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流式細(xì)胞術(shù)方法在疫苗生產(chǎn)實時監(jiān)測中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種流式細(xì)胞術(shù)方法在疫苗生產(chǎn)實時監(jiān)測中的應(yīng)用。該應(yīng)用是將流式細(xì)胞術(shù)方法應(yīng)用于疫苗生產(chǎn)過程中，實時監(jiān)測疫苗生產(chǎn)過程中的活菌數(shù)。本發(fā)明通過熒光染料對菌細(xì)胞進(jìn)行著染，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)菌熒光信號的變化，通過測定細(xì)菌熒光信息的變化，得到具有如下參數(shù)中的至少兩種的FCM圖譜：活菌數(shù)、死菌數(shù)和總菌數(shù)；依據(jù)FCM圖譜得到活菌數(shù)的比例；通過絕對計數(shù)法得到目標(biāo)菌菌液的濃度；依據(jù)活菌數(shù)的比例和目標(biāo)菌菌液的濃度，得到目標(biāo)菌的活菌量和死菌量。本發(fā)明為疫苗生產(chǎn)過程提供一種簡便、快速、可靠的細(xì)菌活性監(jiān)測方法，其簡便易行，操作時間僅需30min，且能精確控制疫苗生產(chǎn)過程的質(zhì)量。
【專利說明】流式細(xì)胞術(shù)方法在疫苗生產(chǎn)實時監(jiān)測中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及流式細(xì)胞術(shù)的技術(shù)應(yīng)用，特別涉及流式細(xì)胞術(shù)方法在疫苗生產(chǎn)實時監(jiān)測中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]疫苗生產(chǎn)過程中菌液發(fā)酵過程的控制是疫苗生產(chǎn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。溫度、pH值、培養(yǎng)液的營養(yǎng)狀態(tài)等多種因素均影響菌液的發(fā)酵過程。因此建立簡便、快速、可靠的細(xì)菌活性檢測方法對疫苗生產(chǎn)的監(jiān)控具有實際意義。傳統(tǒng)的監(jiān)控疫苗生產(chǎn)的方法主要有培養(yǎng)計數(shù)法和比濁計數(shù)法，目前疫苗生產(chǎn)廠商對疫苗質(zhì)量的控制仍然依賴于這兩種方法。培養(yǎng)法靈敏度高但耗時長，通常需要24h以上才能獲得結(jié)果，不能達(dá)到即時控制菌液發(fā)酵過程的目的斗匕濁法操作簡單但采用肉眼觀察，檢測靈敏度差，且不能區(qū)分活菌和死菌。
[0003]因此，急需一種能實時監(jiān)控疫苗生產(chǎn)過程中活菌數(shù)目的方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種流式細(xì)胞術(shù)方法在疫苗生產(chǎn)實時監(jiān)測中的應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn):流式細(xì)胞術(shù)方法在疫苗生產(chǎn)實時監(jiān)測中的應(yīng)用，是將流式細(xì)胞術(shù)方法應(yīng)用于疫苗生產(chǎn)過程中，檢測疫苗生產(chǎn)過程中的活菌數(shù)；
[0006]所述的疫苗包括大腸桿菌疫苗、葡萄球菌疫苗、豬丹毒疫苗、鏈球菌疫苗、沙門氏菌疫苗、魏氏梭菌疫苗、雞毒支原體疫苗、多殺性巴氏桿菌疫苗和副豬嗜血桿菌疫苗等等。
[0007]所述的流式細(xì)胞術(shù)方法在疫苗生產(chǎn)實時監(jiān)測中的應(yīng)用，優(yōu)選包含如下步驟:
[0008](I)選擇如下所述的熒光染料中的至少兩種著染目標(biāo)菌；熒光染料為對活菌細(xì)胞能進(jìn)行染色的染料、對總菌數(shù)能進(jìn)行染色的染料和對死菌細(xì)胞能進(jìn)行染色的染料；
[0009](2)然后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)菌熒光信號的變化，通過測定細(xì)菌熒光信息的變化，得到FCM圖譜；FCM圖譜具有如下參數(shù)中的至少兩種:活菌數(shù)、死菌數(shù)和總菌數(shù)；依據(jù)FCM圖譜得到活菌數(shù)的比例；
[0010](3)通過絕對計數(shù)法得到目標(biāo)菌菌液的濃度；
[0011](4)依據(jù)步驟(2)得到的活菌數(shù)的比例和步驟(3)得到的目標(biāo)菌菌液的濃度，得到目標(biāo)菌的活菌量和死菌量。
[0012]步驟(I)優(yōu)選為:選擇如下所述的熒光染料著染目標(biāo)菌；熒光染料為對活菌細(xì)胞能進(jìn)行染色的染料和對總菌數(shù)能進(jìn)行染色的染料中的一種與對死菌細(xì)胞能進(jìn)行染色的染料形成的組合；
