一種熒光滴定測定單抗活性位點濃度的方法
【專利摘要】一種熒光滴定測定單抗活性位點濃度的方法，以340nm附近為激發峰且280nm為激發谷的熒光團為色氨酸FRET接受體，用非熒光半抗原、無色氨酸抗原表位為非熒光探針，非熒光探針與色氨酸FRET接受體加合物、色氨酸FRET接受體類半抗原為熒光探針；探針與純單抗反應，280nm激發測定340nm熒光或色氨酸FRET接受體熒光得滴定曲線；基于可逆反應、探針靜態和動態猝滅、熒光信號加和，建立熒光信號變化數學模型擬合滴定曲線確定單抗位點濃度。分析340nm信號變化時，用不收斂但擬合決定系數高于0.99參數計算信號變化一階導數最大值為單抗340nm信號響應曲線斜率，再擬合相同滴定曲線得單抗位點濃度。
【專利說明】一種熒光滴定測定單抗活性位點濃度的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及單抗濃度的測量方法，其特征是通過滴定探針與單抗的活性位點結合，測量其熒光猝滅信號或色氨酸熒光共振能量轉移接受體信號獲得滴定曲線，基于單抗與半抗原及抗原表位可逆結合建立化學計量學關系，并優化擬合滴定曲線，估算出單抗的活性位點濃度。
【背景技術】
[0002]單抗是用于免疫分離分析的關鍵生物材料。為標準化應用過程，需要準確測定并溯源單抗的含量，尤其需要篩選高親和力的單抗。目前測定單抗含量常測定其280nm吸收，并用單抗的平均消光系數計算單抗的質量或數量。顯然，當某單抗芳香族氨基酸殘基豐度與測定單抗平均消光系數所用單抗的平均豐度有偏差時，其消光系數也就會偏離單抗的平均消光系數，使測定結果出現明顯的偏差。測定單抗含量的另一種方法是測定其樣品溶液與帶標記半抗原、抗原表位或全抗原作為探針反應產生可檢測復合物的最大稀釋度，即滴度。顯然，此類探針中標記信號的比活性、單抗親和力對所測滴度有顯著影響；此類探針純度不足及其標記信號比活性的波動，都會造成測定結果的偏差，使得測定滴度定量單抗的數據很難溯源。因此，需要建立新方法來測定單抗的質量、數量或活性位點量并標定其280nm消光系數。
[0003]單抗一般含有色氨酸，其在280nm激發下發射340nm熒光信號，這是單抗熒光信號的主要來源。單抗與其半抗原、抗原表位或者全抗原結合后其熒光易被猝滅；當它們復合物中來自單抗的色氨酸和結合探針之間能發生熒光共振能量轉移(FRET)時，單抗熒光被猝滅效率更高。因此，可測定單抗被探針滴定時在280nm激發下340nm的突光粹滅確定單抗量，滿足此滴定方法要求的探針有兩類。一類是非熒光探針，包括非熒光半抗原、缺乏色氨酸的連續抗原表位。另一類是熒光探針，定義在280nm為激發谷而在340nm為激發峰的熒光團為色氨酸的FRET接受體；適合作為色氨酸FRET接受體的半抗原，及非熒光探針與色氨酸的適當FRET接受體的加合物就屬于此法所需熒光探針。非熒光探針基于靜態猝滅降低單抗的熒光；熒光探針還通過FRET效應增強猝滅效應，同時發出探針自身特有熒光。因此，用這兩類探針，監測單抗340nm熒光甚至FRET接受體熒光可測定單抗的滴定曲線；分析滴定曲線應能測定單抗含量，即其結合半抗原、抗原表位的活性位點濃度或數量。
【發明內容】
[0004]1.一種熒光滴定測定單抗活性位點濃度的方法，其特征如下:
[0005](一 )所適用單抗有較高純度，能識別非熒光半抗原、缺乏色氨酸的連續抗原表位、激發峰在340nm附近而在280nm附近為激發谷的熒光半抗原，且不含有其它抗體或蛋白；
[0006]( 二 )所用滴定探針包括熒光探針和非熒光探針兩類；非熒光探針為單抗所識別的非熒光半抗原、缺乏色氨酸連續抗原表位；激發峰在340nm附近且在280nm附近為激發谷的熒光團稱色氨酸FRET接受體，對應熒光探針為色氨酸FRET接受體類熒光半抗原、上述非熒光探針與色氨酸FRET接受體熒光團的加合物；
[0007](三)用滴定探針測定對應單抗的熒光滴定曲線；此滴定曲線測定過程的特征如下:
[0008](I)取一定量中性磷酸鹽緩沖液至熒光比色杯中，加入一定量單克隆抗體樣品溶液混合均勻:用總容量為4.0ml的熒光比色杯時，混勻后液體總體積在2.0ml以上；用微量熒光比色杯時，混勻后液體總體積達到熒光分光光度計測定所含液體熒光信號的要求；
[0009](2)準確稱量所選滴定探針，用相同中性緩沖液直接溶解并稀釋至不低于20μΜ，有強吸收探針用吸收標定濃度；或用二甲亞砜、二甲基甲酰胺等溶劑配制成濃度不低于
2.0mM儲備液，再用相同中性緩沖液稀釋到20 μ M ;滴定使用之前再稀釋到2.0 μ M或所需濃度；
[0010](3)取5~20 μ L探針溶液加入熒光比色杯內單抗溶液中，溫和搖勻后靜置反應3~10分鐘；用非熒光探針滴定時，280nm激發測定340nm熒光信號；用熒光探針時280nm激發測定340nm熒光信號或熒光探針自身特有發射峰下熒光信號；用丹磺酰胺為色氨酸FRET接受體時，測定在540nm附近熒光信號；熒光信號穩定后記錄在所選波長下的熒光信號;
