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一種高效分離和測(cè)定草坪草內(nèi)源細(xì)胞分裂素的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種高效分離和測(cè)定草坪草內(nèi)源細(xì)胞分裂素的方法，涉及植物內(nèi)源細(xì)胞分裂素的測(cè)定領(lǐng)域。本發(fā)明包括以下步驟：①內(nèi)源細(xì)胞分裂素的提?。和ㄟ^(guò)加提取液浸提，然后離心，過(guò)濾，脫色，最后進(jìn)行真空濃縮，完成內(nèi)源細(xì)胞分裂素的提??；②固相萃取洗脫：溶解內(nèi)源細(xì)胞分裂素并獲得溶解液，將洗脫液真空濃縮，得固相萃取洗脫物；③高效液相色譜-質(zhì)譜分析。本發(fā)明前處理簡(jiǎn)單，化學(xué)試劑用量少，有效節(jié)約成本，雜質(zhì)干擾小；檢測(cè)靈敏度高、選擇性好，不需要衍生；實(shí)現(xiàn)了在植物樣品的粗提取液中直接進(jìn)行多種內(nèi)源細(xì)胞分裂素的檢測(cè)；其分離提取方法、色譜分離條件和質(zhì)譜檢測(cè)方法適用于草坪草內(nèi)源細(xì)胞分裂素，回收率高，達(dá)93～96%。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種高效分離和測(cè)定草坪草內(nèi)源細(xì)胞分裂素的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及植物內(nèi)源細(xì)胞分裂素的測(cè)定領(lǐng)域，具體涉及一種高效分離和測(cè)定草坪草內(nèi)源細(xì)胞分裂素的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]草坪業(yè)基于其獨(dú)特的生態(tài)、社會(huì)、景觀、美學(xué)和經(jīng)濟(jì)等功能，越來(lái)越受到重視并顯示出巨大的發(fā)展勢(shì)頭和潛力。草坪作為城市生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，不僅具有很強(qiáng)的觀賞性和娛樂(lè)性，同時(shí)也在防治污染和改善生態(tài)環(huán)境中發(fā)揮了巨大的作用，鑒于此，社會(huì)對(duì)草坪草的需求不斷增大，草坪業(yè)的發(fā)展也迎來(lái)了良好的機(jī)遇。在霧霾頻發(fā)的今天，如何改善我們的居住生活環(huán)境任重而道遠(yuǎn)，草坪草在環(huán)境改善方面的作用也顯得舉足輕重。
[0003]植物內(nèi)源細(xì)胞分裂素作為一種以促進(jìn)細(xì)胞分裂為主的植物激素，普遍存在于高等植物中，可顯著調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育，對(duì)細(xì)胞分裂和分化具有重要作用。雖然內(nèi)源細(xì)胞分裂素在植物體內(nèi)的含量低，但對(duì)植物的新陳代謝、生長(zhǎng)發(fā)育等生理過(guò)程起到重要的調(diào)節(jié)作用，包括促進(jìn)細(xì)胞分裂、促進(jìn)芽的分化、促進(jìn)細(xì)胞擴(kuò)大、促進(jìn)側(cè)芽發(fā)育、消除頂端優(yōu)勢(shì)、延緩葉片衰老、打破種子休眠和種子發(fā)芽等。近年來(lái)，關(guān)于內(nèi)源細(xì)胞分裂素在提高植物抗逆性中的作用也受到了重視。如何精確、實(shí)時(shí)和可靠地對(duì)不同物種中微量的內(nèi)源細(xì)胞分裂素進(jìn)行定性定量分析，是目前植物激素研究中的熱點(diǎn)之一。
