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一種基于納米顆粒和化學發光的核酸適體傳感器及制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種基于納米顆粒和化學發光的核酸適體傳感器，以[email protected]磁性納米顆粒和雙功能化金納米顆粒作為固相載體，活化的羧基化[email protected]磁性納米顆粒與氨基修飾的核酸適體結合形成磁性納米顆粒-核酸適體復合物，再與雙功能化金納米顆粒雜交形成磁性納米顆粒-核酸適體-雙功能化金納米顆粒復合物，最后與鏈霉親和素標記的堿性磷酸酶結合，得到所述傳感器。本發明還公開了其制備方法和應用。該核酸適體傳感器具有磁性便于快速磁分離，又具有化學發光法快速、高效檢測的優點，在生物醫學檢測方面具有很大的應用價值。
【專利說明】一種基于納米顆粒和化學發光的核酸適體傳感器及制備方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及核酸適體傳感器【技術領域】，特別是一種以納米顆粒為固相載體和化學發光法為檢測手段的核酸適體傳感器及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002]磁性納米顆粒具有分離速度快、效率高、操作簡單、易實現功能化、易實現自動化及不影響分離物質的活性等優越的物理化學性質和生物相容性，目前已被廣泛應用于細胞的分離分選，生物大分子的分離、純化和檢測，靶向診斷與治療等諸多領域。其中，以磁性納米顆粒進行生物大分子檢測主要是通過在其表面修飾上特異性的探針或抗體后即可利用它們對目標靶分子進行特異性的檢測。
[0003]金納米顆粒是納米材料領域研究的熱點，具有小尺寸效應、表面效應、量子效應和良好的生物相容性，在納米電子學、納米涂層材料、納米催化、分子識別和生物標記等領域有著巨大的潛在應用價值。
[0004]核酸適體傳感器是以核酸適體作為生物識別分子的生物傳感器。與抗體相比，核酸適體具有體外合成、特異性高、結合力強、穩定性好、易于修飾等優點，構建基于核酸適體的生物傳感器具有廣闊的應用前景。將核酸適體與不同的方法或儀器結合，可形成不同的核酸適體傳感器，如電化學核酸適體傳感器、突光核酸適體傳感器、化學發光核酸適體傳感器、表面等離子體共振核酸適體傳感器等。現有化學發光核酸適體傳感器分離操作比較繁瑣，而且不便于化學發光信號的放大，導致檢測速度和靈敏度受到一定的影響。

【發明內容】

[0005]本發明的目的是提供一種基于納米顆粒和化學發光的核酸適體傳感器，以納米顆粒為固相載體和化學發光法作為檢測手段，便于快速磁分離，又具有化學發光法快速、高效檢測的優點，本發明還公開了其制備方法和應用。
[0006]本發明采用以下技術方案:
[0007]一種基于納米顆粒和化學發光的核酸適體傳感器，以Fe3O4OSiO2磁性納米顆粒和雙功能化金納米顆粒作為固相載體，所述Fe3O4OSiO2磁性納米顆粒與氨基修飾的核酸適體結合形成磁性納米顆粒-核酸適體復合物，然后再與雙功能化金納米顆粒雜交形成磁性納米顆粒-核酸適體-雙功能化金納米顆粒復合物，最后與鏈霉親和素標記的堿性磷酸酶結合，得到所述基于納米顆粒和化學發光的核酸適體傳感器；所述的Fe3O4OSiO2磁性納米顆粒是經過羧基化并活化；所述雙功能化金納米顆粒表面修飾兩種DNA序列，一種是巰基修飾的與核酸適體部分互補的DNA序列，另一種是巰基和生物素雙修飾的與鏈霉親和素標記的堿性磷酸酶特異結合的DNA序列。
[0008]上述基于納米顆粒和化學發光的核酸適體傳感器的制備方法，包括如下步驟:
[0009]步驟一、制備Fe3O4磁性納米顆粒,在所述Fe3O4磁性納米顆粒表面包覆一層娃殼，得到Fe3O4OSiO2磁性納米顆粒，再對Fe3O4OSiO2磁性納米顆粒表面羧基化修飾，得到羧基化Fe3O4OSiO2磁性納米顆粒，之后進行羧基活化，得到活化的羧基化Fe3O4OSiO2磁性納米顆粒;
[0010]步驟二、制備金納米顆粒，在所述金納米顆粒表面修飾兩種DNA序列，一種是巰基修飾的與核酸適體部分互補的DNA序列，另一種是巰基和生物素雙修飾的與鏈霉親和素標記的堿性磷酸酶特異結合的DNA序列，得到雙功能化金納米顆粒；
[0011]步驟三、氨基修飾的核酸適體與步驟一制備的活化的羧基化Fe3O4OSiO2磁性納米顆粒結合形成磁性納米顆粒-核酸適體復合物；
[0012]步驟四、將步驟三制備的磁性納米顆粒-核酸適體復合物與步驟二制備的雙功能化金納米顆粒雜交形成磁性納米顆粒-核酸適體-雙功能化金納米顆粒復合物；
[0013]步驟五、鏈霉親和素標記的堿性磷酸酶與步驟四制備的磁性納米顆粒-核酸適體-雙功能化金納米顆粒復合物結合，得到所述基于納米顆粒和化學發光的核酸適體傳感器。
[0014]步驟一所述Fe3O4磁性納米顆粒采用軟模板法制備,所述Fe3O4OSiO2磁性納米顆粒經種子聚合法和經典StOber法制備；所述Fe3O4OSiO2磁性納米顆粒表面羧基化修飾是先將Fe3O4OSiO2磁性納米顆粒表面氨基化，再利用丁二酸酐進行表面羧基化修飾；所述羧基活化為碳化二亞胺一步法活化羧基。
[0015]步驟二所述金納米顆粒采用檸檬酸鈉還原法制備。
[0016]步驟四所述雜交條件為37 V雜交45min。
[0017]上述基于納米顆粒和化學發光的核酸適體傳感器在待測靶分子定性和定量分析中的應用。
[0018]上述基于納米顆粒和化學發光的核酸適體傳感器在待測靶分子定性和定量分析中的應用方法，包括如下步驟:在所述基于納米顆粒和化學發光的核酸適體傳感器中加入待測靶分子，待測靶分子與核酸適體特異結合，將連接鏈霉親和素標記的堿性磷酸酶的雙功能化金納米顆粒替換下來；之后磁分離，在上清液中加入化學發光底物，進行化學發光信號檢測。
[0019]所述化學發光底物為AMPro。
[0020]本發明的有益效果:
[0021]1、本發明以納米顆粒作為固相載體，將核酸適體固定在磁性納米顆粒表面，利用其磁性便于快速磁分離，將催化化學發光的堿性磷酸酶固定在雙功能化金納米顆粒表面，有利于化學發光信號放大，同時可避免Fe3O4顆粒對化學發光的遮蔽性。
[0022]2、本發明以化學發光法作為檢測手段，具有快速、高效、靈敏度高的優點，并且采用堿性磷酸酶催化的AMPro化學發光體系，具有背景低、發光時間長的特點，因此具有廣闊的應用前景。
[0023]3、本發明的適用范圍廣，通過改變使用不同的核酸適體及在雙功能化金納米顆粒表面修飾與相應核酸適體部分互補的DNA序列，可實現對不同靶分子進行檢測及定量分析。
【專利附圖】

【附圖說明】[0024]圖1是實施例1制備的Fe3O4OSiO2磁性納米顆粒的透射電鏡圖。
[0025]圖2是實施例2制備的金納米顆粒透射電鏡圖。
[0026]圖3是基于納米顆粒和化學發光的核酸適體傳感器構建原理圖。
[0027]圖4是實施例4凝血酶濃度與化學發光強度的線性關系圖。
【具體實施方式】
[0028]下面結合實施例和附圖對本發明做更進一步地解釋。以下特定的實施例旨在更詳細地描述本發明。這些實施例的目的在于解釋本發明，而不應理解為限定本發明的范圍。
