一種定量檢測雞糞中氟喹諾酮類的方法
【專利摘要】本發明公開了一種定量檢測雞糞中6種氟喹諾酮類的檢測分析方法，該方法包括：(1)雞糞樣品經冷凍干燥；(2)粉碎雞糞樣品并過篩；(3)加入EDTA-Mcllvaine和乙腈混合提取劑，漩渦混勻并超聲處理；(4)離心獲上清液為提取液；(5)去除有機溶劑后，提取液用濾膜過濾；(6)過濾液過HLB柱并抽干，用5%甲醇溶液清洗柱，最后經甲醇洗脫目標抗生素，收集洗脫液；(7)吹干，用乙腈/0.7%磷酸定容，充分溶解后過濾即可用于定量檢測。本發明方法實現了6種氟喹諾酮類的同時檢測，具有低成本、易操作等特點，為復雜基質中FQs類抗生素的檢測提供了一種可選的方法，且方法檢出限、定量限均低，回收率高。
【專利說明】一種定量檢測雞糞中氟喹諾酮類的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種復雜基質中抗生素的檢測方法，具體地說是雞糞中6種氟喹諾酮類(FQs)抗生素的檢測方法。
【背景技術】
[0002]氟喹諾酮類(FQs)抗生素是一類由人工合成的廣譜類抗菌藥，是喹諾酮的哌嗪基派生物，通過抑制細菌的DNA解旋酶II (topoisomerase II)和拓撲異構酶IV(topoisomerase IV)而影響細菌的DNA復制過程。由于具有廣譜抗革蘭氏細菌活性和口服吸收效果好等特性，FQs在禽畜養殖業被大量用于禽畜疾病防治以及被用作飼料添加劑。依據世界衛生組織統計，全球每年消耗的抗生素總量中，有90%被用于禽畜養殖。如美國每年養殖業使用抗生素約為I萬多噸，由于代謝率僅為10%到40%，大部分抗生素被直接排放到環境中。近年來中國養殖業發展迅猛，規模化、集約化的程度不斷提高，每年用于飼料添加劑的抗生素占全球使用量的50%以上。中國每年畜禽糞便產生量約是工業固體廢棄物的2倍以上，部分地區甚至超過4倍。大量抗生素將進入環境中而可能導致生物毒性和致病菌產生抗藥性基因等環境風險和生態風險。而以歐盟為例，氟喹諾酮類和喹諾酮類作為主要的獸藥抗生素，其在歐盟主要國家使用比例僅次于四環素類、磺胺類，由此帶來的環境風險不容忽視。而對環境中該類抗生素的檢測是評估其環境風險、生態風險的首要步驟，也是對其進行治理的基礎環節，因此迫切需要開發一種復雜基質中氟喹諾酮類(FQs)的檢測分析方法。
[0003]由于畜禽糞便基質復雜，FQs分析時受到的雜質干擾大。目前在環境基質中抗生素的檢測技術中，高效液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)具有檢測范圍寬，靈敏度高，較強的抗干擾能力等特點，但由于成本較高而影響到它的廣泛應用。而熒光檢測器(FLD)成本相對較低而且對于FQs類物質靈敏度較高，因此通過高效液相色譜-熒光分析法(LC/FLD)檢測FQs應用越來越多。潘等使用LC/FLD對食品中6種FQs檢測分析，Li等使用LC/FLD對土壤中的4種FQs進行殘留檢測，但回收率相對偏低(洛美沙星為61.3%?67.8%、恩諾沙星63.2%?75.7%)。Zhao等建立了 LC-FLD對禽畜糞便中7中FQs同時檢測分析的方法，但由于未經過SPE凈化過程，方法定量限偏高(0.031?0.15 mg/kg)。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是解決復雜基質中FQs不易于分析測定，且現有分析測定技術回收率低、定量限高、成本高等問題，建立了一種基于固相萃取一高效液相色譜熒光檢測法，用以分析雞糞中6種氟喹諾酮類(FQs):諾氟沙星(N0R)、環丙沙星(CIP)、洛美沙星(L0M)、達氟沙星(DAN)、恩諾沙星(ENR)、沙拉沙星(SAR)。該方法具有較高的回收率，較低的定量限，且分析成本較LC-MS/M S方法低，為復雜基質中FQs的檢出提供了一種高效經濟的方法，具有較高的推廣價值。
[0005]本發明的技術方案是:一種定量檢測雞糞中氟喹諾酮類的方法，包括如下步驟:(1)雞糞樣品經冷凍干燥；
