一種穩定的液體脂類校準品的制作方法
【專利摘要】本發明公開的穩定的液體脂類校準品包括：緩沖液20-200mmol/L；蛋白質類穩定劑2-10%（w/v）；電解質NaCl10-200mmol/L；抗氧化增效劑5-100mmol/L；糖類穩定劑10-100g/L；防腐劑0.09%（w/v）；抗氧化劑0.02-100mmol/L；蛋白酶抑制劑0.1-5mmol/L；載脂蛋白A-Ⅰ2.0-3.0g/L；載脂蛋白B2-2.5g/L。本發明有效地提高了載脂蛋白A-Ⅰ與載脂蛋白B的穩定性，可在2-8℃穩定冷藏一年，使用保存更為方便高效，并且能夠提高測定樣本中載脂蛋白A-Ⅰ與載脂蛋白B含量測定的準確性。
【專利說明】一種穩定的液體脂類校準品
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種穩定的用于載脂蛋白A-1與載脂蛋白B含量測定的校準品，特別是一種穩定的液體脂類校準品。
【背景技術】
[0002]傳統的臨床檢驗，要使檢驗結果可靠或有依據，往往有一個標準品(Standard)。以臨床化學檢驗的比色測定為例，常作三個檢測:空白、標準、測定。用空白液調整吸光度為零，讀出測定比色液和標準比色液的吸光度，分別為As和Au ；已知標準液濃度為Cs。在一定范圍內，某分析物濃度和吸光度呈良好比例關系。為了克服純標準液和病人樣品間的基體差異，20年前開始引用具有與病人樣品基體相似的校準品替代標準品，用于日常工作。由于以往在使用標準品時不強調它的專用性，國內在應用校準品時忽略了它的專用性。任何方法或儀器、試劑使用一個校準品，嚴重影響檢驗質量。
[0003]為了克服基體效應，推薦使用校準品。校準品的大多來源為人的樣品混合物，如混合血清。本身內含被檢分析物，制備時可添加某些分析物增加含量。校準品中被檢分析物的含量無法由稱量法和容量法確定，只能倚賴于分析方法。校準品的校準值必須取決于分析方法或檢測系列。
[0004]新鮮病人標本是最佳校準品，由于所有校準品都是處理過的樣品，和新鮮病人標本有著基體差異。若使用公認的參考方法去標化測定校準品，測定程序是嚴密的，測定值是可靠的。但使用該測定值去校準常規的檢測系列時，校準品中被檢分析物參與反應時的表現明顯不同于新鮮病人標本，不能將參考方法系列的準確度通過校準品傳遞給病人標本。
[0005]現有技術中載脂蛋白A-1與載脂蛋白B標準品易受干擾，不易保存并且保存時間不長，給臨床檢驗帶來了很大的困難。
[0006]現階段，動脈粥樣硬化性心血管疾病(atherosclerosis card1vasculardisease, ACVD)包括冠心病、腦卒中和周圍動脈疾病。2003年國際動脈粥樣硬化學會發表的“預防ACVD臨床指南”中確定載脂蛋白異常作為新的ACVD危險因素。而載脂蛋白A-1和B異常除了可見于腎肝疾病、糖尿病和內分泌代謝疾病外，主要作為ACVD危險因素，用于ACVD危險程度劃分、預防和治療。由此可見，載脂蛋白A- 1、B測定結果的準確性取決了整個檢測分析系統的穩定可靠，其中校準品的量值溯源和其穩定性在很大程度上影響著測定結果。校準品內載脂蛋白濃度的改變直接導致樣本內載脂蛋白的檢測值發生錯誤，失去真實的參考性。
[0007]目前，國內生化類體外診斷試劑生產企業研發的用于脂類中載脂蛋白A-1和載脂蛋白B校準的校準品，主要是凍干品，這些校準品在復溶后不易保存，而且由于在凍干過程中載脂蛋白的分子結構會遭到破壞，導致載脂蛋白免疫反應性改變。復融后，在高溫及反復凍融條件下同樣可引起部分分析物質破壞。如果不注意使用會導致校準結果偏高，實際測得病人標本結果也會影響臨床判斷。國外知名診斷試劑公司像羅氏診斷以及朗道公司研發的血脂校準品，穩定時間長，準確度好，產品可溯源性強，但價格較貴。臨床中綜合考慮到成本、操作等因素，中小醫院使用起來不是很方便。