[0029]在外磁場作用下磁性納米顆粒表現出良好的磁響應性，可方便地將微粒與介質分離開來；當撤去外加磁場后，磁性納米顆粒又可重新懸浮于液相介質中而不聚集。因此使用磁性納米顆粒作為載體可實現快速分離而又不影響其特性。金納米顆粒可簡單、方便地與巰基修飾的配體通過金硫鍵共價結合，也是一種良好的納米載體。
[0030]一種基于納米顆粒和化學發光的核酸適體傳感器，以Fe3O4OSiO2磁性納米顆粒和雙功能化金納米顆粒作為固相載體，所述Fe3O4OSiO2磁性納米顆粒與氨基修飾的核酸適體結合形成磁性納米顆粒-核酸適體復合物，然后再與雙功能化金納米顆粒雜交形成磁性納米顆粒-核酸適體-雙功能化金納米顆粒復合物，最后與鏈霉親和素標記的堿性磷酸酶結合，得到所述基于納米顆粒和化學發光的核酸適體傳感器；所述的Fe3O4OSiO2磁性納米顆粒是經過羧基化并活化；所述雙功能化金納米顆粒表面修飾兩種DNA序列，一種是巰基修飾的與核酸適體部分互補的DNA序列，另一種是巰基和生物素雙修飾的與鏈霉親和素標記的堿性磷酸酶特異結合的DNA序列。
[0031]上述基于納米顆粒和化學發光的核酸適體傳感器的制備方法，以磁性納米顆粒和金納米顆粒作為固相載體，以化學發光法作為檢測手段，包括如下步驟:
[0032]步驟一、采用軟模板法制備粒徑在500nm左右的Fe3O4磁性納米顆粒，經種子聚合
法和經典StOber法在其表面包覆一層硅殼，制備粒徑在550nm左右的Fe3O4OSiO2磁性納米
顆粒，再對其表面進行羧基化修飾，得到羧基化Fe3O4OSiO2磁性納米顆粒，保存于無水乙醇中。羧基化Fe3O4OSiO2磁性納米顆粒在使用前需要進行羧基活化。
[0033]所述Fe3O4磁性納米顆粒的制備方法包括共沉淀法，溶劑熱法，軟模板法，微乳液法，熱分解法等物理或化學方法。這些方法都可以用于本發明Fe3O4磁性納米顆粒的制備，所列舉的制備方法只是舉例說明本發明，不能以任何方式限制本發明的范圍。
[0034]所述Fe3O4OSiO2磁性納米顆粒表面羧基化修飾是先將Fe3O4OSiO2磁性納米顆粒表面氨基化，再利用丁二酸酐進行表面羧基化修飾。
[0035]所述羧基化Fe3O4OSiO2磁性納米顆粒的羧基活化包括碳化二亞胺(EDC) —步法活化和EDC、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)兩步法活化。以下實施例采用的是EDC —步法活化。
[0036]步驟二、采用檸檬酸鈉還原法制備金納米顆粒，再將金納米顆粒表面修飾兩種DNA序列，一種是巰基修飾的與核酸適體部分互補的DNA序列，另一種是巰基和生物素雙修飾的與鏈霉親和素標記的堿性磷酸酶特異結合的DNA序列，得到雙功能化金納米顆粒。
[0037]所述金納米顆粒的制備方法包括真空蒸鍍法、激光消融法、檸檬酸鈉還原法、硼氫化鈉還原法、反膠束法、噴霧熱解法等。這些方法都可以用于本發明金納米顆粒的制備，所列舉的制備方法只是舉例說明本發明，不能以任何方式限制本發明的范圍。[0038]步驟三、氨基修飾的核酸適體與步驟一制備的活化的羧基化Fe3O4OSiO2磁性納米顆粒結合形成磁性納米顆粒-核酸適體復合物；
[0039]步驟四、將步驟三制備的磁性納米顆粒-核酸適體復合物與步驟二制備的雙功能化金納米顆粒雜交形成磁性納米顆粒-核酸適體-雙功能化金納米顆粒復合物。
[0040]所述的雜交條件為37 V雜交45min。
[0041]步驟五、催化化學發光的鏈霉親和素標記的堿性磷酸酶與步驟四制備的磁性納米顆粒-核酸適體-雙功能化金納米顆粒復合物結合，得到所述基于納米顆粒和化學發光的核酸適體傳感器。
