專利名稱：25羥維生素d檢測試劑盒及其制備方法
技術領域：
本發明涉及臨床體外診斷及醫學免疫學領域；具體地涉及一種免疫檢測試劑；更進一步地，本發明涉及一種25羥維生素D檢測試劑盒及其制備方法。
背景技術：
維生素D也稱抗佝僂病維生素，又可分為維生素D2和維生素D3。維生素D2多含于植物性食物中，它是由植物的麥角固醇經陽光照射而合成的，維生素D3可由人體皮膚和脂肪組織在7-脫氫膽固醇經過陽光照射合成。維生素D2屬脂溶性維生素，來自食物中的維生素D與脂肪一起經小腸吸收，在膽汁協助下形成乳糜微粒，由淋巴管進入血液，與自身合成的維生素D3 —起轉運入肝臟。在肝臟中經肝細胞微粒體中的單氧酶系統(25-羥化酶)的作用，形成25羥維生素D。25羥維生素D在腎近端小管上皮細胞線粒體內α羥化酶系統的作用下轉變為1，25 (OH)2D3，它是維生素D最大的生物作用形式，可以促進腸道鈣結合蛋白的合成。而25羥維生素D是代謝中的主要循環形式，能夠反映機體的維生素D水平。維生素D缺乏又稱維生素D缺乏性佝僂病。常見于嬰幼兒，多見于膳食中缺乏維生素D，或者是人體缺乏陽光的照射。由于體內維生素D不足而引起鈣、磷代謝障礙，鈣鹽不能正常地沉積于骨骼的生長部分，以致出現生長骨發生病變為特征的一種慢性營養性疾病，稱為佝僂病。如果該病發生于成人，則出現發育成熟骨骼的鈣化不全，稱為骨軟化癥。研究還表明，維生素D缺乏可能使某些癌癥、心血管疾病、自身免疫性疾病和感染性疾病的發病風險升聞。根據當前糖尿病報告雜志上發表的結果，3，262例年齡50-70歲之間的中國人參加的一項研究表明94%的人維生素D缺乏或不足，這些人中有42%還有代謝綜合征。其它一些研究表明，維生素D缺乏和不足在中國的孕婦以及6-16歲的兒童中也很常見。而長期攝入過多的維生素D(5000IU)，將引起高血鈣和高尿鈣。特征為食欲減退，過度口渴、惡心、嘔吐、煩躁、體弱、便泌腹瀉交替出現，嚴重者將因腎鈣化、心臟和大動脈鈣化而死亡。隨著醫療專業人員和患者意識到維生素D缺乏的潛在健康風險，實驗室檢驗量激增，需要我們提供更快、更準、更有效的檢測方法，幫助醫生和患者更早的得到檢測結果。目前25羥維生素D的測定方法主要有酶聯免疫法(如CN102628872A中公開的方法和試劑盒，以及DRG提供的25-0H維他命D (總)檢測試劑盒EIA5396)、放射免疫法(如Hollis BW等人，1985)、液相色譜-質譜檢測法(如鄭曉艷等人，2012)以及化學發光法(如單詠梅等人，2011 ;索靈生產的25-羥基總維生素D定量測定試劑盒(化學發光法))。酶聯免疫法自動化程度不高，且受人為因素影響較大。放射免疫法存在著環境污染問題；液相色譜質譜操作復雜，用時較長；而化學發光法靈敏度雖高，但檢測成本較高，需要特定化學發光儀，這些原因導致其應用范圍較小。本發明采用膠乳增強免疫透射比濁法測定人樣本中25羥維生素D濃度，該方法對儀器設備要求不高，沒有環保和操作人員自身防護等問題。而目前市場上還未出現膠乳增強免疫透射比濁法測定人樣本中25羥維生素D濃度的試劑盒，與其它測定方法比較，本方法簡便快速、靈敏可靠，普通自動或半自動生化分析儀就可，有較大應用范圍和實用價值。
發明內容
