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專利名稱：一種人胎盤成肌纖維母細胞的簡易分離及鑒定方法
一種人胎盤成肌纖維母細胞的簡易分離及鑒定方法發明領域
本發明涉及從人胎盤蛻膜面分離成肌纖維母細胞并對成肌纖維母細胞進行鑒定的方法。
背景技術：
胎盤被認為是最具有吸引力的“成體干細胞”，能在適宜的體內或體外環境下分化為肌細胞、肝細胞、成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞等多種細胞。由于胎盤干細胞材料來源相對方便，易于分離和純化，多次傳代擴增后仍具有干細胞特性，并且不存在免疫排斥的特性；因此近年來已成為干細胞研究中的熱點，在免疫疾病治療、造血干細胞移植、組織工程、基因工程等領域具有較好的應用前景。
成肌纖維母細胞是指胞漿中含有肌絲的肌組織前體細胞，來源于中胚層干細胞，在胚胎發育過程中先由間充質細胞分化而來，然后分裂、融合成多核肌纖維，形成肌小管，再進一步分化為成熟的骨骼肌細胞。
Oliver C從胎盤蛻膜中分離得到一種細胞，該細胞能表達平滑肌肌動蛋白并且有類似于成肌纖維細胞的亞顯微結構；Zuzana Strakova從胎盤中分離的成肌纖維細胞,在特定培養基誘導下，能夠分化為脂肪細 胞、成骨細胞，證明了胎盤成肌纖維細胞的多潛能性，為其在再生醫學領域的研究提供理論支持；Lud0ViC Micallef研究發現成肌纖維細胞在受傷組織傷痕修復及功能恢復方面起著重要的作用；而01^ Eyal在體外把胎盤肌纖維細胞于雌激素等誘導因子共同培養，證明了催乳素可通過自我分泌的機理阻止子宮細胞的蛻膜化。成肌纖維細胞獨有的特點和多潛能性，及其材料來源豐富，為細胞模型建立及再生醫學的研究提供了良好材料。
然而，目前國內針對胎盤成纖維母細胞的分離鮮有報道，即使有報道，也主要集中在MSC或干細胞的分離方面，如CN 102586184 A(中國專利申請號201210044638.6，
公開日期2012年7月18日)公開題為“建立胎盤間充質干細胞庫的方法”的發明；CN 101395266 A(中國專利申請號200680053575.3，
公開日期2009年3月25日)。
在國際上關于胎盤纖維母細胞的報道中，分離方法都集中于酶消化法，但在消化過程中有很多酶的參與:如美國伊利諾伊大學Zuzana Strakova在分離胎盤成纖維細胞時,使用膠原酶、脫氧核糖核酸酶、透明質酸酶、鏈霉蛋白酶四種酶混合反應消化獲得成纖維細胞，多種酶的參與勢必會造成實驗步驟上的復雜和資源的不必要浪費。
成肌纖維母細胞由間充質干細胞分化而來，那么其應該保持著間充質干細胞的一些特性，包含貼壁生長特性，特定細胞表面抗原標志物的表達，向成脂，成骨方向的分化的能力坐寸ο 成肌纖維母細胞是成體干細胞的一種，能夠自我更新并且能夠特化形成組成該類型組織的細胞，其可能表達一種或者多種多能干細胞因子。
結蛋白(Desmin)是一種中間絲蛋白，廣泛存在于大血管的平滑肌細胞，通過鑒定結蛋白的表達，可以驗證細胞的肌原特性。且有文獻報道隨著成肌纖維母細胞的純化，結蛋白的表達也逐步增強。

發明內容
本發明的目的是提供一種簡單實用的從胎盤蛻膜層大量分離成肌纖維母細胞的方法和鑒定分離的成肌纖維母細胞的方法。
本發明的胎盤成纖維母細胞分離方法是，利用手術刀及鑷子剔除蛻膜面的輸血組織等組織，僅留取靠近胎兒的蛻面，只是用膠原酶消化組織，其具體步驟包括:
1、取新鮮胎盤組織，用手術刀在胎盤中央處取約5cm長寬的組織；用生理鹽水清洗去除組織中血液；
2、用鑷子手術刀剝除羊膜和底蛻膜上的血管組織，留取胎兒面蛻膜組織；
3、胎盤嬰兒面蛻膜組織用75%酒精快速洗滌10秒；