[0042]上述基于納米顆粒和化學發光的核酸適體傳感器在待測靶分子定性和定量分析中的應用方法，包括如下步驟:在所述基于納米顆粒和化學發光的核酸適體傳感器中加入待測靶分子，待測靶分子與核酸適體特異結合，將連接鏈霉親和素標記的堿性磷酸酶的雙功能化金納米顆粒替換下來；之后磁分離，在上清液中加入化學發光底物AMPPD，利用堿性磷酸酶催化AMPH)化學發光體系進行化學發光信號檢測。
[0043]所述化學發光體系常見的有魯米諾化學發光體系、酸性高錳酸鉀化學發光體系、光澤精化學發光體系、AMPro化學發光體系、過氧草酸酯化學發光體系等。所列舉的化學發光體系只是舉例說明本發明，不能以任何方式限制本發明的范圍。
[0044]以下實施例選用凝血酶的核酸適體并對其進行氨基修飾(以下簡稱序列1)，其序列如 SEQ ID N0.1 所示(3，-NH2 修飾):5’ -AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT-NH2-3’。與序列I部分互補的巰基修飾的DNA序列(以下簡稱序列2)，其序列如SEQ ID N0.2所示(3’ -SH修飾):5’ -CTACCACGGACTGATCTCTAG-SH-3’。巰基與生物素雙修飾的與鏈霉親和素標記的堿性磷酸酶特異結合的DNA序列(以下簡稱序列3)，其序列為:5’-Biotin-TCGCAGTGT-SH-3’。
[0045]實施例1活化的羧基化Fe3O4OSiO2磁性納米顆粒的制備
[0046]Fe3O4磁性納米顆粒采用軟模板法制備，Fe3O4OSiO2磁性納米顆粒采用種子聚合法和經典StOber法制備；具體制備過程參照發明申請CN102568728A實施例1進行。所制備的
顆粒具有大小均一、分散性好的特點；然后對其表面進行羧基化修飾。
[0047]具體實驗過程如下所述。
[0048](I)、首先采用軟模板法制備粒徑在500nm左右的Fe3O4磁性納米顆粒，再經種子聚合法和經典SlObcr法在其表面包覆一層硅殼，制備粒徑在550nm左右的Fe3O4OSiO2磁性納米顆粒。圖1給出了 Fe3O4OSiO2磁性納米顆粒的透射電鏡圖，可以看出顆粒呈球形、大小均勻，內層黑色區域為Fe3O4核而外層灰色區域為SiO2殼，該顆粒具有較好的分散性，粒徑約為 550nmo
[0049](2)、Fe3O4OSiO2磁性納米顆粒表面氨基化。取上述5mL濃度為10mg/mL的Fe3O4OSiO2磁性納米顆粒，磁分離棄掉上清液后,加入20mL無水乙醇/水(體積比19.9/0.1)混合溶液，超聲30min ;再加入40 μ L3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，在室溫下混合振蕩5h ；然后，利用外加磁場將APETS修飾的磁性納米顆粒從反應介質中分離出來，并用無水乙醇對其清洗5次；最后將表面氨基化修飾的Fe3O4OSiO2磁性納米顆粒分散在20mL N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，保存備用。
[0050](3)、[email protected]磁性納米顆粒表面羧基化修飾。將上述20mL分散在DMF中的氨基化Fe3O4OSiO2磁性納米顆粒逐滴加入20mL DMF溶解的0.lmol/L 丁二酸酐(SA)溶液中，在室溫下混合振蕩24h。用雙蒸水清洗數次，獲得羧基化Fe3O4OSiO2磁性納米顆粒，并保存備用。
[0051](4)、EDC —步法活化羧基化Fe3O4OSiO2磁性納米顆粒
[0052]用25mmol/L pH5的2_ (N-嗎啉)-乙磺酸一水合物(MES)緩沖液在外加磁場作用下清洗上述羧基化Fe3O4OSiO2磁性納米顆粒2次，使羧基化Fe3O4OSiO2磁性納米顆粒分散于5mL MES緩沖液中。