【發明內容】
[0008]為解決上述問題，本發明公開了一種穩定的液體脂類校準品，通過在含有載脂蛋白A-1與載脂蛋白B的血清基質液中添加適量硫代二丙酸、沒食子酸丙酯、EDTA和抑肽酶等成份，均能提高載脂蛋白A-1與載脂蛋白B的穩定性，由此制成液體脂類校準品，可在2-8°C穩定冷藏一年，并且對載脂蛋白A-1與載脂蛋白B具有良好的檢測性能，檢測精度高，響應效果好。
[0009]本發明公開的穩定的液體脂類校準品包括:
[0010]
緩沖液20-200ramol/L
蛋Cl質類穩定劑2-10% ( W/ V )
電解質 NaC I10-200mmo I /1.抗1?化增效劑5-1 OOmmo I/L
[0011]
糖類穩定劑10-1 OOg/丨.防腐劑0.09% (W/Y)
抗氧化劑O, 02-1 OOmmo I / L
蛋P酶抑制_0.l-5mmol/L
載脂蛋 H Λ-12.0-3.0g/L
載脂蛋 Q B2-2.SgZLc
[0012]作為一種優選，所述緩沖液為Tris緩沖液、MOPS緩沖液、PB緩沖液中的一種，并且緩沖液的酸堿度為PH = 7-8。
[0013]作為一種優選，所述穩定劑包括蛋白質類穩定劑或者糖類穩定劑中一種或幾種混合物，所述蛋白質類穩定劑為BSA、HGG、HAS中一種或幾種，所述糖類穩定劑為蔗糖、葡萄糖、海藻糖中一種或幾種。
[0014]作為一種優選，所述蛋白酶抑制劑為EDTA、抑肽酶、PMSF中的一種或幾種。
[0015]作為一種優選，所述抗氧化劑為硫代二丙酸、沒食子酸丙酯、丁基羥基茴香醚、二丁基羥基甲苯、叔丁基對苯二酚中的一種或幾種。
[0016]作為一種優選，所述抗氧化增效劑為檸檬酸、乳酸鈉、EDTA中的一種。
[0017]作為一種優選，所述防腐劑為疊氮鹽類或proclin系列防腐劑，其中疊氮鹽類防腐劑主要為NaN3, proclin系列防腐劑主要為Proclin300。
[0018]作為一種優選，本發明公開的穩定的液體脂類校準品主要包括以下組分:
[0019]
IiIiP1-S (緩沖液，pH7-?)20-200mmo丨/1.人沾丨---- (穩定劑)卜;5% (w/v)
人 Y 球---- C 穩記劑)1-5% (w/ V)
XaCl (電解質)10-200m1 丨/L
乳酸鈉(抗氣化增效劑)5-1 OOmmo I/1.海藻糖(穩定劑)ICM00g/L
呑鉍鈉(防腐劑)0.0!? (w/v)
硫代—:W酸(.抗％〔化劑)5-1OOmmo 1,.1,
沒食 /-酸WSi (抗鋱化劑)O, 02-1.0mmol/1.EDTA ( M 丨:J ft抑制劑)0.1 -5mmo:l / L
抑呔_ (蛋1+'丨_抑制劑)1-25mg/l.栽脂蛋Π Λ-12.0-3.0g/1.載脂-- 1-H B2~2.0g/1.c
[0020]機理
[0021]1、該校準品為液體形式，其優勢在于不用凍干，不易破壞載脂蛋白的結構，比干粉更穩定。
[0022]2、加入的穩定劑主要從兩方面提高復合校準品的穩定性:
[0023]載脂蛋白在液體狀態下極易發生自發氧化，使校準品值在短時間內下降，所以必須使用有效的抗氧化劑阻止或減緩載脂蛋白的氧化速度。然而普通抗氧化劑抗氧化效果經過長時間后均會下降。有研究表明硫代二丙酸與酚類抗氧化劑聯合使用可以產生一種協同效應，從而增強抗氧化效果。
