專利名稱:單胺氧化酶診斷試劑(盒)及單胺氧化酶活性濃度測定方法
技術領域:
本發明涉及一種單胺氧化酶診斷/測定試劑(盒),同時本發明還涉及測定單胺氧
化酶活性濃度的方法,屬于醫學檢驗測定技術領域。
背景技術:
現有技術中,測定單胺氧化酶(MAO)活性的方法主要有熒光法、免疫抑制法和化 學分光光度法。熒光法是以e-苯乙胺作為底物來檢測單胺氧化酶,其依據是e-苯乙胺 在10 100mg時反應速度最大,高于芐胺和5-羥色胺的反應速度。免疫學方法則利用單胺 氧化酶抗體與單胺氧化酶發生反應,測定反應后形成的單胺氧化酶同工酶,目前應用較多
的單克隆抗體有MA0-A3C9 、 MA0-A4F10 、 MA0-A7B10 、 MA0-A7氨甲酰磷酸合成酶0和MA0-B1C2等。 相對而言,化學分光光度法應有更為普遍。可以用單胺氧化酶催化胺類釋放 出的過氧化氫(H202)去氧化10-N-甲基氨基甲酰基-3,7-二甲氨基-10-氫-吩噻嗪 (MCDP)等發色劑進行測定,也可以應用芐胺(Benzylamine)、對苯甲胺-l3-偶氮萘酚、 丁基胺(butylamine)、戊基胺(amylamine) 、 |3 -苯乙基胺(b-phenylethylamine)、酪 胺(tyr咖ine,又稱"3-對羥基苯乙胺,,,3-pa:rahdroxyphenylethyl咖ine) 、5-羥色胺 (5-hydroxytryptamine)等作為反應底物來測定單胺氧化酶的活性。其中,應用苯甲胺類型 底物測得的單胺氧化酶的活性比其它底物高,而用丁基胺、戊基胺、P-苯乙基胺作底物測 得的活性約為3-對羥基苯乙胺作底物的30%。目前,單胺氧化酶測定多用芐胺和對苯甲 胺-e-偶氮萘酚作為底物。芐胺法的原理是芐胺在單胺氧化酶的作用下生成芐醛,然后在 強堿性氫氧化鈉的條件下與二硝基苯肼反應,生成醛苯腙,這在生化儀上測定較困難;對苯 甲胺-P _偶氮萘酚方法則需要用環乙烷提取,限制了該方法的實用性,且不能應用全自動 生化儀分析。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提出一種利用酶比色法(EnzymaticColorimetric
Method)及酶(偶)聯法(Couple Reaction)技術,連續監測還原型煙酰胺輔酶(還原型輔
酶)在340nm波長處吸光度的變化,得以測定單胺氧化酶活性濃度的方法,同時,本發明還
將給出用以實現該方法的單胺氧化酶診斷/測定試劑(盒),采用該試劑不僅可以在紫外/
可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上進行單胺氧化酶活性濃度測定,而且測定速度快、
準確度高,因而可以得到切實的推廣應用。 本發明單胺氧化酶活性濃度測定方法如下 胺類化合物+水+氧單胺氧化酶相應醛類產物+氨+過氧化氫 過氧化氫+ 二氧化碳+乙酰輔酶A丙酮酸氧化酶丙酮酸+ 輔酶A+氧
丙酮酸+氨+還原型輔酶丙氨酸脫氡酶丙氨酸+水+輔酶這種方法應用單胺氧化酶(Monoamine Oxidase ;EC 1. 4. 3. 4 ;EC 1. 4. 3. 6)酶
(偶)聯丙酮酸氧化酶[pyruvate oxidase (CoA-acetylating) ;EC 1. 2. 3. 6]、丙氨酸脫氫 酶(alanine dehydrogenase ;EC 1. 4. 1. 1)酶促反應連續監測法。單胺氧化酶酶解胺類化 合物反應產生過氧化氫,再通過(偶)聯合丙酮酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶的作用,最終將還 原型輔酶(在340nm處有吸收峰)氧化成為輔酶(在340nm處沒有吸收峰),從而得以測定 還原型輔酶在340nm處吸光度下降的速度,通過測量340nm處吸光度下降的速度,可以測算 單胺氧化酶的活性濃度大小。 實驗表明,從測定結果的準確性和配制成本的經濟性兩方面綜合考慮,無論是單
劑、雙劑還是三劑,如下成分關系的本發明單胺氧化酶診斷/測定試劑較為理想 緩沖液 100mmol/L 穩定劑 500mmol/L 還原型輔酶 0. 25mmol/L 丙酮酸氧化酶 10000U/L 丙氨酸脫氫酶 10000U/L 胺類化合物 5mmol/L 碳酸氫鈉 15mmol/L 乙酰輔酶A 4mmol/L 氯化銨 7mmol/L 本發明測定單胺氧化酶活性的診斷試劑盒的成分當中,所述"胺類化合物"優選以 下物質之一 芐胺、對苯甲胺_ P _偶氮萘酚、丁基胺、戊基胺、P _苯乙基胺、酪胺、5-羥色胺 或者這七種物質的衍生物,但選擇范圍不受這些列舉所限制。碳酸氫鈉(二氧化碳)可以 用其它碳酸氫鹽取代。氯化銨可以用其它銨鹽取代。 本發明的單胺氧化酶診斷/測定試劑(盒)可以是單劑,包括 緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、丙酮酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶、胺類化合物、碳酸氫
鈉(二氧化碳)、乙酰輔酶A、氯化銨。 試劑(盒)可以是干粉狀態,在使用前加水溶解后使用;也可以配制成液體試劑,
直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑l
緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、胺類化合物、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰輔酶A、氯
化銨。
試劑2
緩沖液、穩定劑、丙酮酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶。
還原型輔酶、丙酮酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶、胺類化合物、碳酸氫鈉(二氧化碳)、 乙酰輔酶A、氯化銨在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑(盒)可以是干粉狀態,在 使用前加水溶解后使用;也可以配制成液體試劑,直接使用。
