專利名稱：檢測青蟹雙順反子病毒-1實時熒光定量rt-pcr的方法及其引物組、探針和試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測青蟹雙順反子病毒-1實時熒光定量RT-PCR的方法及其引物組、探針和試劑盒。
背景技術：
擬穴青蟹(Scylla paramamosain)(原被鑒定為擬穴青蟹(Scylla serrata)因肉質鮮美、生長迅速、分布廣泛，是我國海洋漁業重要的養殖品種。但隨著養殖規模的逐步擴大，病害問題也不斷嚴重。青蟹雙順反子病毒_1 (Mud Crab Dicistrovirus-l,MCDV_l)是在近幾年發病的青蟹中新發現的一種病原體。感染MCDV-1的擬穴青蟹體色沒有明顯變化，食欲不振，活動乏力，即使白天也不會潛入沙中，人工感染死亡率達100%。該病毒屬于單正鏈RNA，雙順反子病毒科，能通過浸泡、禁食浸泡、投喂、共居的方式感染擬穴青蟹。到目前為止，對于MCDV-1感染還沒有有效的治療方法，杜絕傳染源、防止病毒的傳染和流行是能夠采取的主要措施，早期快速診斷青蟹雙順反子病毒-1是減少損失的有效途徑。因此，簡便快速、特異性好、靈敏度高的診斷試劑盒及其檢測方法對于疾病的預防具有重要意義。實時突光定量Real time-PCR(Real time fluorescent quantitativepolymerase chain reaction, Rea-1 time PCR),是指預先在 RT-PCR 反應體系中加入突光基團，可以是熒光染料，也可以是特異性標記的熒光探針，利用相應軟件實時監測整個PCR進程中的熒光信號積累情況，最后通過建立標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。其中Taqman探針技術是以Taqman突光探針為基礎，Taqman突光探針為一寡核苷酸,兩端分別標記一個熒光發射基團和一個熒光淬滅基團。探針完整時，發射基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5' -3'外切酶活性將探針酶切降解，使熒光發射基團和熒光淬滅基團分離，熒光監測系統從而可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與RT-PCR產物形成完全同步，從而實現定量。實時熒光定量RT-PCR方法實時檢測、速度快、高通量、定量準確、靈敏度高、特異性好、自動化程度高，在病原微生物檢測方面已得到廣泛應用。該技術應用于病毒檢測中，不僅可以對病毒定性，還能準確定量病毒核酸，使研究病毒載量的變化規律成為可能，并可對抗病毒治療和藥物篩選做出評估，為相關研究工作提供了有效的技術平臺。目前尚無青蟹雙順反子病毒-1熒光定量PCR用于檢測的相關報道。
發明內容
本發明所要解決的第一個技術問題是提供一種青蟹雙順反子病毒-1檢測用引物組和Taqman探針，該引物組和探針對青蟹雙順反子病毒-1具有高特異性，可用于實時熒光定量RT-PCR技術檢測青蟹雙順反子病毒-1。本發明所要解 決的第二個技術問題是提供一種對青蟹雙順反子病毒-1進行實時熒光定量RT-PCR檢測的方法，該方法快速、高效，特異性高。
本發明所要解決的第三個技術問題是提供一種對青蟹雙順反子病毒-1進行實時熒光定量RT-PCR檢測的試劑盒。本發明所要解決的第四個技術問題是提供上述青蟹雙順反子病毒-1檢測用引物組和Taqman探針在檢測青蟹雙順反子病毒_1中應用。本發明所要解決的第五個技術問題是提供上述對青蟹雙順反子病毒-1進行實時熒光定量RT-PCR檢測的試劑盒在檢測青蟹雙順反子病毒-1中的應用。