改進的六胺銀馬松套染法
【專利摘要】本發明涉及一種改進的六胺銀馬松套染法，包括以下步驟：配制銀染試劑；將組織切片用Bouin液固定；切片依次浸入2.5%碘酒、5%硫代硫酸鈉、1.5%高碘酸；取銀染A液和銀染B液浸染切片，直至基底膜顯示清晰的黑色后終止；3%硫代硫酸鈉浸泡切片；蘇木素浸染；鹽酸酒精分化，水洗返藍；麗春紅染液浸染；1%磷鉬酸浸泡切片；經梯度酒精脫水后入二甲苯透明，中性樹膠封片。本發明提供了一種試劑調配合理、染色效果好且時間短、性能穩定、套染色澤鮮艷的六胺銀馬松套染法，并在實驗中取得了比現有方法更好的效果，改變了銀染色中組織容易出現過染，時間、溫度較難控制，背景顏色過高及套染別的染色色彩不夠鮮艷等問題。
【專利說明】改進的六胺銀馬松套染法
【技術領域】
[0001]本發明涉及六胺銀馬松套染法，是腎組織穿刺活檢的病理診斷必要的特殊染色方法之一。特別地，本發明涉及一種改進的六胺銀馬松套染法，可以用于顯示腎組織中小球、小管、血管基底膜和組織免疫復合物沉積及纖維化等改變。
【背景技術】
[0002]六胺銀馬松套染法是從霉菌染色的六胺銀法演化形成的針對腎組織切片的染色方法，是六胺銀和馬松兩種染色方法的疊加染色。在腎小球疾病中，常導致腎小球基底膜的改變，基底膜是一層高度含水性凝膠體的襯膜，主要由粘多糖和蛋白質構成，具有滲透性，常與纖細的結締組織纖維密切結合。六胺銀馬松套染法是使腎組織經酸氧化后，基底膜內的粘多糖暴露出醛基，醛基把六胺銀還原為黑褐色的金屬銀，從而使基底膜顯示出黑色的著色。該法是腎穿刺活檢病理診斷中是常規的特殊染色方法之一。它不僅能清晰顯示腎組織中小球的數目，勾畫出小球基底膜斷裂、增生、折疊等形態改變，還能準確地顯示免疫復合物在基底膜沉積位置，還能顯示出腎小管萎縮狀態、血管壁增厚與否及炎細胞浸潤的嚴重程度等。因此，六胺銀馬松套染法對于腎臟病理臨床診斷、分類和治療提供了重要的依據，是腎臟病理診斷必不可少且難度最大的特殊染色方法。
[0003]目前，國內外的專業人士想盡了許多辦法改進常用的基底膜銀染色方法，包括Gomori法、Jonej s法、矢島(Jenos)改良法、Gordon-Sweet法、Janes法等,企圖取得更好的基底膜染色質量，但是依然存在以下種種問題:銀染色中組織容易出現過染；時間、溫度較難控制；背景顏色過高；套染別的染色色彩不夠鮮艷等。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在于提供一種改進的六胺銀馬松套染法，該方法中的銀染試劑調配合理、染色效果好、時間短、性能穩定、套染染色色澤鮮艷，能夠更好地為腎臟病理臨床診斷、分類和治療提供重要的依據。
[0005]本發明所述的一種改進的六胺銀馬松套染法，包括以下步驟:
[0006](I)配制銀染試劑，包括:
[0007]銀染A液:蒸餾水230ml，5%硼砂45ml，4%硼酸4ml，15%六次甲基四胺60ml ;銀染B液:蒸餾水100ml, IOg硝酸銀；
[0008]5%硼砂:蒸懼水100ml, 5g硼砂；
[0009]15%六次甲基四胺:蒸餾水100ml，15g六次甲基四胺；
[0010]4%硼酸:蒸餾水100ml，4g硼酸；
[0011]1.5%高碘酸:蒸餾水100ml, 1.5g高碘酸；
[0012]麗春紅染液:麗春紅S0.7g，酸性品紅0.3g，蒸餾水100ml，冰醋酸Iml ；
[0013]1%苯胺藍:苯胺藍lg，冰醋酸1ml，蒸餾水IOOml ；