4,75%酒精消毒洗滌后以生理鹽水洗滌兩次； 5、用手術刀把胎兒面蛻膜組織切割成0.5cm左右碎片；
6、以與組織碎片等體積的含1%膠原酶I的DMEM消化液37°C消化16-18 h， 消化溶液中無胎盤組織片后停止消化；
7、離心收集單個核細胞，用10%胎牛血清和200單位青鏈霉素雙抗的DMEM/F12培養基重懸細胞；
8、在37°C、5% CO2、飽和濕度下培養箱中培養48 h，誘導貼壁；
9、細胞形成單克隆后，挑取單克隆細胞培養，待細胞融合度達到90%時，0.25%胰酶消化，即得胎盤成肌纖維母細胞。
本發明還通過流式檢測細胞表面抗原和細胞周期、細胞多項分化潛能實驗鑒定分離純化后所得細胞的間質細胞特性，通過多能性干細胞因子的檢測鑒定細胞的干性，通過細胞形態學觀察及細胞結蛋白的表達鑒定細胞的肌原性。
10、正常條件下培養分離的成肌纖維細胞，培養過程中觀察細胞生長特點及形態學變
化；
11、取培養的第三代細胞，流式檢測細胞表面抗原⑶90、⑶44、⑶29、⑶45、HLA-DR，同時進行細胞周期檢測；
12、取培養的第三代細胞進行多能干細胞因子0CT4、S0X2、Nanog的表達檢測；
13、取培養的第三代細胞進行肌原性結蛋白的表達檢測；
14、取培養的第三代細胞進行向成骨，成脂肪分化的檢測。
本發明利用手術刀及鑷子剔除蛻膜面的輸血組織等組織，僅留取近胎兒的蛻面，只是用膠原酶消化組織，剔除不必要的組織，不僅能減少酶使用量、降低成本，減少消化時間，同時避免了大量雜細胞的引入，使細胞純化更為方便。可使所得原代細胞在較短的培養時間內純化為目的細胞。
本發明采用機械分散法與一種酶消化的一步法，此法操作簡單，耗時時間較短，使用少量的消化酶即可達到好的分離效果，有利于后期此類分離方法的規模放大。同時采用特殊試劑前處理組織樣本，在樣本來源不確認的情況下，大大降低污染的風險。
本發明提供的分離所得肌原纖維母細胞的鑒定方法組合，一站式解決細胞的鑒定問題，且鑒定方法和結果可信、有效。


圖1:細胞形態: A:單個細胞照片 B:細胞單克隆照片 C:細胞融合度達到90%照片 圖2:流式細胞術檢測細胞表型 圖3:流式細胞術檢測細胞周期 圖4:細胞成骨細胞鑒定檢測 圖5:細胞成脂肪細胞檢測 圖6:細胞多能干細胞因子檢測，從左至右分別為:0CT4、S0X2、Nanog的RT-PCR電泳照片 圖7:細胞結蛋白表達檢測 實施方式
本發明公開了一種人胎盤成肌纖維母細胞的分離和鑒定方法，本領域的技術人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明中。
為了使本領域技術人員更好的理解本發明的技術方案，下面結合具體具體實施例對本發明做進一步詳細的說明。 實施例一胎盤成肌纖維母細胞分離培養 在無菌生物安全柜中取順產嬰兒的新鮮胎盤組織(12小時以內)，用手術刀在胎盤中央處取約5 cm長寬的組織，250 mL生理鹽水洗滌2次，使勁擠壓胎盤組織，使組織中的血液充分洗出，用鑷子和手術刀剝除羊膜和底蛻膜上的輸血組織；留取胎兒面蛻膜組織，250 mL生理鹽水洗滌I次，用手術刀把胎兒面蛻膜組織切割成1.5 cm長、0.5 cm寬的大小；75%酒精快速清洗消毒10秒，再以250 mL生理鹽水洗滌2次；以與組織碎片等體積的含1%膠原酶I的DMEM消化液37 °C消化16-18 h,消化溶液中無胎盤組織片后停止消化；將消化后的組織液平均分裝于2個50 mL離心管中，添加生理鹽水到50 mL, 2300 rpm,離心10 min離心收集單個核細胞；生理鹽水洗滌2次，2000 rpm，離心10 min，用含10%胎牛血清和200單位青鏈霉素雙抗的DMEM/F12培養基中重懸單個核細胞；在37 °C、5% CO2、飽和濕度下培養。