[0004]細(xì)胞分裂素在大多數(shù)組織中的含量都很低，通常在10-6?10_9g之間，因此，對(duì)分析靈敏度的要求較高。七十年代初Pool首先利用高效液相色譜(HPLC)分離鑒定細(xì)胞分裂素，高效液相色譜技術(shù)滿足了植物細(xì)胞分裂素測(cè)定的靈敏度要求，且具有高選擇性、分析快速、兼具分析和制備的優(yōu)點(diǎn)在植物內(nèi)源細(xì)胞分裂素的分離和測(cè)定中得到廣泛的應(yīng)用。但在樣品的提取、純化等前處理過(guò)程仍有很多問(wèn)題難以解決，樣品的前處理是一個(gè)耗時(shí)耗力的過(guò)程，特別是雜質(zhì)的干擾，一直是HPLC法測(cè)定細(xì)胞分裂素的瓶頸。因此改進(jìn)細(xì)胞分裂素測(cè)定過(guò)程中的前處理及純化方法，對(duì)準(zhǔn)確測(cè)定細(xì)胞分裂素尤為關(guān)鍵。
[0005]近年來(lái)，質(zhì)譜技術(shù)的快速發(fā)展，推動(dòng)了植物內(nèi)源細(xì)胞分裂素的精確分析測(cè)定。質(zhì)譜法具有高選擇性、高靈敏度、能提供相對(duì)分子量和結(jié)構(gòu)信息的優(yōu)點(diǎn)，國(guó)外已有學(xué)者將液相色譜與質(zhì)譜相結(jié)合應(yīng)用于植物激素的檢測(cè)，雖然此項(xiàng)技術(shù)剛剛起步，但可預(yù)見(jiàn)其在植物激素的檢測(cè)中將發(fā)揮重要的作用。
[0006]液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS)技術(shù)具有如下優(yōu)點(diǎn):
[0007]①檢測(cè)限低、靈敏度高、選擇性好，不需要衍生，化學(xué)試劑用量少；
[0008]②實(shí)現(xiàn)了在植物樣品的粗提取液中直接進(jìn)行生理水平植物激素的檢測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的主要是針對(duì)植物內(nèi)源細(xì)胞分裂素檢測(cè)的操作復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)、純化難度大、檢測(cè)種類(lèi)少和回收率低等問(wèn)題，提供一種高效分離和測(cè)定草坪草內(nèi)源細(xì)胞分裂素的方法。本發(fā)明的特色是前處理簡(jiǎn)單，不需要衍生，節(jié)約成本，尤其適用于草坪草內(nèi)源細(xì)胞分裂素的測(cè)定，可快速、準(zhǔn)確測(cè)定草坪草的多種內(nèi)源細(xì)胞分裂素。
[0010]本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的:
[0011]一種高效分離和測(cè)定草坪草內(nèi)源細(xì)胞分裂素的方法，主要包括以下步驟:
[0012]①內(nèi)源細(xì)胞分裂素的提取:
[0013]通過(guò)加提取液浸提，然后離心，過(guò)濾，脫色，最后進(jìn)行真空濃縮，完成內(nèi)源細(xì)胞分裂素的提??；
[0014]②固相萃取洗脫:
[0015]溶解內(nèi)源細(xì)胞分裂素并獲得溶解液，過(guò)96孔的固相萃取小柱(Oasis MCX column)逐步洗脫，獲得內(nèi)源細(xì)胞分裂素洗脫液，將洗脫液真空濃縮，得固相萃取洗脫物；
[0016]③高效液相色譜-質(zhì)譜分析:
[0017]將固相萃取洗脫物用流動(dòng)相溶解，將流動(dòng)相溶解液過(guò)濾后上高效液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS)進(jìn)樣分析。
[0018]本發(fā)明具有下列優(yōu)點(diǎn)和積極效果:
[0019]①前處理簡(jiǎn)單，化學(xué)試劑用量少，有效節(jié)約成本，雜質(zhì)干擾小；
[0020]②檢測(cè)靈敏度高、選擇性好，不需要衍生；
[0021]③實(shí)現(xiàn)了在植物樣品的粗提取液中直接進(jìn)行多種內(nèi)源細(xì)胞分裂素的檢測(cè)；
`[0022]④其分離提取方法、色譜分離條件和質(zhì)譜檢測(cè)方法適用于草坪草內(nèi)源細(xì)胞分裂素，回收率高，達(dá)93~96%。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0023]圖1是細(xì)胞分裂素(iP、Z、DHZ、iPA、ZR、DHZR)混合標(biāo)樣質(zhì)譜圖；