本發明所要解決的第一個技術問題是通過如下技術方案來實現的:一種青蟹雙順反子病毒-1檢測用引物組和Taqman探針，所述引物組由上游引物和下游引物組成，所述的上游引物的喊基序列如序列表中SEQ ID N0.1所不，所述的下游引物的喊基序列如序列表中SEQ ID N0.2所示,所述的Taqman探針的堿基序列如序列表中SEQ ID N0.3所示,在所述的Taqman探針的5'端標記有FAM為熒光發射基團，3'端標記有TAMRA熒光淬滅基團，所述的Taqman探針位于所述上游引物和下游引物之間。本發明所要解決的第二個技術問題是通過如下技術方案來實現的:一種檢測青蟹雙順反子病毒-1實時熒光定量RT-PCR的方法，利用上述的引物組和Taqman探針通過熒光定量RT-PCR反應對青蟹雙順反子病毒-1進行定性和定量檢測。該方法具體包括以下步驟:一種對青蟹雙順反子病毒-1進行實時熒光定量RT-PCR檢測的方法，包括待測病毒RNA的提取及其cDNA的合成，在Taqman熒光定量RT-PCR反應體系進行Taqman突光定量RT-PCR反應，通過標準品的制備及標準曲線的建立,計算得出待測結果，Taqman熒光定量RT-PCR反應體系中含有上述引物組和Taqman探針，可以通過熒光定量RT-PCR反應對青蟹雙順反子病毒-1進行定性和定量檢測。作為本發明的一種具體實施方式
，本發明所述引物組中上游引物和下游引物的摩爾濃度優選為0.4 μ mol/L , Taqman探針的摩爾濃度優選為0.2 μ mol/L。本發明對青蟹雙順反子病毒-1進行實時熒光定量RT-PCR檢測的方法，具體含以下步驟:(I)選擇MCDV-1基因的一段100 200bp長度的保守片段，利用primerpremier5.0軟件設計病毒特異性定量PCR引物對和探針，擴增片段大小為119bp，引物對和探針序列為:上游引物Dic-taqF:5' -ACGAAGAATCTATCACTGGAATTGAA-3'；下游引物Dic-taqR:5' -CGTCTGCTTCCCGGGTTT-3'；Taqman 探針:5' -FAM-AATGCTCTGAACCGGAGTACGTCTGCC-TAMRA-3'，其中 FAM 為熒光發射基團，TAMRA為熒光淬滅基團。(2)構建和制備重組質粒標準品pMD 18-T-dic以上、下游引物進行常規PCR獲得目的片段，利用DNA重組技術將包含目的片段的基因克隆到質粒載體pMD 18-T中，構建重組質粒pMD β 18-T-dic作為建立熒光定量PCR標準曲線的陽性標準品。(3)待測樣本總RNA的提取和逆轉錄反應，獲得樣本cDNA。(4) MCDV-1熒光定量PCR檢測方法的優化和建立經過對反應條件的優化，對建立的方法進行靈敏度、穩定性、特異性以及對臨床標本的有效性進行綜合評價。
本發明所要解決的第三個技術問題是通過如下技術方案來實現的:一種對青蟹雙順反子病毒-1進行實時熒光定量RT-PCR檢測的試劑盒，含有上述的Taqman探針和引物組。作為本發明的一種具體實施方式
，本發明上述試劑盒中還可以含有熒光定量Realtime-PCR探針法反應預混液、陽性標準品(即含有目的片段基因的質粒)和無RNase水等。其中熒光定量PCR探針法反應預混液優選為iQTM Supermix(2x)，購自美國BIO-RAD公司，iQTM Supermix配方如下:2X反應緩沖液(含dNTPs)、iTaq DNA聚合酶、6mM MgCl2和穩定齊U，陽性標準品的質粒濃度優選為IO8Copies/ μ L。該試劑盒在使用時，先提取待測樣品RNA反轉錄得到cDNA，然后用上述青蟹雙順反子病毒-1檢測用引物組和探針進行熒光定量PCR反應，反應結果判定:I)若Ct值>35，且未出現標準擴增曲線，試驗結果判斷為陰性；2)若Ct值在15 35之間且出現標準擴增曲線，試驗結果判斷為陽性；3)結果為陽性的樣品，根據Ct值帶入已建立的標準曲線，可計算出病毒拷貝數。