[0024]另一方面自然界中存在許多種蛋白水解酶，載脂蛋白在蛋白酶作用下發生降解，校準品中有效成分不斷減少。在校準液中加入蛋白酶抑制劑抑制蛋白酶活性，保存載脂蛋白結構的完整性。EDTA是一種金屬蛋白酶抑制劑，通過螯合金屬離子奪取金屬蛋白酶活性必需的金屬離子，使其失活；抑肽酶也稱胰蛋白酶抑制劑，是一種天然廣譜蛋白酶抑制劑，能與多種蛋白酶的活動中心競爭一個賴氨酰基而抑制其活性。
[0025]通過在含有載脂蛋白A-1與載脂蛋白B的血清基質液中添加適量硫代二丙酸、沒食子酸丙酯、EDTA和抑肽酶等成份，均能提高載脂蛋白A-1與載脂蛋白B的穩定性，由此制成液體脂類校準品，可在2-8°C穩定冷藏一年。
【具體實施方式】
[0026]下面結合【具體實施方式】，進一步闡明本發明，應理解下述【具體實施方式】僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。
[0027]本發明公開的穩定的液體脂類校準品包括:
[0028]緩沖液20-200mmol/l.飯「1質炎穩記劑2-10% (w/v)
電解質 \a(:l10-200mmo!;1.化増效劑10mmo I / L
糖類穩定劑HMOOg-L
防腐劑0.09% (w/v)
抗鉍化劑0.02-1OOtiB1 1/L
SiClfti抑制劑0.1-SfnmoI/L
載脂蛋 I+1 Λ-12.0-3.0g/1,
載脂蛋丨?Β2-2.Sgv1.,
[0029]作為一種優選，所述緩沖液為Tris緩沖液、MOPS緩沖液、PB緩沖液中的一種，并且緩沖液的酸堿度為PH = 7-8。
[0030]作為一種優選，所述穩定劑包括蛋白質類穩定劑或者糖類穩定劑中一種或幾種混合物，所述蛋白質類穩定劑為BSA、HGG、HAS中一種或幾種，所述糖類穩定劑為蔗糖、葡萄糖、海藻糖中一種或幾種。
[0031]作為一種優選，所述蛋白酶抑制劑為EDTA、抑肽酶、PMSF中的一種或幾種。
[0032]作為一種優選，所述抗氧化劑為硫代二丙酸、沒食子酸丙酯、丁基羥基茴香醚、二丁基羥基甲苯、叔丁基對苯二酚中的一種或幾種。
[0033]作為一種優選，所述抗氧化增效劑為檸檬酸、乳酸鈉、EDTA中的一種。
[0034]作為一種優選，所述防腐劑為疊氮鹽類或proclin系列防腐劑，其中疊氮鹽類防腐劑主要為NaN3, proclin系列防腐劑主要為Proclin300。
[0035]作為一種優選，本發明公開的穩定的液體脂類校準品主要包括以下組分:
[0036]
HHPHS (緩沖液，pH7-8)20-2()0mmol/+l.人血沾(:穩定劑)1-5% (w/v)
人Y球蛋丨1I (穩定劑)1-5?) (w/v )
SaC I (電解質)I O-200mn1 I / L
乳酸鈉(抗氧化增效劑)5-1 OOmmo I /1.海藻糖(穩定劑)10-1OOgZL
疊||1鈉(防腐劑)0.09% (w/v)
硫代-.....:內酸(抗氣化劑)5-1 OOmmo I / L
沒食了酸丙Si (抗氧化劑)0,02-1.0mmol/!.EDTA C 蛋 P Si 抑制劑)0.1 /I
抑肽隱(蛋Ι.Η _抑制劑)1-25mg/1.載脂蛋 ? A-12.0-3.0g/L
載脂蛋 H B2-2,5g/U
[0037]實施例1
[0038](I)不同穩定劑對校準品穩定性的影響
