一種檢測乙酰甲胺磷的方法和試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種檢測樣品中痕量乙酰甲胺磷的方法，并提供了試劑盒。利用多巴胺氧化聚合法，在載體材料上合成可特異性結合乙酰甲胺磷的人工抗體（分子印跡聚合物，MIP），用MIP特異性分離富集不同樣品中的痕量乙酰甲胺磷后，利用酶抑制-化學發光法測定所富集的乙酰甲胺磷含量。MIP對溫度、有機溶劑耐受性高，可直接特異性分離富集不同樣品中的痕量乙酰甲胺磷，去除其他有機磷農藥、葉綠素等多種干擾物的影響。通過將MIP特異性樣品預處理與酶抑制法有機結合，MIP-酶抑制法不僅可利用酶抑制法特異性快速檢測某種農藥，還可提高檢測靈敏度和特異性，可直接、快速、靈敏、高通量地檢測環境和食品中的痕量靶農藥。
【專利說明】一種檢測乙酰甲胺磷的方法和試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明屬于分子印跡技術和農藥殘留快速檢測【技術領域】，具體涉及一種乙酰甲胺磷人工抗體(MIP)的制備，以及將MIP與酶抑制-化學發光法有機結合，所建立的集特異性樣品預處理和酶抑制-化學發光法檢測于一體，可特異、快速、靈敏、高通量地檢測樣品中痕量乙酰甲胺磷的新方法:MIP-酶抑制法，并提供相應的檢測試劑盒。
技術背景
[0002]有機磷農藥是我國目前使用量最大的一類農藥，自從2007年I月I日我國全面禁用甲胺磷等5種中高毒有機磷農藥以來，乙酰甲胺磷因其低毒、安全、廣譜、持效期長、大田應用效果好等優勢，作為甲胺磷的替代農藥，廣泛應用于農業生產實踐中。但是乙酰甲胺磷在環境中仍然有殘留風險(我國規定，乙酰甲胺磷在蔬菜中的最大殘留限量為lmg/kg)，人們在食用殘留有乙酰甲胺磷的農產品和食品后，會在體內蓄積，甚至發生急性中毒，危害人體健康和生命安全。因此，如何快速檢測出環境中乙酰甲胺磷的殘留量，對保證食品安全、保障人群健康具有重要意義。
[0003]目前乙酰甲胺磷的檢測方法主要有色譜法(氣相或液相色譜)、質譜法、ELISA法、酶抑制法等。色譜及質譜法靈敏度高，可區分具體的農藥種類，但費用相對昂貴，樣品前處理過程復雜，需要昂貴的儀器設備，無法用于現場檢測。ELISA法靈敏度高、特異性強，但小分子農藥的抗體制備難度較大，且抗體穩定性差，對熱、pH、鹽濃度等有嚴格要求，多用于檢測血樣中的有機磷農藥；食品和環境樣品需要經過預處理，去除干擾物后，才能保證ELISA檢測的靈敏度和特異性，不宜用于現場直接快速檢測。酶抑制法快速，操作簡便，目前廣泛用于現場檢測；但特異性差，樣品中的葉綠素等物質對檢測的干擾很大，僅能判斷樣品中是否含有可抑制膽堿酯酶的有機磷或氨基甲酸酯農藥，不能判斷出具體的農藥品種及各種農藥的量。
[0004]為提高酶抑制法的靈敏度，耦合酶促反應的化學發光法(簡稱為酶抑制-化學發光法)通過化學發光法測定酶抑制水平，可有效提高酶抑制法的靈敏度。具有靈敏度高、檢測限低的優點(M.Guardigli et al.Chemiluminescent high-throughputmicroassay for evaluation of acetylcholinesterase inhibitors.Analytica ChimicaActa.2005, 535，139-144)。但本方法同樣具有酶抑制法缺乏特異性、抗干擾能力差、往往只能定性測定樣品中是否存在有機磷農藥或氨基甲酸酯農藥，無法確定某種農藥的含量等缺點。
[0005]針對酶抑制-化學發光法缺乏特異性、抗干擾能力差等缺點，若能采用特異性樣品預處理方法，首先特異性富集某種農藥(如乙酰甲胺磷)同時去除干擾物，然后用酶抑制-化學發光法快速檢測所富集的靶農藥，則可快速靈敏地測定樣品中某種特定的農藥種類和含量。人工抗體(MIP)因具有特異識別能力、耐受性好等特點，在化學分析等許多領域已得到廣泛應用。Shen等以MAA作為功能單體、EGDMA為交聯齊U、AIBN為引發劑，合成了甲胺磷、乙酰甲胺磷的MIP，結果表明，MIP對相應的模板分子有很強的特異性識別和吸附能力(Zhong-Lan shen et al.Study on the BindingCharacteristic of Methamidophos-specific Molecularly Imprinted Polymer and theInteractions between Template and Monomers.Journal of the Chinese ChemicalSociety.2008，55，587-593)。Wei等以乙酰甲胺磷為模板分子，甲基丙烯酸為功能單體，在SPR傳感芯片上合成了超薄的MIP膜，結果表明，含MIP的SPR芯片可準確檢測出兩種樣品中的乙酸甲胺憐濃度，回收率為96.6-98% (C.Wei et al.Ultrasensitively sensingacephate using molecular imprinting techniques on a surface plasmon resonancesensor.Talanta.2011，83，1422 - 1427)。可見，MIP技術在乙酰甲胺磷檢測的樣品預處理和快速檢測上有很好的應用前景，但上述研究中的MIP僅限應用于固相萃取，或檢測需要復雜的儀器(如SPR儀)，尚無將MIP和酶抑制法有機結合，快速測定某種靶農藥的報道。