[0013]步驟(I)中所述的對活菌細(xì)胞能進(jìn)行染色的染料優(yōu)選為CFDA-SE ;熒光染料CFDA-SE可以進(jìn)入細(xì)胞膜，被菌體細(xì)胞內(nèi)的酯酶酶解后發(fā)出熒光，為膜滲透性染料；酶解后產(chǎn)物不能穿過細(xì)胞膜，染色為不可逆性，因此CFDA-SE只能染色活菌細(xì)胞；
[0014]步驟(I)中所述的對總菌數(shù)能進(jìn)行染色的染料優(yōu)選為SYBR Green I ；SYBR GreenI是一種結(jié)合于小溝中的雙鏈DNA結(jié)合染料，能與所有的雙鏈DNA相結(jié)合，與雙鏈DNA結(jié)合后，發(fā)出綠色熒光，且熒光大大增強(qiáng)；其最大吸收波長約為497nm，發(fā)射波長最大為520nm，SYBR Green I可染色所有活菌和死菌；
[0015]步驟(I)中所述的對死菌細(xì)胞能進(jìn)行染色的染料優(yōu)選為PI ;PI(碘化丙啶，Propidium 1dide)是一種可對DNA染色的細(xì)胞核染色試劑,PI為膜非滲透性染料,不能通過活細(xì)胞膜，但能穿過破損的細(xì)胞膜而對核染色，在嵌入雙鏈DNA后釋放紅色熒光；
[0016]步驟(3)中所述通過絕對計數(shù)法得到目標(biāo)菌菌液的濃度可通過血球計數(shù)板計數(shù)或通過流式細(xì)胞儀計數(shù)；
[0017]所述的通過流式細(xì)胞儀計數(shù)優(yōu)選為通過如下步驟實現(xiàn):將已知濃度的磁珠和所述的目標(biāo)菌菌液混合，通過流式細(xì)胞儀檢測，通過如下公式計算得到目標(biāo)菌菌液的濃度；
[0018]公式為:
[0019](菌細(xì)胞數(shù)/磁珠數(shù))X(每管內(nèi)總磁珠數(shù)/樣品總體積)X稀釋倍數(shù)=菌液濃度；
[0020]菌細(xì)胞數(shù)指一定時間內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測到的菌細(xì)胞數(shù)；磁珠數(shù)指一定時間內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測到的磁珠數(shù)；每管內(nèi)總磁珠數(shù)指樣品檢測管內(nèi)的磁珠總數(shù)；稀釋倍數(shù)指菌液的稀釋倍數(shù)。
[0021 ] 所述的磁珠的粒徑優(yōu)選為5.5 μ m ;
[0022]所述的流式細(xì)胞術(shù)方法在疫苗生產(chǎn)實時監(jiān)測中的應(yīng)用，更優(yōu)選包含如下步驟:
[0023]1、建立菌細(xì)胞的空白對照和熒光強(qiáng)度補(bǔ)償對照，確定流式細(xì)胞儀的操作參數(shù):
[0024]①將目標(biāo)菌活化，培養(yǎng)至對數(shù)生長期；將其中的一部分菌液滅活，滅活的菌液作為死菌對照；未經(jīng)處理的菌液，為活菌對照；
[0025]②用PBS將步驟①得到的兩種細(xì)胞分別洗滌，然后用PBS重懸至0D_為0.002?
0.006，得到死菌對照菌液和活菌對照菌液；
[0026]③得到菌細(xì)胞的空白對照和熒光強(qiáng)度補(bǔ)償對照:
[0027]A、將活菌對照菌液與死菌對照菌液混合得到的混合菌液上流式細(xì)胞儀，通過調(diào)整流式細(xì)胞儀的光電二級管電壓，以調(diào)節(jié)前向散射光FSC和側(cè)向散射光SSC的強(qiáng)度，以SSC/FSC設(shè)門，確定待檢菌細(xì)胞在流式細(xì)胞儀成像圖中的位置，用以消除待檢菌的自發(fā)熒光；
[0028]B、在活菌對照菌液中加入SYBR Green I或CFDA-SE單色熒光染料，振蕩混勻，避光反應(yīng)；然后上流式細(xì)胞儀檢測，以步驟A中設(shè)定的SSC/FSC門，調(diào)整SYBR Green I或CFDA-SE的PMT電壓進(jìn)行熒光補(bǔ)償，用于從被檢測的熒光信號中去除由于熒光素發(fā)射光譜重疊而引起的干擾熒光信號，同時可用于排除由于染料的質(zhì)量、濃度以及染色方法等因素對檢測結(jié)果的影響，得到SYBR Green I或CFDA-SE的補(bǔ)償對照圖，確定SYBR Green I或CFDA-SE熒光強(qiáng)度的電壓；在死菌對照菌液中加入PI單色熒光染料，振蕩混勻，避光反應(yīng)；然后上流式細(xì)胞儀檢測，以步驟A中設(shè)定的SSC/FSC門，調(diào)整PI的PMT電壓進(jìn)行熒光補(bǔ)償，得到PI補(bǔ)償對照圖，確定PI熒光強(qiáng)度的電壓；在活菌對照菌液與死菌對照菌液混合得到的混合菌液中加入SYBR Green I和CFDA-SE中的一種與PI組成的復(fù)合熒光染料，振蕩混勻，避光反應(yīng)；然后上流式細(xì)胞儀檢測，以步驟A中設(shè)定的SSC/FSC門，調(diào)整復(fù)合熒光染料的PMT電壓進(jìn)行雙色熒光補(bǔ)償，得到復(fù)合熒光染料補(bǔ)償對照圖，確定復(fù)合熒光染料熒光強(qiáng)度的電壓；