根據本發明的第一方面，提供了一種25羥維生素D檢測試劑盒，其包含第一試劑，和第二試劑。第一試劑包含25羥維生素D抗體、維生素D結合蛋白抗體和緩沖液，第二試劑包含結合有25羥維生素D抗原的微球和緩沖液。在一些實施方式中，第一試劑和第二試劑中的緩沖液選自磷酸緩沖液、甘氨酸緩沖液、MES緩沖液、硼酸緩沖液、醋酸鹽緩沖液、2-嗎啉乙磺酸緩沖液或氯化銨緩沖液中的一種或幾種；緩沖液濃度為10-500mM。在一些實施方式中，第一試劑和第二試劑中的緩沖液類型可以相同也可以不同；第一試劑和第二試劑中的緩沖液濃度可以相同也可以不同。在一些優選實施方式中，第一試劑和第二試劑中的緩沖液類型相同；第一試劑和第二試劑中的緩沖液濃度不同。在一個具體實施方式
中，第一試劑的緩沖液是50mM MES緩沖液；第二試劑的緩沖液是20mM MES緩沖液。本領域技術人員可以理解，隨著緩沖液類型、濃度等因素的改變，緩沖液的PH值可以有所不同。在一些實施方式中，25羥維生素D抗體為多克隆抗體或單克隆抗體；維生素D結合蛋白抗體為多克隆抗體或單克隆抗體；其中多克隆抗體源自兔、羊或雞，單克隆抗體源自鼠或兔。在一些實施方式中，所述25羥維生素D抗原為自然抗原或人工合成抗原。在一些實施方式中，所述微球是由聚苯乙烯、丙烯酸、丙烯酸相關酯類中的一種或幾種聚合而成的膠乳顆粒；微球直徑在150-500nm之間。在一個具體實施方式
中，所述微球是聚苯乙烯膠乳顆粒，微球直徑為223nm。根據需要，根據本發明的25羥維生素D檢測試劑盒還包括校準品，校準品主要用于校準測量系統、評價測量程序或為待測樣本賦值。因此，所述校準品包含已知濃度的25羥維生素D，校準品的值甚至可以追溯至參考物質或者追溯至參考方法(IS017511:2003)。本領域技術人員可以根據待測物質的濃度范圍，采用本領域常用的方法自行制備適當濃度的校準品，也可以使用市售校準品、或制造商提供的工作校準品等。在一些具體實施方式
中，根據本發明的25羥維生素D檢測試劑盒還包括若干不同濃度的校準品，例如2個、3個、4個、5個甚至更多濃度的校準品。在一個實施方式中，本發明的25羥維生素D檢測試劑盒包括5個不同濃度的校準品。校準品含有25輕維生素D(分別為，但不限于，20ng/ml、45ng/ml、65ng/ml、100ng/ml和150ng/ml)、緩沖液，適當時還含有穩定劑、或防腐劑等。校準品可制備成液體形式、干粉或凍干粉形式。根據本發明的另一方面，提供了一種結合有25羥維生素D抗原的微球的制備方法，包括步驟:活化25羥維生素D抗原；活化微球；將活化的25羥維生素D抗原與活化的微球連接，從而獲得結合有25羥維生素D抗原的微球。其中活化25羥維生素D抗原的步驟與活化微球的步驟的操作順序是可互換的。在一些實施方式中，活化25羥維生素D抗原的步驟所用的試劑選自羰基二咪唑、無水丙酮、二氨基二丙基亞胺、乙基二甲基胺丙基碳化二亞胺和2-嗎啉乙磺酸中的一種或多種。在一些實施方式中，所述微球為羧基修飾的微球。采用本發明的試劑盒，第一試劑包含足夠多的維生素D結合蛋白抗體，其能夠將維生素D與維生素結合蛋白分開；還包含足夠多的25羥維生素D抗體，受試者樣本(如全血、血漿、血清)中的25羥維生素D可以和該抗體發生特異性結合；第二試劑含有結合有25羥維生素D抗原的微球，微球上的25羥維生素D抗原和未結合樣本中25羥維生素D的剩余抗體可以發生特異性反應；利用膠乳增強免疫比濁的方法原理，檢測微球與剩余抗體反應產生的吸光度，可以推算出樣本中25羥維生素D的含量。
圖1:25羥維生素D試劑盒標準曲線。圖2:本發明方法和對照方法所制備的試劑之間標準曲線的比較。 本發明方法；■對照方法。圖3:本發明的試劑盒與酶聯免疫分析法的血清測值的相關性。