(2)粉碎雞糞樣品并過篩；
(3)加入EDTA-Mcllvaine和乙腈混合提取劑，漩渦混勻并超聲處理；
(4)離心獲上清液為提取液，重復提取1-3次，合并各次提取液；
(5)去除有機溶劑后，提取液用濾膜過濾；
(6)過濾液過HLB柱并抽干，用5%甲醇溶液清洗柱，最后經甲醇洗脫目標抗生素，收集洗脫液；
(7)吹干，用乙腈/0.7%磷酸定容，充分溶解后過濾即可用于定量檢測。
[0006]上述的方法，所述氟喹諾酮類包括NOR、CIP、LOM、DAN、ENR和SAR六種物質。
[0007]上述的方法，第(2)步粉碎并過篩是后過2mm篩。
[0008]第(3)步加入EDTA-Mcllvaine:乙腈=1:1 (體積比)的混合提取劑，鏇潤混勻30S，超聲10-25 min，其中混合提取劑為pH≤3.0，優選pH=2，超聲提取時間為15min。
[0009]第(4)步離心 獲上清液為提取液，重復提取2次，合并3次提取液，其中以3000至5000 rpm進行離心。
[0010]第(5)步去除有機溶劑采用旋轉蒸發儀在40°C左右水浴中減壓蒸發，提取液用過1.2μπι玻璃纖維濾膜。
[0011]第(6)步的具體步驟是:以I mL/min的速率通過HLB柱并抽干,用6 mL 5%甲醇溶液清洗柱，最后經5 mL甲醇洗脫目標抗生素，收集洗脫液。
[0012]第(7)步的具體步驟是:在40°C條件下高純氮氣吹干，用體積比為1:9的乙腈/0.7%磷酸定容至I mL，超聲5 min促溶，過0.22 μ m濾膜后待測。
[0013]所述的方法，采用高效液相色譜熒光檢測法測定氟喹諾酮類抗生素。
[0014]所述的方法，所述檢測具體操作步驟是:WATERS Xterra RP18色譜柱(250mmX4.6 ymX5 μ m,)，柱溫:40°C ;熒光檢測器(FLD)檢測波長:激發波長280 nm,發射波長450 nm:進樣體積:20 μ L ;流速:0.8 ml/min,采用二元梯度泵,流動相A為乙腈,流動相B為0.7 %磷酸溶液；梯度洗脫程序:0~20 min, 10% A ;20~35 min, 10%~25% A ；35 ~45 min, 40% A ；45 ~55 min; 10% A0
[0015]本發明采用固相萃取一高效液相色譜熒光檢測法分析雞糞中6種氟喹諾酮類(FQs)，選用Mcllvaine- Na2EDTA緩沖液/乙腈(1:1) (pH=2)作為提取劑，超聲提取時間15分鐘，經HLB固相柱凈化，選用甲醇為洗脫劑，濃縮后用HPLC/FLD檢測時應用乙腈/0.7%磷酸(1:9，V/V)為流動相。FQs在0.01~1.0 mg/kg濃度范圍內呈現良好線性關系，R2為
0.9969 ~0.9999。加標(濃度水平 0.01,0.5、1.0 mg/kg 干重)回收率達 76.7% ~106.7%,相對標準偏差0.7%~14.4% (n=4)。方法檢出限為0.002~0.022 mg/kg,方法定量限為
0.0068 ~0.074 mg/kg。
[0016]對FQs類物質從環境樣品中提取，提取劑的選擇非常重要。目前常用的提取劑有Mg (NO3) 2溶液、EDTA-Mcllvaine緩沖液和乙腈等無機有機溶液。比較研究50%Mg (NO3) 2-2.5% NH3.H20、EDTA-MclIvaine 緩沖液(pH=4)和乙腈等無機、有機提取液，甲醇:乙酸:水(6:1:3,V/V)和EDTA-Mcllvaine:乙腈(1:1,V/V)等混合提取液，以及EDTA-Mcllvaine緩沖液與甲醇:乙酸:水(6:1:3，V/V)復合提取時各目標物的回收率后，本發明選擇EDTA-Mcllvaine:乙腈(1:1)作為提取劑，NOR、CIP、LOM、DAN、ENR和SAR六種物質的回收率分別為 83.6%±4.4 ,68.0%±4.9,74.1%±6.1,79.7%±4.8,90.8%±4.7 和64.3%±5.5。
[0017]氟喹諾酮類抗生素結構式含哌嗪基，有2個pKa值(ρΚ&1=5.5?6.3，pKa2=7.6?
