菌濃度計算公式如下:
[0082]有活力的細菌濃度(cell/ml) = SYTO 9陽性的細菌濃度(cell/ml)-PI陽性的細菌濃度(cell/ml)
[0083]結果如表I所示，表I中，未處理的細胞和死細胞樣品的總細胞、死細胞的濃度均是分別通過步驟二的SYT09染色、PI染色檢測得到的，可培養的細胞濃度是通過平板計數法得到的。混合樣品中總細胞、死細胞的濃度的理論值是根據未處理的細胞和死細胞樣品的總細胞、死細胞、可培養細胞的濃度計算得到的；檢測值是分別通過步驟二的SYT09染色、PI染色檢測得到的，可培養細胞濃度是通過平板計數法得到的。
[0084]表I流式細胞儀檢測活、死細胞混合的番茄潰瘍病菌樣品
[0085]
【權利要求】
1.一種檢測待測樣品中有活力菌體的方法，包括如下步驟:將待測樣品進行SYT09染色，使用絕對計數管計數，得到待測樣品的總細胞數或總細胞濃度；將待測樣品進行PI染色，使用絕對計數管計數，得到待測樣品的死細胞數或死細胞濃度；用待測樣品的總細胞數減去待測樣品的死細胞數得到待測樣品中有活力菌體的細胞數，或，用待測樣品的總細胞濃度減去待測樣品的死細胞濃度得到待測樣品中有活力菌體的濃度。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:所述絕對計數管計數是采用流式細胞儀結合絕對計數管進行計數的。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述待測樣品中菌的濃度為105-107CFU/ml。
4.根據權利要求1-3任一所述的方法，其特征在于:所述SYT09染色時SYT09在所述待測樣品中的濃度為50 μ mol/L ； 所述SYT09染色時染色時間為20-40min，具體為30min。
5.根據權利要求1-4任一所述的方法，其特征在于:所述PI染色時PI在所述待測樣品中的濃度為150 μ mol/L ； 所述PI染色時染色時間為30-60min，具體為50_60min，再具體為60min。
6.根據權利要求1-5任一所述的方法，其特征在于:所述菌為番茄潰瘍病菌。
7.根據權利要求1-6任一所述的方法，其特征在于:所述待測樣品為番茄潰瘍病菌菌懸液。
【文檔編號】G01N15/14GK104181093SQ201410400015
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年8月14日 優先權日:2014年8月14日
【發明者】羅來鑫, 蔣娜, 李健強, 許新, 劉西莉, 曹永松, 阮小珀 申請人:中國農業大學
專業數控銑床產品供應商
20年生產經驗，實力工廠，精工品質，質量有保障