[0014]1%磷鑰酸:磷鑰酸lg，蒸餾水IOOml ；[0015](2)將組織切片用Bouin液固定，脫蠟，入水；
[0016](3)切片浸入2.5%碘酒3分鐘，蒸餾水洗3次；
[0017](4)切片浸入5%硫代硫酸鈉5分鐘，蒸餾水洗3次；
[0018](5)切片浸入1.5%高碘酸15分鐘，氧化溫度在20_25°C之間，蒸餾水洗3次。
[0019](6)取銀染A液30ml過濾并于70°C預熱25分鐘；
[0020](7)將銀染B液0.82ml加入預熱好的銀染A液中，混勻放入切片，70°C浸染15分鐘后每5分鐘鏡下觀察基底膜的著色情況，直至基底膜顯示清晰的黑色后終止；蒸餾水洗3次；
[0021](8) 3%硫代硫酸鈉浸泡切片15秒，水洗3分鐘X 3次；
[0022](9 )蘇木素浸染15分鐘，水洗；
[0023]( 10)鹽酸酒精分化，水洗返藍；
[0024](11)麗春紅染液浸染12分鐘，水洗I分鐘X 3次；
[0025](12) 1%磷鑰酸浸泡切片I分鐘，直接入1%苯胺藍浸染4分鐘；
[0026](13)切片經梯度酒精脫水后入二甲苯透明，中性樹膠封片。
[0027]根據本發明所述的六胺銀馬松套染法的進一步特征，所述的蒸餾水為電子級超純水或雙蒸分析實驗室一級用水。
[0028]本發明所述的改進的六胺銀馬松套染法，對于染液的試劑濃度比例關系、染色時間、染色溫度及套染染液的配比、步驟進行了改良調整，摸索出一種試劑調配合理、染色效果好且時間短、性能穩定、套染色澤鮮艷的方法，并在實驗中取得了比現有方法更好的效果，改變了銀染色中組織容易出現過染，時間、溫度較難控制，背景顏色過高及套染別的染色色彩不夠鮮艷等問題。
[0029]染色過程中金屬銀的還原是關鍵步驟，往往決定著染色的成敗。胺銀染色試劑中六次甲基四胺、硼酸、硼砂、硝酸銀的配比適當，能防止產生過量的胺銀黑顆粒污染組織而影響組織病變的觀察。本發明是在不斷的摸索中調配出來胺銀染色試劑中六次甲基四胺、硼酸、硼砂、硝酸銀的最佳配比，較Gomori法、Jonej s法、矢島(Jenos)改良法、Gordon-Sweet法、Janes法等國內外常用的銀染法減少了硝酸銀的含量。染液中銀離子的含量降低，減少了胺銀顆粒污染組織的可能。但是染液中銀離子減少使基底膜著色需要更長的時間，長時間的胺銀反應容易使染液變渾濁并出現黑色的反光膜，氯化金調色時很難清除掉切片上黑色的反光膜，致使切片背景較臟，不利于染色結果的判斷。因此，本發明在調整配比的同時，調整了染色的溫度和染色的時間，使染液未形成渾濁和反光膜前，基底膜的染色就已經完成，不需常規銀染中的氯化金調色去除多余的銀染顆粒。這種配比減少了腎組織棕黑色的背景著色，更有助于后面的雙重染色。
[0030]在染色的過程中腎組織經酸氧化后，使基底膜內的粘多糖暴露出醛基，醛基把六胺銀還原為黑褐色的金屬銀而使腎小球的基底膜著色的。組織氧化是染色成功的前提。氧化一定要充分才能使醛基暴露完全，若氧化不夠完全，切片銀著色較淺，影響結果判斷。本發明在氧化的過程提高了高碘酸的含量，延長了高碘酸的反應時間，充分暴露了基底膜內的醛基，提高了染液的使用次數和有效期。
[0031]在銀染的過程中除了試劑的配方、反應的溫度和時間以外，本發明使用的器皿應預先用濃硫酸浸泡并沖洗干凈。染色過程中，染液不能接觸金屬物質(如鑷子)等影響染色外在因素。關于配染液的水，本發明對比了實驗室常用的幾種配試劑的水，包括:單蒸水、雙蒸水、通過水處理系統處理過的分析實驗室一級用水和電子級超純水。實驗表明，使用電子級超純水和分析實驗室一級用水雙蒸處理后配銀染試劑背景最低，染色質量最好。銀染液用合適的實驗用水配制并按上述步驟、時間和溫度操作可以有效的防止銀染過染，時間、溫度較難控制，背景顏色過高等難以解決的問題。