[0053]臨用前用保存于4°C的25mmol/L pH5的MES溶液配制10mg/mL的EDC溶液，取上述分散于MES中的羧基化Fe3O4OSiO2磁性納米顆粒lmL，加入IOOyL EDC溶液，在37°C緩慢震搖30min。
[0054]在磁場作用下棄去上清液，用25mmol/L pH5的MES緩沖液清洗3次，洗去未參與活化反應的EDC，獲得活化的羧基化Fe3O4OSiO2磁性納米顆粒，并保存于IOmL MES緩沖液中。
[0055]實施例2雙功能化金納米顆粒的制備
[0056]首先采用檸檬酸鈉還原法制備金納米顆粒，再將金納米顆粒與兩種不同的巰基修飾的DNA結合,制備雙功能化金納米顆粒。
[0057]具體實驗過程如下所述。
[0058](I)、采用檸檬酸鈉還原法制備金納米顆粒。帶冷凝管的燒瓶內先加入48ml雙蒸水，再加入2mllwt%的HAuCl4.3H20溶液，劇烈攪拌下加熱至沸騰，攪拌轉速750r/min ;沸騰5min后，快速加入5ml38.8mmol/L的檸檬酸鈉溶液；變色后繼續回流15min，然后移走加熱設備，自然冷卻至室溫，4°C貯存。圖2給出了金納米顆粒透射電鏡圖，可以看出顆粒呈球形，大小均勻，分散性好，粒徑在15nm左右。
[0059](2)、10 μ LI μ mol/L 的序列 2 與 200 μ LI μ mol/L 的序列 3，加入 20μ L30mmol/L三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)，37°C緩慢震搖活化Ih ;然后加入0.5mL上述制備的金納米顆粒，37°C緩慢震搖2h ;最后13000rpm離心30min，紅色油狀沉淀物溶解在0.2mL雙蒸水中，得到雙功能化金納米顆粒。
[0060]實施例3基于納米顆粒和化學發光的核酸適體傳感器的構建
[0061](1)、0.1nmol序列I與lmLlmg/mL的已活化的羧基化Fe3O4OSiO2磁性納米顆粒，37°C緩慢震搖lh，用0.01mol/L pH7.4的PBS溶液清洗3次，最后溶解在0.5mL雙蒸水中，得到磁性納米顆粒-核酸適體復合物。
[0062](2),0.5mL上述磁性納米顆粒-核酸適體復合物與0.2mL實施例2制備的雙功能化金納米顆粒在37 V雜交45min，用0.01mol/L pH7.4的PBS溶液清洗3次，得到磁性納米顆粒-核酸適體-雙功能化金納米顆粒復合物，溶解在0.5mL雙蒸水中。
[0063](3)、0.5mL上述磁性納米顆粒_核酸適體_雙功能化金納米顆粒復合物與100 μ L1: 3000稀釋的lmg/mL的鏈霉親和素標記的堿性磷酸酶溶液，37°C緩慢震搖1.5h，用
0.01mol/L pH7.4的PBS溶液清洗3次，最后溶解在0.6mL雙蒸水中，構建具有催化化學發光性能的核酸適體傳感器。圖3給出了基于納米顆粒和化學發光的核酸適體傳感器構建原理圖。
[0064]實施例4利用所制備的核酸適體傳感器檢測凝血酶
[0065]實施例3構建的用于檢測凝血酶的核酸適體傳感器，每管取200 μ L，磁分離棄掉上清液后加入不同濃度的凝血酶各300 μ L，37°C緩慢震搖lOmin，使凝血酶與核酸適體特異結合從而替換出結合有堿性磷酸酶的雙功能化金納米顆粒；磁分離后，取上清液50 μ L，加入150 μ L0.25mmol/L的AMPH)溶液，測定化學發光強度。圖4給出了不同濃度凝血酶與化學發光強度的線性關系圖，從圖中可以看出，在I?lOOng/mL范圍內兩者之間具有良好的線性關系。
【權利要求】