還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑
試劑1
緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、胺類化合物、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰輔酶A、氯 化銨。 試劑2 緩沖液、穩定劑、丙氨酸脫氫酶。
試劑3 緩沖液、穩定劑、丙酮酸氧化酶。 還原型輔酶、丙酮酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶、胺類化合物、碳酸氫鈉(二氧化碳)、 乙酰輔酶A、氯化銨在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑(盒)可以是干粉 狀態,在使用前加水溶解后使用;也可以配制成液體試劑,直接使用。 無論是單劑、雙劑還是三劑,本發明測定單胺氧化酶活性濃度的方法,其還原型輔 酶可以是NADPH、 NADH或thio-NADH中的一種。
具體實施例方式
下面結合實施例子對本發明作進一步的說明。
實施例一 本實施例的單胺氧化酶診斷/測定試劑為單試劑,包括
三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L穩定劑500,1/L還原型輔酶0. 25,1/L丙酮酸氧化酶10000U/L丙氨酸脫氫酶10000U/L芐胺5mmol/L碳酸氫鈉15mmol/L乙酰輔酶A4mmol/L氯化銨7mmol/L 試劑全部溶解配好后,分裝入瓶,進行冷凍干燥,制成干粉試劑;使用前,加入純凈 水,復溶后使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37t:,反應時間IO分鐘,起始吸光度I. 8±0. 7, 測試主波長340nm,測試副波長405nm,被測單胺氧化酶樣品與試劑的體積比例為1/25, 反應方向為負反應(下降反應),延遲時間大約1分鐘左右,檢測時間2分鐘左右,理論K 值-4180。 加入樣品和試劑后,使之混合并發生反應,最終將反應物置于生化分析儀下,檢測 主波長340nm吸光度下降的速度,從而測算出單胺氧化酶的活性濃度大小。
實施例二 本實施例的單胺氧化酶診斷/測定試劑為雙試劑,包括
試劑1三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 lOOmmol/L
穩定劑 50mmol/L
還原型輔酶 0. 25mmol/L
芐胺
乙酰輔酶A
氯化銨
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷 穩定劑
丙酮酸氧化酶
5mmol/L 15mmol/L 4mmol/L 7mmol/L
鹽酸緩沖液 100mmol/L 500,1/L 10000U/L 10000U/L
試劑全部溶解配好后,分裝入瓶,制成液體雙試劑,可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37t:,反應時間IO分鐘,起始吸光度I. 8±0. 7, 測試主波長340nm,測試副波長405nm,被測單胺氧化酶樣品與試劑1、試劑2的體積比例為 2/20/5,反應方向為負反應(下降反應),延遲時間大約1分鐘左右,檢測時間2分鐘左右, 理論K值-2170。 加入樣品和試劑后,使之混合并發生反應,最終將反應物置于生化分析儀下,檢測 主波長340nm吸光度下降的速度,從而測算出單胺氧化酶的活性濃度大小。
實施例三
本實施例的單胺氧化酶診斷/測定試劑為三試劑,包括 試劑l
三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 穩定劑 還原型輔酶 芐胺
乙酰輔酶A
氯化銨
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷 穩定劑
鹽酸緩沖液
100,1/L 50mmol/L 0. 25,1/L 5mmol/L 15mmol/L 4mmol/L 7mmol/L
100,1/L 500,1/L 10000U/L
試劑3
三(羧甲基)氨基甲烷 穩定劑
丙酮酸氧化酶
鹽酸緩沖液
100,1/L 500,1/L 10000U/L
試劑全部溶解配好后,分裝入瓶,制成液體三試劑,可以直接使用。
測定單胺氧化酶活性濃度時,在全自動生化分析儀上設定溫度37t:,反應時間
10分鐘,起始吸光度1. 8±0. 7,測試主波長340nm,測試副波長405nm,被測單胺氧化酶樣品 與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5,反應方向為負反應(下降反應),延遲時 間大約1分鐘左右,檢測時間2分鐘左右,理論K值-2170。
加入樣品和試劑后,使之混合并發生反應,最終將反應物置于生化分析儀下,檢測 主波長340nm吸光度下降的速度,從而測算出單胺氧化酶的活性濃度大小。
申請人:經過實驗驗證,采用以上發明內容中記載的其他測定方法均能達到本發明 的目的,鑒于測定步驟等情況與以上實施例類同,不另一一例舉。 總之,實驗證明采用本發明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀器得出所 需的測定結果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0.001 ;吸光度時間反應曲線應呈直 線下降;試劑可測有效(R > 0. 99)線形范圍可達500U/L ;試劑測試的不準確度,其相對偏 差不超過±5% ;試劑測試的精密度(重復性)的變異系數(CV)《3% ;試劑的靈敏度可 達O. 0002±0. 0001 AA/min/U/L ;試劑在2-8。C下保存,活性可以穩定一年;——本發明靈 敏度高、精確度好,線形范圍寬廣,穩定期長,足以便于推廣應用。
權利要求