[0032]在腎組織六胺銀染色之后常常進行Masson雙重染色，其目的是為了在同一張切片中顯示腎小球內的免疫復合物的沉積的部位、形態和病變范圍以及腎間質纖維化的程度等。由于常規的六胺銀染色已將組織中許多嗜銀位點染成黑色，這會導致套染馬松三色時腎小球內免疫復合物顯色顏色淺淡，基底膜、系膜、膠原纖維及胞質、紅細胞顏色對比不鮮艷。本發明改變了經典馬松染色的配方，將混合紅染液換成了麗春紅S與酸性品紅的配比染液，從而去除了混合紅中的亮綠。并且摸索出了合適的染色時間，提升組織中的紅細胞、細胞質及免疫復合物的鮮艷程度并且提高了間質中藍色膠原纖維的對比。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0033]圖1為本發明所述的改進的六胺銀馬松套染法的腎組織切片染色圖。
[0034]圖2為美國華盛頓大學醫學中心病理科所采用的Jones-HE銀染色法的腎組織切片染色圖(該圖片來自廣州金域醫學檢驗中心耿艦教授提供)。
[0035]圖3為寶雞市中心醫院采用Gomor1-masson銀染法的腎組織切片染色圖(馬寧，蔡媛.腎穿刺標本六胺銀G馬松三色套染法介紹[J].2012，19(10):391)。
[0036]圖4為廣東省人民醫院病理科采用矢島(Jenos)改良銀染法的腎組織切片染色圖(駱新蘭，蔡秀，王朝杰，等.腎小球基膜六胺銀染色的比較[J].臨床與實驗病理學雜志，200520(4):493-494.)。
[0037]圖5為國內各大醫院及醫學檢驗機構腎組織六胺銀染色圖。圖片來源于患者在南方醫科大學南方醫院(即本 申請人:)就診時提供的病史資料，可根據患者的病理號到原醫院查找到患者的六胺銀染色的病理切片，從患者帶來的病理切片中看出各大醫院的染色結果。圖中，A、B是來自于廣州中山醫科大學第一附屬醫院病理科(患者病理號:K10590) ;C、D、E是來自于廣州金域醫學檢驗中心(患者病理號:KB1312967、KB1401240) ;F是來自于江西省兒童醫院病理科(患者病理號:43174)。
[0038]圖6為不同的實驗用水在相同條件下的胺銀反應對比。據圖經單因素方差分析，圖中電子級超純水及雙蒸分析實驗室一級用水分別與一級用水、單蒸水相比P < 0.05，有統計學意義。
【具體實施方式】
[0039]本發明在這里可通過以下的具體實施例的詳細說明來得以更好的理解。需要明確的是，這些具體實施例僅是用作示例，而不是對在所附的權利要求所定義的本發明的任何形式的限制。除非在這里另外特別定義，所有術語都采用它們的最寬的可能的解釋，包括從本說明書中暗示的含義，以及本領域熟練技術人員所能知曉的含義和/或在字典、論文等重所定義的含義。
[0040]以下是本文所采用的部分術語在本領域的解釋。[0041]脫蠟:石蠟切片染色必須用二甲苯脫去切片中的石蠟，作用是二甲苯可以溶解石蠟，以使染料易于進入細胞和組織。
[0042]分化:在蘇木精染色之后，用水洗去未結合的染液，但在細胞核中結合過多的染料和細胞漿中吸附的染料必須用1%鹽酸酒精脫去，才能保證細胞核和細胞漿染色的分明，把這個過程稱為分化。
[0043]返藍:分化之后蘇木精在酸性條件下處于紅色離子狀態，在堿性條件下則處于藍色離子狀態，呈藍色。所以分化后用水洗除去酸而終止分化，在用弱堿性水是蘇木精染上的細胞核變呈藍色，這一過程稱藍化或返藍。