[0029]11、菌液發(fā)酵過程的監(jiān)測
[0030]①在疫苗生產(chǎn)的不同階段，取發(fā)酵菌液樣品；
[0031]②PBS洗滌發(fā)酵菌液樣品，然后用PBS重懸發(fā)酵菌至OD6tltlS 0.002?0.006 ;將得到的菌液標(biāo)記上兩種熒光染料，所使用的熒光染料和步驟I相同，使用的電壓為步驟I③B最終確定的電壓；流式細(xì)胞儀檢測，畫門分群后，得到各群比例；
[0032]③將已知濃度的磁珠和發(fā)酵菌液樣品混合，通過流式細(xì)胞儀檢測，通過如下公式計算得到發(fā)酵菌液的濃度；
[0033]公式為:
[0034](菌細(xì)胞數(shù)/磁珠數(shù))X(每管內(nèi)總磁珠數(shù)/樣品總體積)X稀釋倍數(shù)=菌液濃度；
[0035]④依據(jù)各群比例和發(fā)酵菌液的濃度，對發(fā)酵菌中的活菌和死菌進(jìn)行定量。
[0036]本發(fā)明中對菌的洗滌均為先將菌液離心，取沉淀，然后加入PBS重懸，離心，棄上清，即完成一次洗滌；
[0037]步驟I①中所述的滅活的步驟優(yōu)選為:將菌液離心，取沉淀；使用濃度為質(zhì)量體積比70%的乙醇溶液分散沉淀靜置至少I小時或加入PBS分散均勻后煮沸5?1min即可；
[0038]步驟I ②中所述的 PBS 為 ρΗ6.2 ?7.4,0.01 ?0.lmol/L 的 PBS ；
[0039]步驟I②中所述的洗滌的次數(shù)優(yōu)選為2次；
[0040]步驟I③中所述的SYBR Green I的用量優(yōu)選按在菌液中的終濃度為0.1?20 μ M計算;
[0041]步驟I③中所述的CFDA-SE的用量優(yōu)選按在菌液中的終濃度為0.1?20 μ M計算；
[0042]步驟I③中所述的PI的用量優(yōu)選按在菌液中的終濃度為0.1?10 μ g.ml/1計算；
[0043]步驟I③中所述的避光反應(yīng)的時間為至少5min ;優(yōu)選如下:當(dāng)所使用的染料為SYBR Green I或CFDA-SE時，避光反應(yīng)的時間為1min ;當(dāng)所使用的染料為PI時，避光反應(yīng)的時間為5min ；
[0044]所述的避光反應(yīng)的溫度優(yōu)選為20?30°C ；
[0045]步驟I③中所述的補(bǔ)償對照圖在制作時，優(yōu)選先單染菌細(xì)胞，再雙染菌細(xì)胞；
[0046]步驟II①中所述的發(fā)酵菌液樣品的體積優(yōu)選為0.2mL?ImL ；
[0047]步驟II③中所述的磁珠的粒徑優(yōu)選為5.5 μ m。
[0048]本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果:
[0049](I)本發(fā)明為疫苗生產(chǎn)過程提供一種簡便、快速、可靠的細(xì)菌活性監(jiān)測方法。
[0050](2)本發(fā)明簡便易行，操作時間僅需30min，遠(yuǎn)少于傳統(tǒng)的培養(yǎng)法。可對細(xì)菌進(jìn)行逐個檢測，無需大量繁殖，即可在短時間內(nèi)精確檢測大量細(xì)菌，故對生長周期長的細(xì)菌，該方法具有更為顯著地優(yōu)越性。
[0051](3)本發(fā)明能精確控制疫苗生產(chǎn)過程的質(zhì)量。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0052]圖1是雞毒支原體的SYBR Green I和PI染色的散點(diǎn)圖，其中:圖A、B和E為活菌細(xì)胞；圖C、D和F為死菌細(xì)胞；圖G為活菌和死菌混合菌液；圖H為菌液未染色空白對照；當(dāng)雙重染色時，Q2區(qū)為死菌細(xì)胞區(qū)，Q3為活菌細(xì)胞區(qū)；當(dāng)單染PI時，Ql區(qū)為死菌細(xì)胞區(qū)；當(dāng)單染SYBR Green I時，死菌細(xì)胞和活菌細(xì)胞均顯示為陽性，為Q3區(qū)。
[0053]圖2是流式細(xì)胞術(shù)方法監(jiān)測雞毒支原體疫苗生產(chǎn)菌液發(fā)酵過程的散點(diǎn)圖。
[0054]圖3是雞毒支原體菌細(xì)胞絕對計數(shù)散點(diǎn)圖，其中:P1區(qū)為菌細(xì)胞區(qū)，P2區(qū)為磁珠區(qū)。
[0055]圖4是魏氏梭菌活菌細(xì)胞和死菌細(xì)胞CFDA-SE和PI染色對照的散點(diǎn)圖，其中:圖A、B和E為活菌細(xì)胞；圖C、D和F為死菌細(xì)胞；圖G為活菌和死菌混合菌液；圖H為菌液未染色空白對照；Q3區(qū)為活菌細(xì)胞區(qū)，Ql為死菌細(xì)胞區(qū)。
[0056]圖5是流式細(xì)胞術(shù)方法監(jiān)測魏氏梭菌疫苗生產(chǎn)菌液發(fā)酵過程的散點(diǎn)圖。
[0057]圖6是魏氏梭菌菌細(xì)胞絕對計數(shù)散點(diǎn)圖，其中:P1區(qū)為菌細(xì)胞區(qū)，P2區(qū)為磁珠區(qū)。