[0024]圖2是狗牙根葉片細(xì)胞分裂素(丨？、2、0!12、丨?4、21?、0!1210質(zhì)譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0025]下面結(jié)合實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明:
[0026]1、試驗(yàn)材料:經(jīng)鹽脅迫(處理濃度為200mmol/L NaCl)處理35d (天)的狗牙根材料(選用中國(guó)科學(xué)院武漢植物園種質(zhì)資源圃編號(hào)為C43的狗牙根)。
[0027]2、檢測(cè)步驟
[0028]I)內(nèi)源細(xì)胞裂素的提取
[0029]A、浸提:取0.5g鮮樣，用液氮研磨，然后加提取液5ml，_20°C提取過(guò)夜，得浸提液；
[0030]所述的提取液即甲醇:甲酸:水=15:1:4，按v/v，再加40mg/ml2，6_ 二叔丁基-4-甲基苯酚作為抗氧化劑；
[0031]B、離心:將浸提液在15000轉(zhuǎn)/min，4°C下離心10min，收集上清液置于新管并保存于-20°C，殘?jiān)儆?ml提取液于_20°C提取lh，離心，收集上清液并混合于前一次的上清液，得離心液；
[0032]C、過(guò)濾:將收集的離心液過(guò)20 μ m濾膜以去除殘?jiān)洼^小的顆粒物，收集濾液，得過(guò)濾液；
[0033]D、脫色:先用lml100%甲醇和lmllmol/L甲酸平衡C18固相萃取柱(S^)-Pak PlusC18cartridge),然后將過(guò)濾液通過(guò)置于真空抽濾裝置上的96孔C18固相萃取小柱(載量為100mg/ml),并連接上真空泵，以lml/min的速度抽濾，以去除色素和脂類(lèi)物質(zhì)；過(guò)小柱后，收集濾液，再用Iml的樣品提取液洗脫小柱中的樣品并收集濾液，得脫色濾液；
[0034]E、真空濃縮:
[0035]將收集的脫色濾液置于真空濃縮儀中，于40°C濃縮至完全干燥，即完成內(nèi)源細(xì)胞分素的提取。
[0036]2)固相萃取洗脫:
[0037]A、用2mllmol/L甲酸溶解沉淀，以獲得甲酸溶解液；
[0038]B、分別用lmllOO%甲醇和lmllmol/L甲酸平衡96孔的混合型陽(yáng)離子交換反相固相萃取小柱(Oasis MCX column,載量為60mg/ml),然后將甲酸溶解液過(guò)小柱以吸附激素，棄濾液；
[0039]C、用2ml60%甲醇配制的0.35mol/L的氨水洗柱，收集濾液，該收集液中含有細(xì)胞分裂素 Z、ZR、DHZ、DHZR、iP 和 iPA ；
[0040]D、將洗脫液置于真空濃縮儀中40°C濃縮至完全干燥；
[0041]E、過(guò)程B和C需將96孔的混合型陽(yáng)離子交換反相固相萃取柱置于真空抽濾裝置上并連接真空泵，以lml/min的速率進(jìn)行抽濾，以提高洗脫效率。
[0042]3 )高效液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS )連用分析:
[0043]A、將真空濃縮獲得的沉淀用200~500 μ I流動(dòng)相溶解，得流動(dòng)相溶解液；
[0044]B、用一次性醫(yī)用注射器吸取流動(dòng)相溶解液過(guò)0.22 μ m濾膜后裝至進(jìn)樣瓶中，上液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS)進(jìn)樣分析；
[0045]C、如樣品量過(guò)少，樣品裝入帶內(nèi)撐管的進(jìn)樣瓶中進(jìn)行上機(jī)分析；
[0046]D、液相色譜條件為:色譜柱為安捷倫Zorbax SB-C18液相色譜柱(3.5 μ m, 150X2.1mm)，柱溫為30°C，流速為200 μ 1/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為265nm，進(jìn)樣量為10 μ I ;流動(dòng)相具體見(jiàn)下表:
[0047]表1細(xì)胞分裂素Ζ，ZR，DHZ, DHZR，iP，iPA的流動(dòng)相
[0048]
【權(quán)利要求】