[0044]脫水:切片染色結束后將切片由低濃度酒精過度到高濃度的酒精過度的過程，其作用是將組織中的水分置換成酒精，以便于二甲苯進入組織細胞進行透明。
[0045]透明:石蠟組織切片染色經過脫水處理后必須經二甲苯處理，使切片透明，才能用樹膠封片。
[0046]實施例1:本發明所述的六胺銀馬松套染法
[0047]1.試劑配方:
[0048]1.1銀染配方:
[0049]銀染A液:蒸餾水230ml，5%硼砂45ml，4%硼酸4ml，15%六次甲基四胺60ml。該液體放于4°C冰箱保存，有效期為2個月。2個月后需重新配制。
[0050]銀染B液:蒸餾水100ml，IOg硝酸銀。該液體需避光于4°C冰箱保存，如發現液體有黑色沉淀，需重新配制。
[0051]1.2.15%硼砂:蒸餾水100ml，5g硼砂。該液體室溫，避光保存。
[0052]1.2.215%六次甲基四胺:蒸餾水100ml，15g六次甲基四胺，該液體放于4°C冰箱保
存，出現沉淀需重新配制。
[0053]1.2.34%硼酸:蒸餾水100ml，4g硼酸。該液體室溫保存。
[0054]1.2.41.5%高碘酸:蒸餾水100ml，1.5g高碘酸。該液體放于4°C冰箱保存，使用時需防止液體稀釋，染100張色切片后該液體需重新配制。
[0055]1.2.5麗春紅染液:麗春紅S0.7g,酸性品紅0.3g,蒸懼水100ml,冰醋酸lml。室
溫保存。
[0056]1.2.61%苯胺藍:苯胺藍lg，冰醋酸1ml，蒸餾水100ml。室溫保存。
[0057]1.2.71%磷鑰酸:磷鑰酸lg，蒸餾水100ml。室溫保存。
[0058]2.步驟
[0059]2.1Bouin液固定的組織切片，脫蠟，入水。(預熱第5步，取銀染A液30ml過濾并于70°C預熱25分鐘)。
[0060]2.2切片浸入2.5%碘酒3分鐘，蒸餾水洗3次。
[0061]2.3切片入5%硫代硫酸鈉浸泡5分鐘，蒸餾水洗3次。
[0062]2.41.5%高碘酸浸泡15分鐘(氧化溫度在20_25°C之間)，蒸餾水洗3次。
[0063]2.5取出預熱好的銀染A液30ml (見2.1)。
[0064]2.6將銀染B液0.82ml加入預熱好的銀染A液中，混勻放入切片，70°C浸染，15分鐘后每5分鐘鏡下觀察基底膜的著色情況，直至基底膜顯示清晰的黑色后終止；蒸餾水洗3次；[0065]2.7切片入3%硫代硫酸鈉浸泡15秒，水洗3分鐘X 3次。
[0066]2.8蘇木素浸染15分鐘，水洗。
[0067]2.9鹽酸酒精分化，水洗返藍。
[0068]2.10麗春紅染液浸染12分鐘，水洗I分鐘X 3次。
[0069]2.111%磷鑰酸浸泡I分鐘直接入1%苯胺藍浸染4分鐘。不水洗直接脫水。
[0070]2.12切片經梯度酒精脫水后入二甲苯透明，中性樹膠封片。
[0071]3.注意事項
[0072]3.1染色時請用立式染缸浸染,除銀染A、B液外其他液體均可重復使用。染缸、切片均須泡酸、蒸餾水沖洗數次方可備用。
[0073]3.2由于銀染著色的不可逆性，在染至15分鐘左右時要開始鏡下進行性觀察染色效果，以腎小球基底膜清晰著色為好。銀染液不可重復使用，快到有效期的染液請縮短染色時間。
[0074]3.3第7步3%硫代硫酸鈉時間不可過長，否則容易掉片。
[0075]3.4在上述實驗步驟中，采用的蒸餾水為電子級超純水或雙蒸分析實驗室一級用水。
[0076]4.結果
[0077]基底膜為黑色，膠原纖維藍色，胞質、肌纖維、紅細胞、免疫復合物紅色，胞核藍褐色。