【具體實施方式】
[0058]下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
[0059]實施例1
[0060](I)建立雞毒支原體菌細(xì)胞的空白對照和熒光強(qiáng)度補(bǔ)償對照
[0061]①將雞毒支原體F-36株(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)經(jīng)改良Frey氏培養(yǎng)基活化，37°C培養(yǎng)80h以上，接種搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基(改良Frey氏培養(yǎng)基)，37°C培養(yǎng)至細(xì)菌生長對數(shù)期，取2管發(fā)酵液，各ImL ;將發(fā)酵液離心(9000rpm離心1min)，棄上清，得到菌細(xì)胞。在其中一管菌細(xì)胞中加入ImL質(zhì)量體積比70%的乙醇溶液，混勻后放置I小時，或加入ImL PBS,煮沸l(wèi)Omin，目的是為了滅活，得到死菌對照；同時將另一管未經(jīng)處理的菌細(xì)胞作為活菌對照。
[0062]②用PBS (pH7.4,0.0lmol/L)將步驟①的兩種細(xì)胞分別洗滌2次，然后用PBS分別重懸至OD600為0.002。
[0063]A、用活菌對照和死菌對照按體積比1:1混合得到混合菌液，作為空白對照。通過調(diào)整流式細(xì)胞儀的光電二級管電壓，以調(diào)節(jié)前向散射光FSC和側(cè)向散射光SSC的強(qiáng)度，以SSC/FSC設(shè)門，確定待檢菌細(xì)胞在流式細(xì)胞儀成像圖中的位置，用以消除待檢菌的自發(fā)熒光，得到FSC和SSC的工作電壓是412伏和363伏，結(jié)果如圖1中H所示；
[0064]B,SYBR Green I單染，作為補(bǔ)償對照。步驟為:在菌液(即OD6tltl為0.002的菌液)中加入SYBR Green I染色液，SYBR Green I染色液的終濃度為0.1 μ Μ，振蕩混勻，室溫避光反應(yīng)lOmin，然后上流式細(xì)胞儀檢測，以步驟A中設(shè)定的SSC/FSC設(shè)門，調(diào)整SYBR Green I的PMT電壓進(jìn)行熒光補(bǔ)償，用于從被檢測的熒光信號中去除由于熒光素發(fā)射光譜重疊而引起的干擾熒光信號，同時可用于排除由于染料的質(zhì)量，濃度以及染色方法等因素對檢測結(jié)果的影響，得到SYBR Green I補(bǔ)償對照圖，確定SYBR Green I熒光強(qiáng)度的電壓是414伏，結(jié)果如圖1中的A(活菌對照)和C(死菌對照)所示；
[0065]C、PI單染，作為補(bǔ)償對照。步驟為:在菌液中加入PI染色液，PI染色液的終濃度為0.1 μ g.mL—1，振蕩混勻，室溫避光反應(yīng)5min ;然后上流式細(xì)胞儀檢測，以步驟A中設(shè)定的SSC/FSC設(shè)門，調(diào)整PI的PMT電壓進(jìn)行熒光補(bǔ)償，得到PI補(bǔ)償對照圖，確定PI熒光強(qiáng)度的電壓是533伏，結(jié)果如圖1中的B(活菌對照)和D(死菌對照)所示；
[0066]D、SYBR Green I和PI雙染，作為補(bǔ)償對照。步驟為:在菌液中加入PI染色液和SYBR Green I染色液，SYBR Green I染色液的終濃度為0.1 μ M，PI染色液的終濃度為
0.1 μ g.mL—1，振蕩混勻，室溫避光反應(yīng)1min ;然后上流式細(xì)胞儀檢測，以步驟A中設(shè)定的FSC/SSC設(shè)門，調(diào)整SYBR Green I和PI的PMT電壓進(jìn)行雙色熒光補(bǔ)償，得到SYBR Green I和PI補(bǔ)償對照圖，確定SYBR Green I和PI熒光強(qiáng)度的電壓是414和533伏，結(jié)果如圖1中的E (活菌對照)、F (死菌對照)和G (活菌對照和死菌對照按體積比1:1混合得到的混合菌液)所示。
[0067]設(shè)定雞毒支原體菌細(xì)胞的空白對照和熒光強(qiáng)度補(bǔ)償對照，以此作為排除自發(fā)熒光的影響，同時用于設(shè)置和調(diào)整電壓，及去除由于熒光素發(fā)射光譜重疊而引起的干擾熒光信號等。流式細(xì)胞儀檢測時，每個菌細(xì)胞由四種參數(shù)定義:兩個非熒光信號和兩個熒光信號。其中兩個非熒光信號分別是側(cè)向散射光信號(用于測量細(xì)胞顆粒度)和前向散射光信號(用于測量細(xì)胞大小)，二者的結(jié)合可用于從混合細(xì)胞群中分辨出不同的細(xì)胞群。兩個熒光信號分別是SYBR Green I和PI紅色熒光染料接收激光的能量被激發(fā)而發(fā)射的光信號；SYBR Green I的激發(fā)波長為488nm，發(fā)射波長為525nm，作為綠色熒光而被檢測。PI的激發(fā)波長為488nm,發(fā)射波長為625nm,作為紅色突光而被檢測。