8.5)，在水溶液酸性條件下(通常pH〈5)，氟喹諾酮是陽離子形式，在對喹諾酮類樣品預處理中大多將樣品PH調節為酸性，將其轉化為陽離子形式有利于提取。在選擇EDTA-Mcllvaine:乙腈(1:1)作為提取劑，用HCL或NaOH調節提取液pH為1.0?8.0后對樣品進行提取，過SPE柱后上機測定。經對比研究，本發明在選擇EDTA-Mcllvaine:乙腈=1:1作為提取劑條件下，調節提取劑pH至pH=2。
[0018]提取時間影響目標物的回收率，提取時間過短無法有效將目標抗生素從基質中提取出來，致使回收率低，而提取時間多長這可能將基質中的有機物雜質提取出來，影響隨后的分析測定。本發明在40°C條件下超聲提取時間確定為15 min，采用3次提取，合并提取液，以備下一步處理。
[0019]由于雞糞基質的復雜性，需選擇適當的有機溶劑盡可能將目標物洗脫，同時避免洗脫下來干擾雜質影響目標物的檢測。目前常用的洗脫溶劑有甲醇、甲醇:丙酮(80:20)、甲醇:乙酸乙酯(1:9)和二氯甲烷。分別以甲醇，甲醇:丙酮(80:20)、甲醇:乙酸乙酯(1:9)和二氯甲烷為洗脫劑，進行對比研究，本發明選用甲醇作為洗脫劑，洗脫體積為4ml。
[0020]本發明中，樣品前處理后采用初始流動相乙腈/0.7%磷酸(1: 9，V/V)定容，色譜峰峰形對稱，分離效果較好。定容后采取超聲5 min促溶。
[0021 ] 本發明中色譜儀器運行條件及環境如下:WATERS Xterra RP18色譜柱(250mmX4.6 ymX5 μ m,)，柱溫:40°C ;熒光檢測器(FLD)檢測波長:激發波長280 nm,發射波長450 nm;進樣體積:20 μ L ;流速:0.8 ml/min。二元梯度泵,流動相A為乙腈,流動相B為0.7 %磷酸溶液。梯度洗脫程序:0?20 min, 10% A ;20?35 min, 10%?25% A ;35?45 min,40% A ；45 ?55 min;10% A。
[0022]高效液相色譜熒光檢測法(SPE-HPLC/FLD)測定氟喹諾酮類(FQs)抗生素，流動相的選擇非常重要。目前采用0.025 mo I/L的乙酸銨一 0.5%乙酸緩沖液與乙腈或0.7%磷酸與乙腈作為流動相較為常見。本發明選用0.7%磷酸與乙腈作為流動相，使得6種FQs抗生素出峰時間穩定,分離效果較好,分離度均大于1.5,無拖尾現象。
[0023]本發明與現有檢測方法相比，具有以下優點:
1、回收率高:加標(濃度水平0.01、0.5、1.0 mg/kg干重)回收率達76.7%?106.7% ；
2、定量限低:定量限為0.0068?0.074 mg/kg ；
3、檢出限低:方法檢出限為0.002?0.022 mg/kg ；
4、分析成本低:分析成本較LC-MS/MS方法低。
【具體實施方式】
[0024]實施例一
比較 50% Mg(NO3)2-2.5% NH3.H20、EDTA-Mcllvaine 緩沖液(pH=4)和乙腈等無機、有機提取液，甲醇:乙酸:7jC (6:1:3, V/V)和EDTA-Mcllvaine:乙腈(1:1,V/V)等混合提取液，以及EDTA-Mcllvaine緩沖液與甲醇:乙酸:水(6:1:3，V/V)復合提取時各目標物的回收率。結果如表1，從表中可以看出，單獨使用無機提取液50% Mg(NO3)2-2.5% NH3-H2O,EDTA-Mcllvaine緩沖液或有機提取液乙腈時，均無法從基質中有效提取出目標物；而使用有機無機混合提取液甲醇:乙酸:水(6:1:3，V/V)時，對于NOR、CIP等目標物提取效率仍然偏低，采用EDTA-Mcllvaine緩沖液與甲醇:水:乙酸=6:1:3復合提取時，提取效率基本能達到要求，但實驗提取劑使用量較大，提取步驟較繁瑣，需兩種提取劑先后各提取兩次，前處理后的樣品上機檢測時檢出的雜質也較多；而使用EDTA-Mcllvaine:乙腈(1:1)時，6種目標物回收率均較理想，且溶劑使用量小，提取步驟簡便，雜質也較少。這是因為FQs容易與環境樣品中的二價或三價金屬離子形成化合物，加入螯合劑EDTA可以防止被二價或三價金屬離子綁定。而乙腈相對于甲醇、乙酸乙酯、二氯甲烷等具有更好的提取喹諾酮類的效果，并且乙腈在沉淀糞便樣品中蛋白質方面效果較好，要優于甲醇和丙酮。綜合考慮，選擇EDTA-Mcllvaine:乙腈(1:1)作為提取劑。