具體實施例方式為了使本發明易于理解，下面結合具體實施例進一步闡述本發明。除非另有指明，“％”表示質量/體積。以下提供了本發明實施方式中所使用的具體材料及其來源。但是，應當理解的是，這些僅僅是示例性的，并不意圖限制本發明，與如下試劑和儀器的類型、型號、品質、性質或功能相同或相 似的材料均可以用于實施本發明。以下實施例以血清為例進行了測試，但是本領域技術人員能夠理解，血漿和全血同樣可用作根據本發明的方法和試劑盒的受試樣本，因為其檢測對象均為樣本中的25羥維生素D，血清、血漿和全血的采集、保存、預處理等操作可以按照臨床檢驗領域中的常規方法進行。實施例實施例1:25羥維生素D檢測試劑盒的制備1.第一試劑制備過程如下:第一試劑組成:
pH7.3
MES50 mM
NaCl0.1 SM
NaN30.1%
BSA0.1%
維生素D結合蛋白單克隆抗體(鼠源)0.2%
抗25羥維生素D抗體多克隆抗體(兔源)0.2%用含有0.15M NaCU0.l%NaN3、0.1%BSA的50mM MES溶液，在室溫下稀釋維生素D結合蛋白抗體和25羥維生素D抗體，至抗體終濃度為0.2%。2.第二試劑制備過程如下:a)用無水丙酮在室溫下稀釋4ml人25輕維生素D抗原(10mg/ml),至抗原終濃度為 2mg/ml ；b)稱取20mg羰基二咪唑加入到上述溶液中，混勻，在30°C 150rpm搖床中反應0.5-2小時，例如I小時；c)用20mM MES溶液(pH5.0)在室溫下稀釋lml223nm聚苯乙烯膠乳顆粒，至膠乳濃度為4% ；d)稱取IOmg 二氨基二丙基亞胺溶于7.5ml無水丙酮中，加入1.5mg乙基二甲基胺丙基碳化二亞胺攪拌10至60min,例如30min ；e)將c)獲得的聚苯乙烯膠乳顆粒滴加進d)，混勻，30°C 150rpm搖床中反應1_3小時，例如2小時；f )將e)獲得的活化的聚苯乙烯膠乳顆粒滴加進b)中，混勻，30°C 150rpm搖床中反應1-4小時，例如3小時；g)將f)獲得的液體離心， 并用去離子水清洗2-3遍，去上清，獲得膠乳顆粒沉淀；h)用20mM MES溶液(pH5.0)稀釋g)獲得的膠乳顆粒至1.25%，根據需要可以加入0.1%防腐劑；i)超聲分散后，獲得第二試劑。3.校準品的制備過程:校準品組成:
M ES50mM NaCi0.15M
NaN30.1%
BSA0.5%
無水乙醇10%
蔗糖5%
25 輕維生素 D 純品 20ng/mi; 45ng/ml； 65 ng/ml ； I OOng/mi； 150ng/ml其余為去離子水按參考校準品所需要濃度，將25羥維生素D純品加入含有0.15MNaCl、0.l%NaN3、
0.5%BSA、10% 無水乙醇、5% 鹿糖的 50mM MES 溶液中，制得 20ng/ml、45ng/ml、65ng/ml、100ng/ml、150ng/ml濃度的25輕維生素D參考校準品。盡管上述方法中提供了具體的實驗條件，但是本領域技術人員應當理解，其可以在本發明的精神范圍內，針對實驗規模等因素進行適當的調整。例如，當制備規模不同時，可以改變上述試劑的用量，并選擇適當的反應設備以匹配規模的需求；再比如，攪拌速度不同時，攪拌時間可以適當地延長或縮短。實施例2:對照制備方法1.第一試劑的制備同實施例1。