原代細胞培養48小時后全量換液，去除非貼壁細胞，添加新鮮培養基，待散在貼壁細胞形成單克隆后，挑取單克隆細胞單獨培養，獲得胎盤成纖維母細胞，待細胞融合度達到90%時，胰酶消化傳代。
實施例二胎盤成肌纖維母細胞形態學鑒定 培養按照實施例一方法分離的成肌纖維細胞，誘導貼壁2天后，顯微鏡下可見散在的梭形貼壁細胞，將培養上清液全部倒掉，同時去除不貼壁的雜質細胞，培養5-7天后，可見成放射狀的單克隆細胞形成，用細胞刮刀刮取單克隆細胞于12孔板中培養，待細胞數量達到5X106左右時，用于后續其它鑒定。
顯微鏡下觀察可見(圖1)細胞呈梭形或紡錘形，有兩極，體積小，隨著培養時間的增力口，細胞體積變大，融合生長，這些特點符合成肌纖維細胞的生長特點和形態學特點。
實施例三胎盤成肌纖維母細胞表面標志物鑒定
分別取不同胎盤來源按照實施例一培養的第3代細胞，流式細胞術檢測細胞表面標志，觀察不同胎盤來源細胞表面標志的變化。消化收集細胞，計數后取I X IO6個，PBS洗滌一次，1500 rpm，離心10 min ;棄上清，殘留200 uL，吹打混勻細胞，加入FITC標記的CD90、⑶45和APC標記的⑶29、HLA-DR及PE標記的⑶44抗體各10 uL，并設I管為空白對照，在4 °C下避光反應30 min, PBS洗漆一次，1500 rpm,離心10 min,棄上清,殘留200 uL,上機檢測。
流式檢測結果圖2顯示不同胎盤來源細胞⑶90 (99%左右)、⑶44 (98%左右)、⑶29(97%左右)三種抗原的表達均高于95%以上，⑶45 (0.7%左右)、HLA-DR (0.4%左右)兩種抗原的表達均低于2%。細胞表面標志物結果表明細胞具有間質纖維細胞特性。
實施例四胎盤成肌纖維母細胞細胞周期檢測
按照實施例一培養細胞，待細胞生長融合度為90%時，進行細胞周期檢測。消化收集細胞，計數后取I X IO6個，PBS洗滌一次，棄上清，加入70%的乙醇-20 °C固定2 h，離心去除乙醇，用PBS洗滌一次，加入RNaseI 5 uL(20 mg/mL), 37 °C反應30 min，PBS洗滌一次，力口入碘化丙啶(PI，50 ug/mL) 0.5 uL，4 1:避光反應30 min，上機檢測DNA含量。
細胞周期分析結果圖3顯示，處于G0/G1期、S期、G2M期細胞比例平均為93.72%、3.7%、
2.57%。證明培養中的胎盤成肌纖維母細胞大部分細胞處于G0/G1靜息期，只有少數細胞處于活躍的S增殖期，具有典型的干細胞增長特點。
實施例五胎盤成肌纖維母細胞成骨分化潛能鑒定
按照實施例一培養3代以上細胞，消化制成`單細胞懸液，按照2 X IO4個/cm2的密度使用含10%胎牛血清和200單位青鏈霉素雙抗的DMEM/F12培養基接種于預鋪了 I型鼠尾膠原6孔板中，在37 °C、5% CO2、飽和濕度下培養，待細胞融合度達到50%后，更換含地塞米松
0.1 u M、抗壞血酸磷酸鹽50 u g/mL、^ -磷酸甘油10 mM的新鮮培養基誘導培養，3天換液一次，共誘導3周，使用95%乙醇固定細胞，茜素紅染色，顯微鏡下觀察胞外鈣基質沉淀的形成。
觀察圖4結果顯示,細胞基質明顯有I丐基質沉淀,表明細胞已向成骨細胞轉化,具有間質干細胞的特性。
實施例六胎盤成肌纖維母細胞成脂分化潛能鑒定
按照實施例一培養3代以上細胞，消化制成單細胞懸液，按照I X IO5個/cm2的密度使用含10%胎牛血清和200單位青鏈霉素雙抗的DMEM/F12培養基接種于預鋪了 I型鼠尾膠原6孔板中，在37 °C、5% CO2、飽和濕度下培養，待細胞融合度達到80%后，更換含地塞米松IU M、消炎痛0.1 mM、IBMX 0.5 mM、胰島素5 u g/ml的新鮮培養基誘導培養，3天換液一次，共誘導3周，10%多聚甲醛固定細胞，油紅染色。