因為本發明的青蟹雙順反子病毒-1為RNA病毒，所以在試劑盒的制備時，配置有核酸提取和逆轉錄(RT)的試劑，會更加方便試驗進展，如Trizol (總RNA提取試劑)、氯仿(可自備)、異丙醇(可自備)、體積百分含量為75%的乙醇(可自備)、無RNase水、RT反應液和逆轉錄酶等，其中，RT反應液優選含有IX反應緩沖液、0.5mM dNTPs、20mg/L隨機引物和200units逆轉錄酶，逆轉錄酶可選擇本領域做RT實驗時常用的逆轉錄酶，如逆轉錄酶M-MLV等；所述IX反應緩沖液優選含有50mM pH8.3的Tris_HCl、75mM KClUOmM DTT和3mM MgCl2。在實際操作中，該試劑盒還可以包括盒子、泡沫板等，其中泡沫板的大小與盒子的底板的大小相同，可以裝在盒子中，泡沫板上有不少于用于封裝反應試劑小管數量的小孔，用于封裝反應試劑的小管對應置于相應的小孔中，從而使得試劑都能處于小管的下部，方便取用和吸取，也可以使取用時殘留在管壁上的液體自動回到管底，節約試劑。上述快速診斷試劑盒的生產工藝，可以包括如下步驟:(I)將上下游引物及探針合成純化后，定量配制，濃度檢測，分裝后抽樣質檢；(2)將Trizol分裝后抽樣質檢；(3)將氯仿無菌分裝，抽樣質檢；(4)將異丙醇無菌分裝，抽樣質檢；(5)將體積百分含量為75%的乙醇無菌分裝，抽樣質檢；(6)將無RNase水無菌分裝,抽樣質檢；(7)將RT反應液無菌分裝，抽樣質檢；(8)將iQTM Supermix無菌分裝,抽樣質檢；
(9)將逆轉錄酶無菌分裝，抽樣質檢；(10)將陽性對照標本制備，分裝，抽樣質檢；(11)準備帶有小孔的泡沫板；(12)組裝試劑盒。本發明所要解決的第四個技術問題是通過如下技術方案來實現的:上述的青蟹雙順反子病毒-1檢測用引物組和Taqman探針在檢測青蟹雙順反子病毒_1中應用。
本發明所要解決的第五個技術問題是通過如下技術方案來實現的:上述對青蟹雙順反子病毒-1進行實時熒光定量RT-PCR檢測的試劑盒在檢測青蟹雙順反子病毒-1中的應用。與現有技術相比，本發明具有如下優點:(I)本發明通過構建青蟹雙順反子病毒-1檢測用引物組和Taqman探針，建立實時熒光定量RT-PCR，由于Taqman法采用雜交的方式對靶基因進行甄別，準確性高，同時，因目的基因由引物組和探針雙重控制，保證了特異性，降低了產生假陽性的概率；(2)本發明建立的基于Taqman探針的熒光定量RT-PCR方法可對待測樣本進行定量檢測，檢測范圍可達到9個數量級，在IO8 10°COpieS范圍內具有很好的線性關系(R2=0.992)，其最低檢測限可達到10個拷貝以下，靈敏度達到國際先進水平，適合檢測低病毒含量的實驗標本；(3)本發明檢測青蟹雙順反子病毒-1實時熒光定量RT-PCR的方法重復性和穩定性高,批內重復性試驗的CT值變異系數(CV)為1.11%，批間重復性試驗的CT值變異系數(CV)小于 1.3% ；(4)本發明檢測青蟹雙順反子病毒-1實時熒光定量RT-PCR的方法，可進行高通量檢測，自動化程度高，反應過程中無需開蓋，避免了污染，PCR擴增和產物檢測同步完成，操作簡單，易于實現自動化；(5 )本發明建立的基于Taqman探針的熒光定量RT-PCR方法較常規RT-PCR，靈敏度和特異性均得到了很大的提高，并縮短了實驗時間，簡化了操作步驟，可對病毒進行定量，結果更為客觀和準確，該檢測試劑盒和檢測方法對擬穴青蟹MCDV-1的早期診斷、臨床檢測及相關病毒研究的開展具有重要意義，具備廣泛的適用性。
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圖1是實施例2中熒光定量RT-PCR靈敏度檢測的熒光信號圖；圖2實施例2中青蟹雙順反子病毒-1絕對定量的標準曲線，Υ=_3.3191gX+ 44.53(注:X表示反應體系中表示標準質粒拷貝數)。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應當理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明要求保護的范圍。