[0068](2)取雞毒支原體F-36株疫苗生產(chǎn)過程中不同階段的發(fā)酵液各2管、每管lmL(9000rpm離心1min)，一管用于流式細(xì)胞儀檢測，一管使用傳統(tǒng)培養(yǎng)法進(jìn)行培養(yǎng)。
[0069](3)流式細(xì)胞儀檢測:
[0070]①PBS洗滌2次后，重懸細(xì)胞濃度為OD6tltl = 0.002，用SYBR Green I和PI雙重染色(操作過程同步驟(I)②D)，操作參數(shù):FSC的電壓值是412伏，SSC的電壓值是363伏，SYBR Green I和PI的電壓值是414伏和533伏，流式細(xì)胞儀檢測(如圖2所示)，畫門分群后，得到各群比例。
[0071]②將已知濃度的磁珠(粒徑為5.5 μ m)與菌液混合后，通過流式細(xì)胞儀檢測(如圖3所示)，通過如下公式計算得到發(fā)酵液的濃度；
[0072](菌細(xì)胞數(shù)/磁珠數(shù))X(每管內(nèi)總磁珠數(shù)/樣品總體積)X稀釋倍數(shù)=菌液濃度；
[0073]菌細(xì)胞數(shù)指一定時間內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測到的菌細(xì)胞數(shù)；磁珠數(shù)指一定時間內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測到的磁珠數(shù)；每管內(nèi)總磁珠數(shù)指樣品檢測管內(nèi)的磁珠總數(shù)；稀釋倍數(shù)指菌液的稀釋倍數(shù)。例磁珠總數(shù)為54829，用20 μ L PBS充分溶解，加入480 μ L菌液，混勻后，上流式細(xì)胞儀檢測，磁珠數(shù)為1000，菌細(xì)胞數(shù)2261，則菌液濃度為(2261/1000) *(54829/(500*0.001)) *(500/480) = = 2.5*105ccu (顏色變化單位).mL'
[0074]③SYBR Green I染色得到總菌量，PI染色得到死菌量。通過步驟①得到的各群比例和步驟②得到的發(fā)酵液濃度，可得到死菌數(shù)，從而計算得到活菌數(shù)，得到定量結(jié)果。計算公式是:死菌比例X濃度=死菌數(shù)；活菌比例X濃度=活菌數(shù)。
[0075](4)傳統(tǒng)平板計數(shù)方法:將步驟(2)中取出的I管發(fā)酵液做10倍梯度稀釋至10_6，分別將10_4、10_5、10_6三個梯度的菌液涂改良Frey氏培養(yǎng)基平板，每個梯度涂3個平板，置37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-7天后，計數(shù)平板，求平均值，得到活菌濃度為3 X 15ccu -πιΓ1,與流式細(xì)胞術(shù)方法結(jié)果一致，但耗時長3-7天左右，不能用于疫苗生產(chǎn)的實時監(jiān)控。傳統(tǒng)比濁法:將步驟(2)中菌液作10倍梯度稀釋后，與麥?zhǔn)媳葷峁鼙容^，通過肉眼觀察得到菌液濃度的數(shù)量級為15?16CCU 操作較快，但不能區(qū)分活菌和死菌，而且通過肉眼觀察，不能得到客觀、準(zhǔn)確的實驗結(jié)果，因而導(dǎo)致疫苗質(zhì)量的不穩(wěn)定性。
[0076]本發(fā)明提供的流式細(xì)胞術(shù)方法，操作時間在30分鐘以內(nèi)，而且數(shù)據(jù)準(zhǔn)確客觀，操作性強(qiáng)，可有效克服目前疫苗生產(chǎn)過程中的弊端。
[0077]實施例2
[0078](I)建立魏氏梭菌菌細(xì)胞的熒光強(qiáng)度空白對照和補(bǔ)償對照
[0079]①將魏氏梭菌(ATCC13124,購自American type culture collect1n 菌種庫)，接種種子培養(yǎng)基液體硫乙醇酸鹽(FT)培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)24h活化，接種搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基(FT培養(yǎng)基)，37°C培養(yǎng)24h至細(xì)菌生長對數(shù)期，取2管發(fā)酵液，各ImL ;將發(fā)酵液離心(5000rpm離心lOmin)，棄上清，得到菌細(xì)胞。在其中一管菌細(xì)胞中加入ImL PBS (pH6.2、0.01mol/L)，煮沸5min，目的是為了滅活，得到死菌對照；同時將另一管未經(jīng)處理的菌細(xì)胞作為活菌對照。
[0080]②用PBS將步驟①的兩種細(xì)胞分別洗滌2次，然后用PBS重懸至0D_為0.004。
[0081]A、用活菌對照和死菌對照按體積比1:1混合得到混合菌液，作為空白對照。通過調(diào)整流式細(xì)胞儀的光電二級管電壓，以調(diào)節(jié)前向散射光FSC和側(cè)向散射光SSC的強(qiáng)度，以SSC/FSC設(shè)門，確定待檢菌細(xì)胞在流式細(xì)胞儀成像圖中的位置，用以消除待檢菌的自發(fā)熒光，得到FSC和SSC的工作電壓是476伏和500伏，結(jié)果如圖4中H所示；