[0078]實施例2:本發明所述的改進的六胺銀馬松套染法與國內外各大醫院及醫學檢驗機構腎組織六胺銀染色的比較
[0079]圖1為本發明所述的改進的六胺銀馬松套染法的腎組織切片染色圖。如圖1所示改進的六胺銀馬松套染法對腎組織中的腎小球基底膜、腎小管基底膜、血管基底膜等部位黑色線條勾勒的清晰明顯，基底膜外的免疫復合物及腎小管細胞著色鮮艷、染色的背景干凈，色彩鮮明。
[0080]從染色效果看，該染色法優于Jones-HE銀染色法(圖2)、Gomor1-masson銀染法(圖3)、矢島(Jenos)改良銀染法(圖4);并且優于曾經來我院(南方醫科大學南方醫院)會診、讀片、展示的國內各大醫院及醫學檢驗機構所做的腎組織六胺銀染色(圖5)。
[0081]實施例3:不同的實驗用水在相同條件下的胺銀反應對比
[0082]選取單蒸水、雙蒸水、通過水處理系統處理過的分析實驗室一級用水、分析實驗室一級用水后雙蒸處理水、電子級超純水各30份樣本，分別加入本發明的銀染A液和銀染B液，于烤箱70°C進行胺銀反應1.5小時。將各樣本置于752型紫外分光光度計測定，波長設定為680nm。取30例測量結果的均值，用電子級超純水銀染試劑液調0，對比結果經統計學分析后如圖6所示，可見使用電子級超純水和雙蒸分析實驗室一級用水配銀染試劑吸光值最低，渾濁度最低，更適合腎組織六胺銀染色。
【權利要求】
1.一種改進的六胺銀馬松套染法，其特征在于，包括以下步驟: (1)配制銀染試劑，包括: 銀染A液:蒸餾水230ml，5%硼砂45ml，4%硼酸4ml，15%六次甲基四胺60ml ； 銀染B液:蒸餾水100ml, IOg硝酸銀； 5%硼砂:蒸懼水100ml, 5g硼砂； 15%六次甲基四胺:蒸餾水100ml，15g六次甲基四胺； 4%硼酸:蒸餾水100ml, 4g硼酸； 1.5%高碘酸:蒸懼水100ml, 1.5g高碘酸； 麗春紅染液:麗春紅S0.7g,酸性品紅0.3g,蒸懼水100ml,冰醋酸Iml ； 1%苯胺藍:苯胺藍Ig,冰醋酸Iml,蒸懼水IOOml ； 1%磷鑰酸:磷鑰酸lg，蒸餾水IOOml ； (2)將組織切片用Bouin液固定，脫蠟，入水； (3)切片浸入2.5%碘酒3分鐘，蒸餾水洗3次； (4)切片浸入5%硫代硫酸鈉5分鐘，蒸餾水洗3次； (5)切片浸入1.5%高碘酸15分鐘，氧化溫度在20-25°C之間，蒸餾水洗3次； (6)取銀染A液30ml過濾并于70°C預熱25分鐘； (7)將銀染B液0.82ml加入預熱好的銀染A液中，混勻放入切片，70°C浸染15分鐘后每5分鐘鏡下觀察基底膜的著色情況，直至基底膜顯示清晰的黑色后終止；蒸餾水洗3次； (8)3%硫代硫酸鈉浸泡切片15秒，水洗3分鐘X3次； (9)蘇木素浸染15分鐘，水洗； (10)鹽酸酒精分化，水洗返藍； (11)麗春紅染液浸染12分鐘，水洗I分鐘X3次； (12)1%磷鑰酸浸泡切片I分鐘，直接入1%苯胺藍浸染4分鐘； (13)切片經梯度酒精脫水后入二甲苯透明，中性樹膠封片。
2.根據權利要求1所述的六胺銀馬松套染法，其特征在于:所述的蒸餾水為電子級超純水或雙蒸分析實驗室一級用水。
【文檔編號】G01N1/30GK103926131SQ201410138429
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年4月8日 優先權日:2014年4月8日
【發明者】周展眉, 王國保, 曹維, 楊滿球 申請人:南方醫科大學南方醫院
專業數控銑床產品供應商
20年生產經驗，實力工廠，精工品質，質量有保障