實施例1青蟹雙順反子病毒-1檢測用引物組選擇MCDV-1基因的一段100 200bp長度的保守片段，利用primer premier5.0軟件設計病毒特異性定量PCR引物和探針，擴增片段大小為119bp，引物對和探針序列為:上游引物Dic-taqF:5 ' -ACGAAGAATCTATCACTGGAATTGAA-3 '，具體如 SEQ IDN0.1所示；下游引物Dic-taqR:5' -CGTCTGCTTCCCGGGTTT-3'，具體如 SEQ ID N0.2 所示；Taqman 探針:5' -FAM-AATGCTCTGAACCGGAGTACGTCTGCC-TAMRA-3 '，具體如 SEQID N0.3所示，探針5'端標記的熒光發射基團為FAM，3'端標記的熒光淬滅基團為TAMRA。其中Taqman探針位于所述上游引物和下游引物之間。
實施例2青蟹雙順反子病毒-1熒光定量RT-PCR檢測方法的優化和建立( I)定量RT-PCR反應條件的優化對反應體系中引物濃度(0.1 0.5 μ M)、探針濃度(0.1 0.4 μ Μ)和退火延伸溫度(55 64°C )進行了優化，以獲得最低的Ct值和較高的熒光強度增加值作為標準，篩選出最佳的引物和探針濃度、退火延伸溫度。本發明使用的熒光定量PCR儀為德國Eppendorf公司生產的Mastercyclerep realplex突光定量PCR儀,在每個循環的第二步結束時收集
突光信號。經優化后的定量PCR反應體系(15 μ L反應體系):
權利要求
1.一種青蟹雙順反子病毒-1檢測用引物組和Taqman探針，其特征在于:所述引物組由上游引物和下游引物組成，所述的上游引物的堿基序列如序列表中SEQ ID N0.1所示，所述的下游引物的喊基序列如序列表中SEQ ID N0.2所不；所述的Taqman探針的喊基序列如序列表中SEQ ID N0.3所示；所述的Taqman探針位于所述上游引物和下游引物之間；在所述的Taqman探針的5'端標記有FAM熒光發射基團，3'端標記有TAMRA熒光淬滅基團。
2.一種檢測青蟹雙順反子病毒-1實時熒光定量RT-PCR的方法，其特征是:利用權利要求I中所述的引物組和Taqman探針通過實時熒光定量RT-PCR反應對青蟹雙順反子病毒-1進行定性和定量檢測。
3.一種對青蟹雙順反子病毒-1進行實時熒光定量RT-PCR檢測的試劑盒，其特征是:含有權利要求1所述的引物組和Taqman探針。
4.權利要求1所述的青蟹雙順反子病毒-1檢測用引物組和Taqman探針在檢測青蟹雙順反子病毒-1中應用。
5.權利要求3所述的對青蟹雙順反子病毒-1進行實時熒光定量RT-PCR檢測的試劑盒在檢測青蟹雙順反子 病毒-1中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種青蟹雙順反子病毒-1檢測用引物組和Taqman探針，引物組由上游引物和下游引物組成，所述的上游引物的堿基序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，所述的下游引物的堿基序列如序列表中SEQ ID NO.2所示，所述的Taqman探針的堿基序列如序列表中SEQ ID NO.3所示，在所述的Taqman探針的5′端標記有FAM為熒光發射基團，3′端標記有TAMRA熒光淬滅基團，所述的Taqman探針位于所述上游引物和下游引物之間。還公開了采用該引物組和探針的檢測青蟹雙順反子病毒-1的方法和試劑盒，該方法成本低、耗時短、產率高，特異性高，且陰陽性結果差異顯著，驗證率高，更加明顯可靠。
文檔編號G01N21/64GK103243180SQ20131017524
公開日2013年8月14日 申請日期2013年5月13日 優先權日2013年5月13日
發明者郭志勛, 張迪, 馬紅玲, 馮娟, 蘇友祿 申請人:中國水產科學研究院南海水產研究所
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