[0082]B,CFDA-SE單染，作為補(bǔ)償對照。步驟為:在菌液中加入CFDA-SE染色液，CFDA-SE染色液的終濃度為0.1 μ M，振蕩混勻，室溫避光反應(yīng)lOmin，然后上流式細(xì)胞儀檢測，以步驟A中設(shè)定的SSC/FSC設(shè)門，調(diào)整CFDA-SE的PMT電壓進(jìn)行熒光補(bǔ)償，用于從被檢測的熒光信號中去除由于熒光素發(fā)射光譜重疊而引起的干擾熒光信號，同時可用于排除由于染料的質(zhì)量，濃度以及染色方法等因素對檢測結(jié)果的影響，得到CFDA-SE補(bǔ)償對照圖，確定CFDA熒光強(qiáng)度的電壓是450伏，結(jié)果如圖4中的A(活菌對照)和C(死菌對照)所示；
[0083]C、PI單染，作為補(bǔ)償對照。步驟為:在菌液中加入PI染色液，PI染色液的終濃度為0.1 μ g.mL—1，振蕩混勻，室溫避光反應(yīng)5min ;然后上流式細(xì)胞儀檢測，以步驟A中設(shè)定的SSC/FSC設(shè)門，調(diào)整PI的PMT電壓進(jìn)行熒光補(bǔ)償，得到PI補(bǔ)償對照圖，確定PI熒光強(qiáng)度的電壓是545伏，結(jié)果如圖4中的B(活菌對照)和D(死菌對照)所示；
[0084]D、CFDA-SE和PI雙染，作為補(bǔ)償對照。步驟為:在菌液中加入PI染色液和CFDA染色液，CFDA染色液的終濃度為0.1 μ M，PI染色液的終濃度為0.1 μ g.πι?Λ振蕩混勻，室溫避光反應(yīng)1min ;然后上流式細(xì)胞儀檢測，以A步驟中設(shè)定的FSC/SSC設(shè)門，調(diào)整CFDA-SE和PI的PMT電壓進(jìn)行雙色熒光補(bǔ)償，得到CFDA-SE和PI補(bǔ)償對照圖，確定CFDA-SE和PI熒光強(qiáng)度的電壓是450和545伏，結(jié)果如圖4中的E(活菌對照)、F(死菌對照)和G(活菌對照和死菌對照按體積比1:1混合得到的混合菌液)所示。
[0085]設(shè)定魏氏梭菌菌細(xì)胞的空白對照和熒光強(qiáng)度補(bǔ)償對照，以此作為排除自發(fā)熒光的影響，同時用于設(shè)置和調(diào)整電壓，及去除由于熒光素發(fā)射光譜重疊而引起的干擾熒光信號等。流式細(xì)胞儀檢測時，每個菌細(xì)胞由四種參數(shù)定義:兩個非熒光信號和兩個熒光信號。其中兩個非熒光信號分別是側(cè)向散射光信號(用于測量細(xì)胞顆粒度)和前向散射光信號(用于測量細(xì)胞大小)，二者的結(jié)合可用于從混合細(xì)胞群中分辨出不同的細(xì)胞群。兩個熒光信號分別是CFDA-SE和PI紅色熒光染料接收激光的能量被激發(fā)而發(fā)射的光信號；CFDA-SE的激發(fā)波長為488nm,發(fā)射波長為525nm,作為綠色突光而被檢測。PI的激發(fā)波長為488nm,發(fā)射波長為625nm,作為紅色熒光而被檢測。
[0086](2)取魏氏梭菌疫苗生產(chǎn)過程中不同階段的發(fā)酵液各2管、每管lmL，一管用于流式細(xì)胞儀檢測，一管使用傳統(tǒng)培養(yǎng)法進(jìn)行培養(yǎng)。
[0087](3)流式細(xì)胞儀檢測:
[0088]①PBS洗滌2次后，重懸細(xì)胞濃度為OD6tltl = 0.004，用CFDA-SE和PI雙重染色(操作過程同步驟(I)②D)，操作參數(shù)是FSC的電壓值是476伏，SSC的電壓值是500伏，CFDA-SE和PI的電壓值是450伏和545伏，流式細(xì)胞儀檢測，畫門分群后，得到各群比例(如圖5所示)。
[0089]②將已知濃度的磁珠(粒徑為5.5μπι)與菌液混合后，通過流式細(xì)胞儀檢測，通過實施例1提供的公式計算得到發(fā)酵液的濃度(如圖6所示)；
[0090]③CFDA-SE染色得到活菌量，PI染色得到死菌量。通過步驟①得到的各群比例和步驟②得到的菌液濃度，可得到活菌數(shù)和死菌數(shù)，得到定量結(jié)果。技術(shù)公式是:活菌比例*濃度=活菌數(shù)。
[0091](4)傳統(tǒng)平板計數(shù)方法:將步驟(2)中取出的I管發(fā)酵液做10倍梯度稀釋至10_6，分別將10_4、10_5、10_6三個梯度的菌液涂FT營養(yǎng)瓊脂平板，每個梯度涂3板，(36 + 1) V厭氧培養(yǎng)24小時，計數(shù)平板，求平均值得到活菌濃度為3 X 15CCU -mL-1,與流式細(xì)胞術(shù)方法結(jié)果一致，操作繁瑣，耗時長。傳統(tǒng)比濁法:將步驟(2)中的發(fā)酵液作10倍梯度稀釋后，與麥?zhǔn)媳葷峁鼙容^，通過肉眼觀察得到菌液濃度的數(shù)量級為15?16ccu 操作較快，但不能區(qū)分活菌和死菌，而且通過肉眼觀察，不能得到客觀、準(zhǔn)確的實驗結(jié)果，因而導(dǎo)致疫苗質(zhì)量的不穩(wěn)定性。