1.一種高效分離和測(cè)定草坪草內(nèi)源細(xì)胞分裂素的方法，其特征包括以下步驟: ①內(nèi)源細(xì)胞分裂素的提取:通過(guò)加提取液浸提，然后離心，過(guò)濾，脫色，最后進(jìn)行真空濃縮，完成內(nèi)源細(xì)胞分裂素的提取； ②固相萃取洗脫:溶解內(nèi)源細(xì)胞分裂素并獲得溶解液，過(guò)96孔的固相萃取小柱逐步洗脫，獲得內(nèi)源細(xì)胞分裂素洗脫液，將洗脫液真空濃縮，得固相萃取洗脫物； ③高效液相色譜-質(zhì)譜分析:將固相萃取洗脫物用流動(dòng)相溶解，將流動(dòng)相溶解液過(guò)濾后上高效液相色譜-質(zhì)譜進(jìn)樣分析。
2.按權(quán)利要求1所述的一種高效分離和測(cè)定草坪草內(nèi)源細(xì)胞分裂素的方法，其特征在于步驟①內(nèi)源細(xì)胞分裂素的提取: A、浸提:取0.5g鮮樣，用液氮研磨，然后加提取液5ml，-20°C提取過(guò)夜，得浸提液； 所述的提取液即甲醇:甲酸:水=15:1:4,按v/v,再加40mg/ml2, 6-二叔丁基-4-甲基苯酹作為抗氧化劑； B、離心:將浸提液在15000轉(zhuǎn)/min，4°C下離心10min，收集上清液置于新管并保存于-20°C，殘?jiān)儆?ml提取液于_20°C提取lh，離心，收集上清液并混合于前一次的上清液，得離心液； C、過(guò)濾:將收集的離心液過(guò)20μ m濾膜以去除殘?jiān)洼^小的顆粒物，收集濾液,得過(guò)濾液； D、脫色:先用lml100%甲醇和lmllmol/L甲酸平衡C18固相萃取柱,然后將過(guò)濾液過(guò)置于真空抽濾裝置上的96孔C18固相萃取小柱，并連接上真空泵，以lml/min的速度抽濾，以去除色素和脂類(lèi)物質(zhì)；過(guò)小柱后，收集 濾液，再用Iml的樣品提取液洗脫小柱中的樣品并收集濾液，得脫色濾液； E、真空濃縮: 將收集的脫色濾液置于真空濃縮儀中，于40°C濃縮至完全干燥，即完成內(nèi)源細(xì)胞分裂素的提取。
3.按權(quán)利要求1所述的一種高效分離和測(cè)定草坪草內(nèi)源細(xì)胞分裂素的方法，其特征在于步驟②固相萃取洗脫: A、用2mllmol/L甲酸溶解沉淀，以獲得甲酸溶解液； B、用lml100%甲醇和lmllmol/L甲酸平衡96孔的混合型陽(yáng)離子交換反相固相萃取小柱，然后將甲酸溶解液過(guò)小柱以吸附激素，棄濾液； C、用Iml的lmol/L甲酸洗柱后，用2ml甲醇洗柱，棄濾液； D、用2ml0.35mol/L的氨水沖洗小柱，棄濾液； E、用2ml60%甲醇配制的0.35mol/L的氨水洗柱，收集濾液，該收集液中含有細(xì)胞分裂素(Z，ZR, DHZ, DHZR, iP, iPA)； F、將洗脫液置于真空濃縮儀中40°C濃縮至完全干燥； G、過(guò)程B至E需將96孔的混合型陽(yáng)離子交換反相固相萃取柱置于真空抽濾裝置上并連接真空泵，以lml/min的速率進(jìn)行抽濾，以提高洗脫效率。
4.按權(quán)利要求1所述的一種高效分離和測(cè)定草坪草內(nèi)源細(xì)胞分裂素的方法，其特征在于步驟③高效液相色譜-質(zhì)譜連用分析: A、將真空濃縮獲得的沉淀用200~500 μ I流動(dòng)相溶解，得流動(dòng)相溶解液；B、用一次性醫(yī)用注射器吸取流動(dòng)相溶解液過(guò)0.22 μ m濾膜后裝至進(jìn)樣瓶中，上效液相色譜-質(zhì)譜進(jìn)樣分析； C、如樣品量過(guò)少，樣品裝入帶內(nèi)撐管的進(jìn)樣瓶中進(jìn)行上機(jī)分析； D、色譜柱為安捷倫ZorbaxSB-C18液相色譜柱，柱溫為30°C，流速為200 μ 1/min,紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為265nm，進(jìn)樣量為10yL ;
【文檔編號(hào)】G01N30/06GK103884810SQ201410074317
【公開(kāi)日】2014年6月25日 申請(qǐng)日期:2014年3月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月3日
【發(fā)明者】傅金民, 胡龍興, 婁燕宏 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院武漢植物園