口蹄疫疫苗宿主細胞蛋白雙抗夾心酶聯免疫檢測試劑盒及使用方法
【專利摘要】本發明涉及一種用于檢測口蹄疫疫苗宿主細胞蛋白的雙抗夾心酶聯免疫試劑盒，所述雙抗夾心酶聯免疫試劑盒包括：標準品，兔抗BHK21細胞蛋白多克隆抗體包被的96孔酶標板，辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG，抗BHK21細胞蛋白抗體液，稀釋液，封閉液，洗液，終止液2M?H2SO4，顯色液，其中，所述的標準品為幼倉鼠腎細胞蛋白，包被抗體和檢測抗體均為兔抗BHK21細胞蛋白多克隆抗體。本發明檢測試劑盒中包被抗體量更加穩定均一、對微量抗原的乳化更加簡便充分、結合抗體與檢測抗體為同一抗體在制作試劑盒過程中更加便捷高效，避免不同抗體之間的交叉影響。
【專利說明】口蹄疫疫苗宿主細胞蛋白雙抗夾心酶聯免疫檢測試劑盒及使用方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種口蹄疫疫苗宿主細胞蛋白雙抗夾心酶聯免疫檢測試劑盒及使用方法，具體涉及一種用于檢測口蹄疫疫苗中宿主細胞(即幼倉鼠腎細胞)殘留蛋白的雙抗體夾心酶聯免疫試劑盒及其使用方法，屬于生物檢測領域。
【背景技術】
[0002]口蹄疫是豬、牛、羊等主要家畜和其它家養、野生偶蹄動物共患的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，易感動物達70多種。臨床特征是在口腔黏膜、蹄部和乳房皮膚發生水皰性疹。該病傳播途徑多、速度快，曾多次在世界范圍內暴發流行，造成巨大政治、經濟損失。鑒于此，世界動物衛生組織(OIE)將其列為A類傳染病之首。目前，有三分之二的OIE成員國流行口蹄疫，時刻威脅著無口蹄疫國家和地區的家畜安全和畜產品貿易。口蹄疫病毒屬于微核糖核酸病毒科口蹄疫病毒屬。其最大顆粒直徑為23納米，最小顆粒直徑為7-8納米，是目前所知病毒中最細微的一級。
[0003]牛尤其是犢牛對口蹄疫病毒最易感，駱駝、綿羊、山羊次之，豬也可感染發病。本病具有流行快、傳播廣、發病急、危害大等流行病學特點，疫區發病率可達50% -100%，犢牛死亡率較高，其他則較低。病畜和潛伏期動物是最危險的傳染源。病畜的水皰液、乳汁、尿液、口涎、淚液和糞便中均含有病毒。該病人侵途徑主要是消化道，也可經呼吸道傳染。本病傳播雖無明顯的季節性，且春秋兩季較多，尤其是春季。風和鳥類也是遠距離傳播的因素之一 O
[0004]口蹄疫是目前我國最具影響的動物傳染病之一。口蹄疫病毒型多易變，宿主廣泛，致病性強，而免疫原性又相對較弱。該病傳播方式及感染途徑多而復雜，康復動物可長期帶毒排毒，致使口蹄疫的防控十分困難。因此對口蹄疫疫苗質量要求越來越高，致使用以衡量疫苗質量，檢測其他無關蛋白方法及相關產品呼之欲出。隨著無血清細胞培養技術的產生和應用，宿主細胞殘留蛋白成為影響疫苗的主要因素，所以對宿主細胞殘留蛋白的檢測尤為重要。與這一需求相矛盾的情況是，口蹄疫疫苗宿主細胞蛋白檢測相關產品的缺失，這為疫苗的檢測監督造成了缺口和漏洞。在這種供求矛盾面前顯得這一發明尤為重要。
【發明內容】
[0005]本發明的目的之一提供一種口蹄疫疫苗宿主細胞蛋白雙抗夾心酶聯免疫檢測試劑盒及使用方法。
[0006]本發明的目的之二提供一種微量抗原乳化的方法
[0007]本發明的技術方案如下:
[0008]—種用于檢測口蹄疫疫苗宿主細胞蛋白的雙抗夾心酶聯免疫試劑盒,所述雙抗夾心酶聯免疫試劑盒包括:標準品，兔抗BHK21細胞蛋白多克隆抗體包被的96孔酶標板，辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG，稀釋液，抗BHK21細胞蛋白抗體液，封閉液，洗液，終止液2M H2SO4,顯色液，其中，所述的標準品為幼倉鼠腎細胞蛋白，包被抗體和檢測抗體均為兔抗BHK21細胞蛋白多克隆抗體。
[0009]1、兔抗BHK21細胞蛋白多克隆抗體的制備
[0010]首次免疫采用弗氏完全佐劑乳化抗原，家兔背部脊柱兩側四點注射，注射BHK21細胞蛋白總量IOOOug/只；首次免疫后14天后進行二次免疫，步驟及劑量與首次免疫相同，二次免疫采用弗氏不完全佐劑乳化抗原；二次免疫后21天進行三次免疫，步驟及劑量與二次免疫相同；之后每隔21天檢測抗體效價，免疫一次，效價超過1:32000可以心臟大量采血。
[0011]2、BHK21細胞(幼倉鼠腎細胞)蛋白的制備