[0092]本發(fā)明提供的流式細(xì)胞術(shù)方法，操作時間在30分鐘以內(nèi)，而且數(shù)據(jù)準(zhǔn)確客觀，操作性強(qiáng)，可有效克服目前疫苗生產(chǎn)過程中的弊端。
[0093]上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.流式細(xì)胞術(shù)方法在疫苗生產(chǎn)實時監(jiān)測中的應(yīng)用，其特征在于:是將流式細(xì)胞術(shù)方法應(yīng)用于疫苗生產(chǎn)過程中，檢測疫苗生產(chǎn)過程中的活菌數(shù)； 所述的疫苗包括大腸桿菌疫苗、葡萄球菌疫苗、豬丹毒疫苗、鏈球菌疫苗、沙門氏菌疫苗、魏氏梭菌疫苗、雞毒支原體疫苗、多殺性巴氏桿菌疫苗和副豬嗜血桿菌疫苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述流式細(xì)胞術(shù)方法在疫苗生產(chǎn)實時監(jiān)測中的應(yīng)用，其特征在于包含如下步驟: (1)選擇如下所述的熒光染料中的至少兩種著染目標(biāo)菌；熒光染料為對活菌細(xì)胞能進(jìn)行染色的染料、對總菌數(shù)能進(jìn)行染色的染料和對死菌細(xì)胞能進(jìn)行染色的染料； (2)然后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)菌熒光信號的變化，通過測定細(xì)菌熒光信息的變化，得到FCM圖譜；FCM圖譜具有如下參數(shù)中的至少兩種:活菌數(shù)、死菌數(shù)和總菌數(shù)；依據(jù)FCM圖譜得到活菌數(shù)的比例； (3)通過絕對計數(shù)法得到目標(biāo)菌菌液的濃度； (4)依據(jù)步驟(2)得到的活菌數(shù)的比例和步驟(3)得到的目標(biāo)菌菌液的濃度，得到目標(biāo)菌的活菌量和死菌量。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述流式細(xì)胞術(shù)方法在疫苗生產(chǎn)實時監(jiān)測中的應(yīng)用，其特征在于:步驟(I)為:選擇如下所述的熒光染料著染目標(biāo)菌；熒光染料為對活菌細(xì)胞能進(jìn)行染色的染料和對總菌數(shù)能進(jìn)行染色的染料中的一種與對死菌細(xì)胞能進(jìn)行染色的染料形成的組合。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述流式細(xì)胞術(shù)方法在疫苗生產(chǎn)實時監(jiān)測中的應(yīng)用，其特征在于: 步驟(I)中所述的對活菌細(xì)胞能進(jìn)行染色的染料為CFDA-SE ；； 步驟(I)中所述的對總菌數(shù)能進(jìn)行染色的染料為SYBR Green I ； 步驟(I)中所述的對死菌細(xì)胞能進(jìn)行染色的染料為PI。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述流式細(xì)胞術(shù)方法在疫苗生產(chǎn)實時監(jiān)測中的應(yīng)用，其特征在于:步驟(3)中所述通過絕對計數(shù)法得到目標(biāo)菌菌液的濃度通過血球計數(shù)板計數(shù)或通過流式細(xì)胞儀計數(shù)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述流式細(xì)胞術(shù)方法在疫苗生產(chǎn)實時監(jiān)測中的應(yīng)用，其特征在于:所述的通過流式細(xì)胞儀計數(shù)為通過如下步驟實現(xiàn):將已知濃度的磁珠和所述的目標(biāo)菌菌液混合，通過流式細(xì)胞儀檢測，通過如下公式計算得到目標(biāo)菌菌液的濃度； 公式為: (菌細(xì)胞數(shù)/磁珠數(shù))*(每管內(nèi)總磁珠數(shù)/樣品總體積)*稀釋倍數(shù)=菌液濃度； 菌細(xì)胞數(shù)指一定時間內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測到的菌細(xì)胞數(shù)；磁珠數(shù)指一定時間內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測到的磁珠數(shù)；每管內(nèi)總磁珠數(shù)指樣品檢測管內(nèi)的磁珠總數(shù)；稀釋倍數(shù)指菌液的稀釋倍數(shù)。