1.一種基于納米顆粒和化學發光的核酸適體傳感器，其特征在于，以Fe3O4OSiO2磁性納米顆粒和雙功能化金納米顆粒作為固相載體，所述Fe3O4OSiO2磁性納米顆粒與氨基修飾的核酸適體結合形成磁性納米顆粒-核酸適體復合物，然后再與雙功能化金納米顆粒雜交形成磁性納米顆粒-核酸適體-雙功能化金納米顆粒復合物，最后與鏈霉親和素標記的堿性磷酸酶結合，得到所述基于納米顆粒和化學發光的核酸適體傳感器；所述的Fe3O4OSiO2磁性納米顆粒是經過羧基化并活化；所述雙功能化金納米顆粒表面修飾兩種DNA序列，一種是巰基修飾的與核酸適體部分互補的DNA序列，另一種是巰基和生物素雙修飾的與鏈霉親和素標記的堿性磷酸酶特異結合的DNA序列。
2.權利要求1所述的基于納米顆粒和化學發光的核酸適體傳感器的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: 步驟一、制備Fe3O4磁性納米顆粒,在所述Fe3O4磁性納米顆粒表面包覆一層娃殼,得到Fe3O4OSiO2磁性納米顆粒，再對Fe3O4OSiO2磁性納米顆粒表面羧基化修飾，得到羧基化Fe3O4OSiO2磁性納米顆粒，之后進行羧基活化,得到活化的羧基化Fe3O4OSiO2磁性納米顆粒; 步驟二、制備金納米顆粒，在所述金納米顆粒表面修飾兩種DNA序列，一種是巰基修飾的與核酸適體部分互補的DNA序列，另一種是巰基和生物素雙修飾的與鏈霉親和素標記的堿性磷酸酶特異結合的DNA序列,得到雙功能化金納米顆粒； 步驟三、氨基修飾的核酸適體與步驟一制備的活化的羧基化Fe3O4OSiO2磁性納米顆粒結合形成磁性納米顆粒-核酸適體復合物； 步驟四、將步驟三制備的磁性納米顆粒-核酸適體復合物與步驟二制備的雙功能化金納米顆粒雜交形成磁性納米顆粒-核酸適體-雙功能化金納米顆粒復合物； 步驟五、鏈霉親和素標記的堿性磷酸酶與步驟四制備的磁性納米顆粒-核酸適體-雙功能化金納米顆粒復合物結合，得到所`述基于納米顆粒和化學發光的核酸適體傳感器。
3.根據權利要求2所述的基于納米顆粒和化學發光的核酸適體傳感器的制備方法，其特征在于，步驟一所述Fe3O4磁性納米顆粒采用軟模板法制備,所述Fe3O4OSiO2磁性納米顆粒經種子聚合法和經典St0bcr法制備；所述Fe3O4OSiO2磁性納米顆粒表面羧基化修飾是先將Fe3O4OSiO2磁性納米顆粒表面氨基化，再利用丁二酸酐進行表面羧基化修飾；所述羧基活化為碳化二亞胺一步法活化羧基。
4.根據權利要求2所述的基于納米顆粒和化學發光的核酸適體傳感器的制備方法，其特征在于，步驟二所述金納米顆粒采用檸檬酸鈉還原法制備。
5.根據權利要求2所述的基于納米顆粒和化學發光的核酸適體傳感器的制備方法，其特征在于，步驟四所述雜交條件為37V雜交45min。
6.權利要求1所述的基于納米顆粒和化學發光的核酸適體傳感器在待測靶分子定性和定量分析中的應用。
7.—種權利要求1所述的基于納米顆粒和化學發光的核酸適體傳感器在待測靶分子定性和定量分析中的應用方法，其特征在于，包括如下步驟:在所述基于納米顆粒和化學發光的核酸適體傳感器中加入待測靶分子，待測靶分子與核酸適體特異結合，將連接鏈霉親和素標記的堿性磷酸酶的雙功能化金納米顆粒替換下來；之后磁分離，在上清液中加入化學發光底物，進行化學發光信號檢測。
8.根據權利要求7所述的基于納米顆粒和化學發光的核酸適體傳感器在待測靶分子定性和定量 分析中的應用方法，其特征在于，所述化學發光底物為AMPH)。
【文檔編號】G01N21/76GK103743722SQ201410001112
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2014年1月2日 優先權日:2014年1月2日
【發明者】何農躍, 習志江 申請人:東南大學