[0012]BHK21細胞(幼倉鼠腎細胞)購自中檢所，應用DMEM培養基加馬血清培養傳代，待細胞長滿培養瓶底用PH7.2的10XPBS洗滌5次，將培養基洗滌干凈，胰酶消化細胞待細胞脫落，后再用10XPBS洗滌5次后裝入孔徑為8000-14000nm的透析袋，在100倍體積10XPBS緩沖液中4°C透析12小時，而后將細胞放入離心管中，_80°C反復凍容5次，鏡下觀察無完整細胞后進行7500r/min離心，去除細胞碎片，取上層溶液，此溶液為所需抗原蛋白溶液，考馬斯亮藍法檢測蛋白含量。
[0013]3、抗原蛋白溶液的乳化方法
[0014]將2中獲得的抗原蛋白溶液用10XPBS稀釋成所需濃度，再與蛋白液等體積的弗氏佐劑混合后乳化。做冰水點滴試驗，冰水中超過IOmin不擴散即達到乳化標準。本發明的乳化方法可以快速充分乳化少量抗原蛋白液，具體操作方法為硅膠管兩端分別加裝5號針頭，硅膠管處加蠕動泵作為乳化動力源，兩針頭放入同一裝有抗原液與佐劑混合的混合液的尚心管，一端插入蛋白液另一端在液面上，抽吸40min后乳化完成。
[0015]5、包被抗體血清的制備
[0016]應用3中獲得的乳化抗原進行免疫，首次免疫采用弗氏完全佐劑乳化抗原，家兔背部脊柱兩側四點注射，注射BHK21細胞蛋白總量IOOOug/只；首次免疫后14天后進行二次免疫，二次免疫采用弗氏不完全佐劑乳化抗原，步驟及劑量與首次免疫相同；二次免疫后21天進行三次免疫，步驟及劑量與二次免疫相同；之后每隔21天免疫一次并且采血檢測抗體效價，當效價超過1:32000可以大量采血，置于血凝管中離心制備血清。
[0017]6、間接ELISA法檢測抗體效價
[0018]用2中提取的蛋白以10ug/ml量包被后，用0.1%BSA封閉90分鐘，然后將4中制備的血清稀釋16倍后加入第一列，然后依次兩倍稀釋，結合110分鐘，加入稀釋到工作濃度的酶標二抗20分鐘，之后顯色終止，酶標儀設定波長為450nm，讀取數據，每個步驟完成后用洗滌液洗滌3到5次。
[0019]7、包被抗體的純化
[0020]( I)辛酸硫酸銨法粗提抗體
[0021]首先動物血清用4倍體積的乙酸乙酸鈉緩沖液稀釋，0.1mol/LNaOH調pH至4.5，室溫下攪拌并緩慢加入辛酸，10000r/min離心20min，取上清，量體積，按1/10體積加入10XPBS,并用5mol/L的NaOH調pH至7.4，在4°C按277g/L緩慢加入硫酸銨粉末，加完后繼續攪拌30min,離心棄上清，收集沉淀,沉淀用10XPBS溶解,透析過夜,透析后的抗體溶液在50-55°C水浴中加熱20min，5000r/min離心20min，取上清液放置_20°C保存。[0022](2)親和層析柱純化抗體
[0023]用結合緩沖液稀釋4中獲得的抗體，至pH接近7.0，然后將蛋白A填料裝入柱子，用5倍體積結合緩沖液平衡柱子。上樣，結合緩沖液洗柱子，收集洗脫緩沖液洗下的結合在柱料上的抗體，然后用結合緩沖液復生柱料。
[0024]8、酶標板的處理
[0025]用10%硫酸魚精蛋白溶液每孔100ul37°C 2小時處理酶標板，后用抗體效價對照稀釋包被，即將間接ELISA檢測效價為1:2048的抗體液稀釋32倍后加入酶標板每孔lOOul，37°C包被過夜，后封閉2小時，封存。
[0026]9、使用本發明雙抗夾心酶聯免疫試劑盒的方法，其特征在于，包括以下步驟:
[0027](I)加入待測樣品:取出酶標板加入稀釋后的待測樣品，IOOul每孔，37 C，2小時；
[0028](2)加入檢測抗體:取出檢測抗體稀釋32倍，每孔加入100ul，37°C，1.5小時；
[0029](3)加酶標二抗:將酶標二抗稀釋10000倍后每孔加入lOOul，37°C，20分鐘；
[0030](4)顯色:每孔加入顯色液100ul37°C 4分鐘；
[0031](5)終止:每孔加入40ul2M硫酸溶液；
[0032](6)酶標儀測量在波長為450nm的值，計算BHK21細胞蛋白含量；
[0033]其中，所述的計算方法為:
[0034]采用樣品讀取值與陰性值作差后引入公式y=Z (4925.2χ-702.52)中計算細胞蛋白含量，其中Y代表細胞蛋白含量，單位ug/ml，X值為陰陽性吸光值之差，Z為稀釋倍數。
[0035]Y=Z (4925.2X-702.52)的確立過程如下:
[0036]依照雙抗夾心ELISA體系對BHK21細胞蛋白液進行檢測，具體方法如下:
[0037](I)將提取的BHK21細胞破碎提取蛋白；
[0038](2)用考馬斯亮藍法定量蛋白液中蛋白含量；
[0039](3)稀釋蛋白液使蛋白含量分別為100ug/ml200ug/ml300ug/ml400ug/ml四個梯度，完成ELISA ;
[0040](4)進行多次實驗分別得到四個蛋白含量梯度陰陽性差值的平均值，依照得到的四個平均值確定標準曲線建立方程。
[0041]試驗陰陽性差平均值如下:
[0042]
【權利要求】
1.一種用于檢測口蹄疫疫苗宿主細胞蛋白的雙抗夾心酶聯免疫試劑盒，其特征在于，所述雙抗夾心酶聯免疫試劑盒包括:標準品，兔抗BHK21細胞蛋白多克隆抗體包被的96孔酶標板，辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG，抗BHK21細胞蛋白抗體液，稀釋液，封閉液，洗液，終止液2M H2SO4,顯色液,其中,所述的標準品為所述標準品為幼倉鼠腎細胞蛋白，包被抗體和檢測抗體均為兔抗BHK21細胞蛋白多克隆抗體。
2.根據權利要求1中所述的雙抗夾心酶聯免疫試劑盒，其特征在于，所述兔抗BHK21細胞蛋白多克隆抗體的制備方法為: 首次免疫采用弗氏完全佐劑乳化抗原，家兔背部脊柱兩側四點注射，注射BHK21蛋白總量IOOOug/只；首次免疫后14天后進行二次免疫,步驟及劑量與首次免疫相同,二次免疫采用弗氏不完全佐劑乳化抗原；二次免疫后21天進行三次免疫，步驟及劑量與二次免疫相同；之后每隔21天檢測抗體效價，免疫一次，效價超過1:32000可以心臟大量采血。
3.根據權利要求1中所述的雙抗夾心酶聯免疫試劑盒，其特征在于，所述幼倉鼠腎細胞蛋白的制備方法如下: 將BHK21細胞用DMEM培養基加馬血清培養傳代，待細胞長滿培養瓶底用pH為7.2的10 X PBS洗滌5次，將培養基洗滌干凈，胰酶消化細胞待細胞脫落，后再用10 X PBS洗滌5次后裝入孔徑為8000-14000nm的透析袋，在100倍體積10XPBS緩沖液中4°C透析12小時，而后將細胞放入離心管中，-80°C反復凍容5次，鏡下觀察無完整細胞后進行7500r/min離心，去除細胞碎片，取上層溶液，此溶液為所需抗原蛋白溶液，考馬斯亮藍法檢測蛋白含量。
4.根據權利要求1中所述的雙抗夾心酶聯免疫試劑盒，其特征在于，可以快速充分乳化少量抗原蛋白液，方法為硅膠管兩端分別加裝5號針頭，硅膠管處加蠕動泵作為乳化動力源，兩針頭放入同一裝有抗原液與佐劑混合的混合液的離心管，一端插入蛋白液另一端在液面上，抽吸40min后乳化完成。
5.酶標板處理方法用10%硫酸魚精蛋白溶液每孔100ul37°C2小時處理酶標板，后用抗據權利要求1中所述的雙抗夾心酶聯免疫試劑盒，其特征在于，所述抗體效價對照稀釋包被，即將間接ELISA檢測效價為1:2048的抗體液稀釋32倍后加入酶標板每孔lOOul，37°C包被過夜，后封閉2小時，封存。
6.使用如權利要求1-5任一項所述的雙抗夾心酶聯免疫試劑盒的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)加入待測樣品:取出酶標板加入稀釋后的待測樣品，IOOul每孔，37°C，2小時； (2)加入檢測抗體:取出檢測抗體稀釋32倍，每孔加入100ul，37°C，1.5小時； (3)加酶標二抗:將酶標二抗稀釋10000倍后每孔加入lOOul，37°C，20分鐘； (4)顯色:每孔加入顯色液IOOul，37°C，4分鐘； (5)終止:每孔加入40ul，2M硫酸溶液； (6)酶標儀測量在波長為450nm的值，計算BHK21細胞蛋白含量； 其中，所述的計算方法為: 采用樣品讀取值與陰性值作差后引入公式y=Z (4925.2x-702.52)中計算細胞蛋白含量，其中Y代表細胞蛋白含量，單位ug/ml，X值為陰陽性吸光值之差，Z為稀釋倍數。
【文檔編號】G01N33/543GK103792366SQ201410026997
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年1月21日 優先權日:2014年1月21日
【發明者】趙炳武, 趙宏凱, 任美榮, 劉金萍, 王永偉, 呂宏亮, 張澍 申請人:內蒙古必威安泰生物科技有限公司
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