2.第二試劑制備過程如下:a)用20mM MES溶液(ρΗ5.0)在室溫下稀釋4ml人25羥維生素D抗原(10mg/ml)，至抗原終濃度為2mg/ml ；b)用20mM MES溶液(pH5.0)在室溫下稀釋lml223nm聚苯乙烯膠乳顆粒，至膠乳濃度為4% ；c)稱取1.5mg 二氨基二丙基亞胺加入b)中攪拌10至60min,例如30min ；d)將c)獲得的聚苯乙烯膠乳顆粒滴加進a)，混勻，30°C 150rpm搖床中反應1_4小時，例如3小時；e)將d)獲得的液體離心，并用去離子水清洗2-3遍，去上清，獲得膠乳顆粒沉淀；f)用20mM MES溶液(pH5.0)稀釋e)獲得的膠乳顆粒至1.25%，根據需要可以加入0.1%防腐劑；g)超聲分散后，獲得第二試劑。3.校準品的制備過程同實施例1。實施例3:25羥維生素D校準曲線的繪制本發明試劑盒的測定步驟如下:
權利要求
1.一種25羥維生素D檢測試劑盒，其包含: 第一試劑，和 第二試劑； 其中， 第一試劑包含25羥維生素D抗體、維生素D結合蛋白抗體和緩沖液， 第二試劑包含結合有25羥維生素D抗原的微球和緩沖液。
2.根據權利要求1所述的25羥維生素D檢測試劑盒，其中 所述緩沖液選自磷酸緩沖液、甘氨酸緩沖液、MES緩沖液、硼酸緩沖液、醋酸鹽緩沖液、2-嗎啉乙磺酸緩沖液或氯化銨緩沖液中的一種或幾種； 所述緩沖液濃度為10-500mM。
3.根據權利要求1所述的25羥維生素D檢測試劑盒，其中 所述維生素D結合蛋白抗體為多克隆抗體或單克隆抗體； 所述25羥維生素D抗體為多克隆抗體或單克隆抗體； 其中多克隆抗體源自兔、羊或雞，單克隆抗體源自鼠或兔。
4.根據權利要求1所述的25羥維生素D檢測試劑盒，其中 所述25羥維生素D抗原為自然抗原或人工合成抗原。
5.根據權利要求1所述的25羥維生素D檢測試劑盒，其中 所述微球是由聚苯乙烯、丙烯酸、丙烯酸相關酯類中的一種或幾種聚合而成的膠乳顆粒；微球直徑在150-500nm之間。
6.根據權利要求1所述的25羥維生素D檢測試劑盒，其還包括校準品，所述校準品包含已知濃度的25羥維生素D。
7.一種結合有25羥維生素D抗原的微球的制備方法，所述方法包括步驟: 活化25羥維生素D抗原； 活化微球； 將活化的25羥維生素D抗原與活化的微球連接，從而獲得結合有25羥維生素D抗原的微球。
8.根據權利要求7所述的制備方法，其中所述活化25羥維生素D抗原的步驟所用的試劑選自羰基二咪唑、無水丙酮、二氨基二丙基亞胺、乙基二甲基胺丙基碳化二亞胺和2-嗎啉乙磺酸中的一種或多種。
9.根據權利要求7所述的制備方法，其中所述微球為羧基修飾的微球。
10.根據權利要求7所述的制備方法，其中所述活化25羥維生素D抗原的步驟與所述活化微球的步驟的操作順序是可互換的。
全文摘要
本發明涉及25羥維生素D檢測試劑盒及其制備方法。該試劑包括第一試劑、第二試劑，可選地還可以包括校準品。第一試劑包含25羥維生素D抗體、維生素D結合蛋白抗體和緩沖液；第二試劑含有結合有25羥維生素D抗原的微球和緩沖液。該試劑盒利用樣本中的25羥維生素D與結合在微球表面的抗原競爭結合25羥維生素D抗體，使得結合有25羥維生素D的微球與25羥維生素D抗體反應形成的濁度下降，通過該濁度的下降程度推算樣本中25羥維生素D的含量。
文檔編號G01N33/82GK103163306SQ20131004564
公開日2013年6月19日 申請日期2013年2月5日 優先權日2013年2月5日
發明者劉鶴, 張小銳, 蔡華雅, 劉希 申請人:北京九強生物技術股份有限公司
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