[0039]按以下配方配制含有待測目標物載脂蛋白A-1與載脂蛋白B的血清基質液，在此基質內添加不同濃度的穩定劑，在37°C水浴中放置16小時，分別在水浴前后，應用瑞源公司在售載脂蛋白A-1與載脂蛋白B檢測試劑盒(免疫比濁法)及其校準品，按各自說明書檢測血清基質液中的ApoA-1和ApoB含量，根據水浴前后測定含量的變化考察穩定性，分析添加的不同穩定劑的效果。表I中4種添加劑均能提高血清基質中ApoA-1和ApoB的穩定性，且與各穩定劑濃度呈正相關。
[0040]含有ApoA-1與ApoB的血清基質液:ρΗ7.4
[0041]
綏沖液〗(Μ)ι_?Ι/?,
人血沾 ? I ill -- (I luin1-m S<%rum Λ i biimi η, I ISA)2.5% (w/v )
人 Y 球?Κ-- (I in man gamin<i globulin, IKSG)2, 5% (w/v )
鼠”50i 腿
乳酸蚋lOinmol / I,
海藻糖20g/l,
Proclin 3000.05% (w/v)
[0042]
載脂蛋 0 A-12.5g/L
載脂蛋N B2.0g/1.
[0043]表I不同添加劑對ApoA-1和ApoB在37°C穩定性的影響
[0044]
ApoA-1含量ApoB含量添加物 ft度水浴前I水浴后—^Ll她率水前水浴后 N收率_____(g/L) [ (g/L) (%) (g/L) (g/L) (?): ______________2'j53______________________________2_.__02_______________ ——79_._8________________ ^^97...............................1"；51 _______________76,_5_______________
硫代.'.W酸 5 2.48 2.02 ' 61.3.98 1.；T1 ^ 76.4
(inmo 1/L) 25~ 2:.:15.................2......15...............'.............87.7...............................................1:98...............................?.'70^...............85:8
(inmol/U 0.廠 2.16 2.27 — 92.1 1.91 1.86^ 96.1
EDTA(,ol/L)2.46 L984^
0.5 2.47 2.08 84.1 1.95 1.66 84.9
TZTIZ^:,、 I — 2.49 I 2.01 ^80.8 1.98^ 1.72 畫 86.7jlHA_lmg/U 丨 5 2.,t6 I 2, U) 85,4 L 95 1.74 89.3
(2)本發明脂類校準品配制與標定
[0045]該脂類校準品為含有高值載脂蛋白A-1與載脂蛋白B的復合校準品，配方如下:
[0046]
\10PS 緩沖液(ρΗ7.0)lOOmml/L
人血沾廣丨叛㈧(Hunan Seruii Alburain, USA) 2, 5% (w/v)
人 Y 球--? (llnmm gaiaiia globulin, HGG)2.δ% (w/v)
XaC I5()mmol/l,
乳酸鈉I Ommo I/L
海藻糖20g/丨.flM 鈉0.09% (w/v)
硫代.25mmo 1:1.沒食子酸內0.lmn1l/1,
ΗΙ)ΤΛ0,5mmol/L
挪肽_5mg/L
載斷蛋 Ι?Λ?!2, Dg/L
載詣蛋Ι? B2.3g/L