[0011](4)繼續取5~20μ L探針溶液加入相同熒光比色杯內含待測單抗的溶液中，溫和搖勻，靜置3~10分鐘后測定所選波長下的穩定熒光信號；重復操作到加入探針后所測熒光信號相對變化小于1%或滴定探針累積濃度達到據其蛋白量換算所得抗體活性位點濃度10倍；
[0012](5)按照信號和各種物質的濃度成正比的原則，校正加入的滴定探針溶液對單抗起始濃度Ctl的稀釋效應、對熒光信號的降低效應；
[0013](四)用Matlab類軟件或自編程序，按如下公式擬合滴定曲線測定單抗的位點濃度:
[0014](I)定義如下的變量和符號:
[0015]
【權利要求】
1.一種熒光滴定測定單抗活性位點濃度的方法，其特征如下: (一)所適用單抗有較高純度，能識別非熒光半抗原、缺乏色氨酸的連續抗原表位、激發峰在340nm附近而在280nm附近為激發谷的熒光半抗原，且不含有其它抗體或蛋白； (二)所用滴定探針包括熒光探針和非熒光探針兩類；非熒光探針為單抗所識別的非熒光半抗原、缺乏色氨酸連續抗原表位；激發峰在340nm附近且在280nm附近為激發谷的熒光團稱色氨酸FRET接受體，對應熒光探針為色氨酸FRET接受體類熒光半抗原、上述非熒光探針與色氨酸FRET接受體熒光團的加合物； (三)用滴定探針測定對應單抗的熒光滴定曲線；此滴定曲線測定過程的特征如下: (1)取一定量中性磷酸鹽緩沖液至熒光比色杯中，加入一定量單克隆抗體樣品溶液混合均勻:用總容量為4.0ml的熒光比色杯時，混勻后液體總體積在2.0ml以上；用微量熒光比色杯時，混勻后液體總體積達到熒光分光光度計測定所含液體熒光信號的要求； (2)準確稱量所選滴定探針，用相同中性緩沖液直接溶解并稀釋至不低于20μΜ，有強吸收探針用吸收標定濃度；或用二甲亞砜、二甲基甲酰胺等溶劑配制成濃度不低于2.0mM儲備液，再用相同中性緩沖液稀釋到20 μ M ;滴定使用之前再稀釋到2.0 μ M或所需濃度； (3)取5~20μ L探針溶液加入熒光比色杯內單抗溶液中,溫和搖勻后靜置反應3~10分鐘；用非熒光探針滴定時，280nm激發測定340nm熒光信號；用熒光探針時280nm激發測定340nm熒光信號或熒光探針自身特有發射峰下熒光信號；用丹磺酰胺為色氨酸FRET接受體時，測定在540nm附近熒光信號；熒光信號穩定后記錄在所選波長下的熒光信號； (4)繼續取5~20μ L探針溶液加入相同熒光比色杯內含待測單抗的溶液中，溫和搖勻，靜置3~10分鐘后測定所選波長下的穩定熒光信號；重復操作到加入探針后所測熒光信號相對變化小于I %或滴定探針累積濃度達到據其蛋白量換算所得抗體活性位點濃度10倍； (5)按照信號和各種物質的濃度成正比的原則，校正加入的滴定探針溶液對單抗起始濃度Ctl的稀釋效應、對熒光信號的降低效應； (四)用Matlab類軟件或自編程序，按如下公式擬合滴定曲線測定單抗的位點濃度: (1)定義如下的變量和符號: Cx:滴定探針和單抗的復合物的濃度； CQ:為單抗的位點濃度； Kd:探針與單抗的解離常數；X:滴定探針的總濃度； F:測量波長下的總熒光信號；S1:游離單抗的熒光信號響應系數； Ksv:滴定探針的動態猝滅常數；S2:探針和單抗復合物的熒光信號響應系數； Fb:雜蛋白及其它物質的熒光信號；S3:游離探針的熒光信號響應系數； (2)據探針和單抗可逆結合平衡、各成分熒光信號線性加、同時考慮動態及靜態猝滅得:
2.據權利要求1所述一種熒光滴定測定單抗活性位點濃度的方法，其有如下應用特征: (1)非熒光半抗原、缺乏色氨酸的連續抗原表位能直接作為探針用于滴定單抗活性位點；應用此類非熒光探針需測定340nm熒光信號，對應要求被分析的單抗樣品中無其他蛋白或其它抗體或小分子產生的340nm熒光信號，從而使得本底熒光信號Fb為零； (2)用熒光探針，即適合作為色氨酸FRET接受體熒光團與非熒光探針的加合物及適合作為色氨酸FRET接受體的熒光半抗原本身作為探針，可測定單抗在340nm熒光信號或者這些色氨酸FRET接受體特有熒光信號監測滴定過程獲得滴定曲線；用EqU.(2)擬合分析用此類探針測定的色氨酸FRET接受體特異熒光信號能承受樣品中的本底信號，同時還能同步確定探針與單抗的親和力Kd，故應用這種探針還能篩選針對所用半抗原的高親和力單抗； (3)此方法所測單抗位點濃度對純化單抗所含色氨酸的相對豐度變化有抗性。
【文檔編號】G01N31/16GK103954599SQ201410190645
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年5月8日 優先權日:2014年5月8日
【發明者】廖飛, 楊曉蘭, 胡小蕾, 秦家林, 何琛雄, 李元麗, 劉霖 申請人:重慶醫科大學
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