7.根據(jù)權(quán)利要求2、3、5和6中任一項所述流式細(xì)胞術(shù)方法在疫苗生產(chǎn)實時監(jiān)測中的應(yīng)用，其特征在于包含如下步驟: 1、建立菌細(xì)胞的空白對照和熒光強(qiáng)度補(bǔ)償對照，確定流式細(xì)胞儀的操作參數(shù): ①將目標(biāo)菌活化，培養(yǎng)至對數(shù)生長期；將其中的一部分菌液滅活，滅活的菌液作為死菌對照；未經(jīng)處理的菌液，為活菌對照； ②用PBS將步驟①得到的兩種細(xì)胞分別洗滌，然后用PBS重懸至0D_為0.002?0.006，得到死菌對照菌液和活菌對照菌液； ③得到菌細(xì)胞的空白對照和熒光強(qiáng)度補(bǔ)償對照: A、將活菌對照菌液與死菌對照菌液混合得到的混合菌液上流式細(xì)胞儀，通過調(diào)整流式細(xì)胞儀的光電二級管電壓，以調(diào)節(jié)前向散射光FSC和側(cè)向散射光SSC的強(qiáng)度，以SSC/FSC設(shè)門，確定待檢菌細(xì)胞在流式細(xì)胞儀成像圖中的位置，用以消除待檢菌的自發(fā)熒光； B、在活菌對照菌液中加入SYBRGreen I或CFDA-SE單色熒光染料，振蕩混勻，避光反應(yīng)；然后上流式細(xì)胞儀檢測，以步驟A中設(shè)定的SSC/FSC門，調(diào)整SYBR Green I或CFDA-SE的PMT電壓進(jìn)行熒光補(bǔ)償，用于從被檢測的熒光信號中去除由于熒光素發(fā)射光譜重疊而引起的干擾熒光信號，同時用于排除染料的質(zhì)量、濃度以及染色方法對檢測結(jié)果的影響，得到SYBR Green I或CFDA-SE的補(bǔ)償對照圖，確定SYBR Green I或CFDA-SE熒光強(qiáng)度的電壓；在死菌對照菌液中加入PI單色熒光染料，振蕩混勻，避光反應(yīng)；然后上流式細(xì)胞儀檢測，以步驟A中設(shè)定的SSC/FSC門，調(diào)整PI的PMT電壓進(jìn)行熒光補(bǔ)償，得到PI補(bǔ)償對照圖，確定PI熒光強(qiáng)度的電壓；在活菌對照菌液與死菌對照菌液混合得到的混合菌液中加入SYBR GreenI和CFDA-SE中的一種與PI組成的復(fù)合熒光染料，振蕩混勻，避光反應(yīng)；然后上流式細(xì)胞儀檢測，以步驟A中設(shè)定的SSC/FSC門，調(diào)整復(fù)合熒光染料的PMT電壓進(jìn)行雙色熒光補(bǔ)償，得到復(fù)合熒光染料補(bǔ)償對照圖，確定復(fù)合熒光染料熒光強(qiáng)度的電壓； I1、菌液發(fā)酵過程的監(jiān)測 ①在疫苗生產(chǎn)的不同階段，取發(fā)酵菌液樣品； ②PBS洗滌發(fā)酵菌液樣品，然后用PBS重懸發(fā)酵菌至OD_為0.002?0.006 ;將得到的菌液標(biāo)記上兩種熒光染料，所使用的熒光染料和步驟I相同，使用的電壓為步驟I③B最終確定的電壓；流式細(xì)胞儀檢測，畫門分群后，得到各群比例； ③將已知濃度的磁珠和發(fā)酵菌液樣品混合，通過流式細(xì)胞儀檢測，通過如下公式計算得到發(fā)酵菌液的濃度； 公式為: (菌細(xì)胞數(shù)/磁珠數(shù))*(每管內(nèi)總磁珠數(shù)/樣品總體積)*稀釋倍數(shù)=菌液濃度； ④依據(jù)各群比例和發(fā)酵菌液的濃度，對發(fā)酵菌中的活菌和死菌進(jìn)行定量。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述流式細(xì)胞術(shù)方法在疫苗生產(chǎn)實時監(jiān)測中的應(yīng)用，其特征在于: 步驟I①中所述的滅活的步驟為:將菌液離心，取沉淀；使用濃度為質(zhì)量體積比70%的乙醇溶液分散沉淀靜置至少I小時或加入PBS分散均勻后煮沸5?1min ； 步驟I②中所述的PBS為ρΗ6.2?7.4,0.01?0.lmol/L的PBS ； 步驟I③中所述的避光反應(yīng)的時間為至少5min ； 步驟II③中所述的磁珠的粒徑為5.5 μ m。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述流式細(xì)胞術(shù)方法在疫苗生產(chǎn)實時監(jiān)測中的應(yīng)用，其特征在于: 步驟I③中所述的SYBR Green I的用量按在菌液中的終濃度為0.1?20 μ M計算； 步驟I③中所述的CFDA-SE的用量按在菌液中的終濃度為0.1?20 μ M計算； 步驟I③中所述的PI的用量按在菌液中的終濃度為0.1?10 μ g.πιΓ1計算。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述流式細(xì)胞術(shù)方法在疫苗生產(chǎn)實時監(jiān)測中的應(yīng)用，其特征在于: 所述的SYBR Green I的避光反應(yīng)時間為1min ； 所述的CFDA-SE的避光反應(yīng)時間為1min ；
所述的PI的避光反應(yīng)的時間為5min。
【文檔編號】G01N15/14GK104198357SQ201410493364
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年9月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月24日
【發(fā)明者】孫俊穎, 劉志成, 郭鵬舉 申請人:廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物衛(wèi)生研究所