觀察圖5結果顯示，細胞產生的脂肪被特異性染成紅色，表明細胞已向脂肪細胞轉化，具有間質干細胞的特性。
實施例七胎盤成肌纖維母細胞多能干細胞因子表達鑒定
取不同胎盤來源按照實施例一培養的第3代細胞，細胞量達到5X IO6個，提取細胞的總RNA，反轉錄獲得cDNA，以cDNA為模板，使用下述引物進行RT-PCR，檢測0CT4、S0X2和Nanog基因的表達狀況，該操作以試劑盒說明書進行，引物序列如表I所示。
表I =RT-PCR引物序列及其特性
權利要求
1.一種人胎盤成肌纖維母細胞的簡便分離方法，包括取胎盤，用鑷子手術刀剝除羊膜和底蛻膜上的血管組織，留取胎兒面蛻膜組織，使用75%酒精快速消毒洗滌組織10秒，然后以生理鹽水洗滌2次，用手術刀把胎兒面蛻膜組織割成1.5 cm長、0.5 cm寬的大小碎片；加入與組織碎片等體積的含1%膠原酶I的DMEM消化液，37 °C消化16-18 h，消化溶液中無胎盤組織片后停止消化，離心收集單個核細胞；用含10%胎牛血清和200單位青鏈霉素雙抗的DMEM/F12培養基在37°C、5%C02、飽和濕度下培養48h，誘導貼壁，細胞形成單克隆后，挑取單克隆細胞單獨培養，待細胞融合度達到90%時，胰酶消化。
2.根據權利要求1，胎盤成肌纖維母細胞來自于在胎盤嬰兒面蛻膜組織。
3.根據權利要求1，以75%酒精快速洗滌胎盤組織10秒。
4.根據權利要求1，用手術刀把胎兒面蛻膜組織割成1.5 cm長、0.5 cm寬的大小片段。
5.根據權利要求1，消化液為含膠原酶I的DMEM溶液。
6.根據權利要求1,消化時間為16-18h0
7.根據權利要求1，細胞培養使用含10%胎牛血清和200單位青鏈霉素雙抗的DMEM/F12培養基。
8.根據權利要求1，形成單克隆后，挑取單克隆細胞單獨培養，來純化細胞。
9.一種鑒定人胎盤來源成纖維母細胞的鑒定方法組合，包含:細胞形態學，細胞周期，細胞表面標志物檢測，細胞分化能力檢測，細胞多能干細胞因子檢測及細胞結蛋白表達檢測共6種方法。
10.根據權利要求9，細胞表面標志物檢測包括表面抗原⑶90、⑶44、⑶29、⑶45、HLA-DR。
11.根據權利要求9，采用向成脂，成骨分化的方法檢測細胞的分化能力。
12.根據權利要求9，采用檢測0CT4、S0X2、Nanog3種因子進行細胞多能性的鑒定。
13.根據權利要求9，采用結蛋白表達鑒定細胞的肌原性。
全文摘要
本發明涉及建立人胎盤成肌纖維母細胞的分離及鑒定方法。把胎盤胎兒面蛻膜組織機械破碎后，通過含膠原酶I的DMEM消化液消化，分離為單個核細胞，用含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養基在37℃、5%CO2、飽和濕度下培養，誘導貼壁，48小時后全量換液，去除非貼壁細胞，添加新鮮培養基，待貼壁細胞形成單克隆后，分別培養各單克隆細胞，當細胞融合90%左右時，胰酶傳代，即得成肌纖維母細胞。本發明采用細胞形態學，細胞周期，細胞表面標志物檢測，細胞成脂、成骨分化能力檢測，細胞多能干細胞因子檢測及細胞結蛋白表達檢測的組合方法鑒定所得成肌纖維母細胞。
文檔編號G01N15/14GK103173405SQ20131009074
公開日2013年6月26日 申請日期2013年3月21日 優先權日2013年3月21日
發明者王云虹, 李志剛, 丁煒, 王穎穎, 高長青, 楊海蓮, 武曉云, 黃芳蕾, 聶晨飛, 劉潔, 李大為, 安志達, 吳蘭蘭, 馬瑞, 呂巖, 康會彥, 劉學敏, 柏小麗 申請人:北京京蒙高科干細胞技術有限公司