一種利用酶比色法及酶聯法技術的單胺氧化酶活性濃度測定方法,其方法如下胺類化合物+水+氧 單胺氧化酶 相應醛類產物+氨+過氧化氫過氧化氫+二氧化碳+乙酰輔酶A 丙酮酸氧化酶 丙酮酸+ 輔酶A+氧丙酮酸+氨+還原型輔酶 丙氨酸脫氫酶 丙氨酸+水+輔酶將最終反應物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下,檢測主波長340nm吸光度下降的速度,測算出單胺氧化酶的活性濃度大小結果。
2. —種單胺氧化酶診斷/測定試劑(盒),主要成分包括輔酶A+氧緩沖液20-500mmmol/L穩定劑1-4000500mmmol/L還原型輔酶0.1-0.35500mmmol/L丙酮酸氧化酶1000-80000L/L丙氨酸脫氫酶1000-80000L/L胺類化合物1-50 mmmol/L碳酸氫鈉(二氧化碳)1-50 mmmol/L乙酰輔酶A 氯化銨1-50 mmmol/L本發明測定單胺氧化酶活性的診斷試劑盒的成分當中,所述"胺類化合物"優選以下物 質之一芐胺、對苯甲胺-e-偶氮萘酚、丁基胺、戊基胺、e-苯乙基胺、酪胺、5-羥色胺或者 這七種物質的衍生物,但選擇范圍不受這些列舉所限制。碳酸氫鈉(二氧化碳)可以用其 它碳酸氫鹽取代。氯化銨可以用其它銨鹽取代。試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍;在此范圍內效果較好,在此范圍外,試劑仍會 反應作用。其特征在于試劑(盒)可以是干粉狀態,在使用前加水溶解后使用;也可以配制成液 體試劑,直接使用。
3. 根據權利要求2所述單胺氧化酶診斷/測定試劑(盒),其特征在于 由緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、丙酮酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶、胺類化合物、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰輔酶A、氯化銨組成單劑試劑。
4. 根據權利要求2所述單胺氧化酶診斷/測定試劑(盒),其特征在于 由緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、丙酮酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶、胺類化合物、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰輔酶A、氯化銨組成雙劑試劑;試劑1,由緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、胺 類化合物、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰輔酶A、氯化銨組成;試劑2,由緩沖液、穩定劑、丙酮酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶組成。還原型輔酶、丙酮酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶、胺類化合物、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰輔酶A、氯化銨在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據權利要求2所述單胺氧化酶診斷/測定試劑(盒),其特征在于由緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、丙酮酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶、胺類化合物、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰輔酶A、氯化銨組成多劑試劑;試劑1,由緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、胺 類化合物、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰輔酶A、氯化銨組成;試劑2,由緩沖液、穩定劑、丙氨酸脫氫酶組成;試劑3,由緩沖液、穩定劑、丙酮酸氧化酶組成。還原型輔酶、丙酮酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶、胺類化合物、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰輔酶A、氯化銨在試劑1、試劑2或 試劑3中的位置可以不限。
6.根據權利要求2所述單胺氧化酶診斷/測定試劑(盒),其特征在于還包括穩定 劑l-4000mmol/L或0. 1% _100%體積比。所述穩定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘 油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至 少一種。
全文摘要
本發明涉及一種利用酶比色法及酶聯法技術的單胺氧化酶診斷/測定試劑(盒),同時本發明還涉及測定單胺氧化酶活性濃度的方法、試劑的組成及成分,屬于醫學檢驗測定技術領域。本發明的試劑(盒)主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、胺類化合物、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰輔酶A、氯化銨、丙酮酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶及穩定劑;通過將樣品與試劑按一定的體積比混合,使之發生一系列的酶促反應,再將反應物置于紫外/可見光分析儀下,檢測主波長340nm處吸光度下降的速度,從而測算出單胺氧化酶的活性濃度大小。
文檔編號G01N35/00GK101793695SQ20091002820
公開日2010年8月4日 申請日期2009年2月4日 優先權日2009年2月4日
發明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司