[0047]用Roche校準品配合公司在售載脂蛋白A-1和載脂蛋白B檢測試劑(免疫比濁法)測定復合校準品中的載脂蛋白A-1和載脂蛋白B含量，每個測定10次，以平均值作為該校準品的標示值。最終標定此脂類校準品中載脂蛋白A-1的標示值為2.54g/L，載脂蛋白B的表示值為2.33g/L
[0048]表2脂類復合校準品中載脂蛋白A-1和載脂蛋白B含量標定
[0049]
測定次數 ApoA-1 (g/L) ApoB (g/L)
?2.572.28
22.552.30
32.532.35
42?522?36
52.552?32
62.572.35
72?562?32
82?522.35
92?512.35
102.552.35
平均值~ 2.542.33
STDEV 0.02160.0267
【權利要求】
1.一種穩定的液體脂類校準品，其特征在于，所述穩定的液體脂類校準品包括: 緩沖液20-200mmol/L 蛋白質類穩定劑2-10% (w/v)
電解質 NaCl10-200mmol/L 抗氧化增效劑5-100mmol/L 糖類穩定劑10-100g/L 防腐劑0.09% (w/v) 抗氧化劑0.02-100mmol/L 蛋白酶抑制劑0.l-5mmol/L
載脂蛋白 A-12.0-3.0g/L 載脂蛋白B2-2.5g/L。
2.根據權利要求1所述的穩定的液體脂類校準品，其特征在于，所述緩沖液為HEPES緩沖液、Tris緩沖液、GOOD’ S緩沖液、PB緩沖液中的一種，并且緩沖液的酸堿度為PH=7_8。
3.根據權利要求1所述的穩定的液體脂類校準品，其特征在于，所述穩定劑包括蛋白質類穩定劑或者糖類穩定劑中一種或幾種混合物，所述蛋白質類穩定劑為BSA、HAS、人Y球蛋白中一種或幾種，所述糖類穩定劑為蔗糖、葡萄糖、海藻糖中一種或幾種。
4.根據權利要求1所述的穩定的液體脂類校準品，其特征在于，所述蛋白酶抑制劑為EDTA、抑肽酶、PMSF中的一種。
5.根據權利要求1所述的穩定的液體脂類校準品，其特征在于，所述抗氧化劑為硫代二丙酸、沒食子酸丙酯、丁基羥基茴香醚、二丁基羥基甲苯、叔丁基對苯二酚中的一種或幾種。
6.根據權利要求1所述的穩定的液體脂類校準品，其特征在于，所述抗氧化增效劑為檸檬酸、乳酸鈉、EDTA中的一種。
7.根據權利要求1所述的穩定的液體脂類校準品，其特征在于，所述防腐劑為疊氮鹽類或proclin系列防腐劑,其中疊氮鹽類防腐劑主要為NaN3, proclin系列防腐劑主要為Proclin300o
8.根據權利要求1至7所述的穩定的液體脂類校準品，其特征在于，主要包括以下組分:
HEPES (緩沖液，pH7-8)20-200mmol/L 人血清白蛋白(穩定劑)1-5% (w/v) 人Y球蛋白(穩定劑)1-5% (w/v) NaCl (電解質)10-200mmol/L
乳酸鈉(抗氧化增效劑)5-100mmol/L 海藻糖(穩定劑)10-100g/L 疊氮鈉(防腐劑)0.09% (w/v)
硫代二丙酸(抗氧化劑)5-100mmol/L
沒食子酸丙酯(抗氧化劑)0.02-1.0mmoI/L
EDTA (蛋白酶抑制劑)0.l-5mmol/L 抑肽酶(蛋白酶抑制劑)l-25mg/L載脂蛋白 A-12.0-3.0g/L載脂蛋白B2-2.5g/L。
【文檔編號】G01N33/68GK104198733SQ201410431757
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年8月28日 優先權日:2014年8月13日
【發明者】陳媛, 張聞, 周海濱, 王建飛 申請人:寧波瑞源生物科技有限公司
專業數控銑床產品供應商
20年生產經驗，實力工廠，精工品質，質量有保障