[0025]表1不同提取劑的比較
【權利要求】
1.一種定量檢測雞糞中氟喹諾酮類的方法，其特征在于: (1)雞糞樣品經冷凍干燥； (2)粉碎雞糞樣品并過篩； (3)加入EDTA-Mcllvaine和乙腈混合提取劑，漩渦混勻并超聲處理； (4)離心獲上清液為提取液，重復提取1-3次，合并各次提取液； (5)去除有機溶劑后，提取液用濾膜過濾； (6)過濾液過HLB柱并抽干，用5%甲醇溶液清洗柱，最后經甲醇洗脫目標抗生素，收集洗脫液； (7)吹干，用乙腈/0.7%磷酸定容，充分溶解后過濾即可用于定量檢測。
2.根據權利要求1所述的定量檢測雞糞中氟喹諾酮類的檢測分析方法，其特征在于:氟喹諾酮類是NOR、CIP、LOM、DAN、ENR和SAR六種物質。
3.根據權利要求1所述的定量檢測雞糞中氟喹諾酮類的檢測分析方法，其特征在于:第(2)步粉碎并過篩是后過2mm篩。
4.根據權利要求1所述的定量檢測雞糞中氟喹諾酮類的檢測分析方法，其特征在于:第(3)步加入EDTA-Mcllvaine:乙腈=1:1 (體積比)的混合提取劑,鏇潤混勻30 S，超聲10-25 min，其中混合提取劑為pH≤3.0，優選pH=2，超聲提取時間為15min。
5.根據權利要求1所述的定量檢測雞糞中氟喹諾酮類的檢測分析方法，其特征在于:第(4)步離心獲上清液為提取液，重復提取2次，合并3次提取液，其中以3000至5000 rpm進行離心。
6.根據權利要求1所述的定量檢測雞糞中氟喹諾酮類的檢測分析方法，其特征在于:第(5)步去除有機溶劑采用旋轉蒸發儀在40°C左右水浴中減壓蒸發，提取液用過1.2μπι玻璃纖維濾膜。
7.根據權利要求1所述的定量檢測雞糞中氟喹諾酮類的檢測分析方法，其特征在于:第(6)步的具體步驟是:以I mL/min的速率通過HLB柱并抽干，用6 mL 5%甲醇溶液清洗柱，最后經5 mL甲醇洗脫目標抗生素，收集洗脫液。
8.根據權利要求1所述的定量檢測雞糞中氟喹諾酮類的檢測分析方法，其特征在于:第(7)步的具體步驟是:在40°C條件下高純氮氣吹干，用體積比為1:9的乙腈/0.7%磷酸定容至I mL，超聲5 min促溶，過0.22 μ m濾膜后待測。
9.根據權利要求1所述的定量檢測雞糞中氟喹諾酮類的檢測分析方法，其特征在于:采用高效液相色譜熒光檢測法測定氟喹諾酮類抗生素。
10.根據權利要求9所述的定量檢測雞糞中氟喹諾酮類的檢測分析方法，其特征在于: 所述檢測具體操作步驟是:WATERS Xterra RP18色譜柱(250 mmX4.6 ymX5 μ m,),柱溫:40°C;熒光檢測 器(FLD)檢測波長:激發波長280 nm,發射波長450 nm:進樣體積:20μ L ;流速:0.8 ml/min，采用二元梯度泵，流動相A為乙腈，流動相B為0.7 %磷酸溶液；梯度洗脫程序:0 ~20 min, 10% A ；20 ~35 min, 10% ~25% A ；35 ~45 min, 40% A ；45 ~55min;10% A。
【文檔編號】G01N30/02GK103969362SQ201410093362
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年3月14日 優先權日:2014年3月14日
【發明者】薛南冬, 劉博 , 張石磊, 李發生, 陳宣宇, 孟磊 申請人:中國環境科學研究院
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