[0006]如果將MIP與酶抑制-化學發光法聯合使用，利用MIP的特異性吸附能力，在特異高效地富集樣品中的痕量乙酰甲胺磷的同時去除干擾物，然后利用酶抑制-化學發光法快速靈敏地測定所富集的乙酰甲胺磷，實現利用簡單的酶抑制法靈敏、特異、快速地測定某種特定農藥(如乙酰甲胺磷)含量之目的，特異性樣品預處理還可提高酶抑制-化學發光檢測的靈敏度和準確性。目前尚無集樣品預處理和酶抑制法于一體的方法報道，也無酶抑制法可特異性檢測某種農藥的報道。因此，將MIP與酶抑制-化學發光法結合，建立一種集特異性樣品預處理和酶抑制-化學發光檢測于一體的快速檢測方法，不僅可快速準確檢測乙酰甲胺磷，也有望用于其它有機磷或氨基甲酸酯農藥的快速檢測上，在環境、農業、食品等學科中將有很大的應用前景。
【發明內容】
[0007]為克服傳統酶抑制法缺乏特異性、抗干擾能力低、穩定性較差等技術問題，本發明提供一種檢測乙酰甲胺磷的MIP-酶抑制法，可特異、快速、靈敏、高通量地檢測蔬菜和環境樣品中的痕量乙酰甲胺磷。
[0008]本發明公開一種可特異性檢測乙酰甲胺磷的MIP-酶抑制法，其特征在于以多巴胺為功能單體制備的乙酰甲胺磷MIP可特異性分離富集樣品中痕量乙酰甲胺磷，并建立了相應的MIP-酶抑制法試劑盒。
[0009]實現本發明的技術方案是:
[0010]本發明提供的采用多巴胺氧化聚合法在載體材料上合成可特異性結合乙酰甲胺磷的人工抗體(MIP)的方法，包括以下步驟:
[0011]步驟一:聚合反應:
[0012](a)將模板分子乙酰甲胺磷與多巴胺按摩爾比為1:10-50的比例溶于PH=7.6的Tris-HCL緩沖溶液中，混勻的混合液；
[0013](b)加入載體材料，
[0014](c)聚合:室溫下暴露于空氣中48_72h進行聚合；
[0015]空白印跡聚合物(NIP)的合成方法與MIP的合成方法相似，只是在合成過程中不加模板分子；
[0016]步驟二:洗脫模板分子:使用10%冰乙酸的水溶液和三蒸水反復震蕩洗滌載體材料，再得到含MIP的載體材料。即制備得到可特異性結合乙酰甲胺磷的人工抗體(MIP)。[0017]上述方法中所述的載體材料是多孔酶標板、濾膜、納米級微球或微米級微球。所述的濾膜如是硝酸纖維濾膜、醋酸纖維濾膜或濾紙。所述的微球是四氧化三鐵磁性微球或二氧化硅微球；
[0018]在所述的載體材料是多孔酶標板時，在步驟一之步驟(b)中，所述的加入載體材料的具體方法是:將混合液加入到多孔酶標板的孔中；在步驟二中，所述的使用10%冰乙酸的水溶液和三蒸水反復震蕩洗滌載體材料的具體方法是:使用10%冰乙酸的水溶液反復震蕩洗滌多孔酶標板7-14次，每次30-50min，再用三蒸水震蕩洗滌7_14次，每次30_50min，即得到含MIP的酶標板。
[0019]本發明提供的檢測乙酰甲胺磷的試劑盒含有權利要求6所述的可特異性結合乙酰甲胺磷的人工抗體(MIP)。該試劑盒具體可由含MIP的載體材料、乙酰甲胺磷標準溶液(0-200ng/mL)、膽堿酯酶 AChE (500mU/mL)、乙酰膽堿 ATCI (20 μ mol/mL)、膽堿氧化酶 ChOX(lmg/mL)、辣根過氧化物酶HRP (15U/mL)、魯米諾Luminol (I μ mol/mL)組成,所述的含MIP的載體材料按本發明所述的方法制得。
[0020]對本發明所制備的MIP的性能評價，以96孔酶標板為例:
[0021]1、形態評價:掃描電鏡分析顯示酶標板上合成的MIP為均一的高分子膜狀物，厚度為150-750nm,紅外光譜檢測顯示MIP在3100，1600，1000，880和650厘米處具有5個明顯的紅外吸收峰，與多巴胺的特征峰一致，證明在96孔酶標板孔內制備了含多巴胺分子的 MIP。
[0022]2、靜態吸附試驗評價MIP吸附容量:準確吸取300 μ L乙酰甲胺磷標準品水溶液(0.50-100ng/mL)，分別加入到MIP、NIP和空白孔中，25°C室溫下在振蕩器中振蕩IOmin后在37°C恒溫條件下吸附l_6h，用LC-MS測定上清中乙酰甲胺磷的濃度Free (ng/mL)，根據結合前后上清液中乙酰甲胺磷濃度的變化計算每cm2的乙酰甲胺磷結合量Bond(ng/cm2)。以[Bound]/[Free]為縱坐標，[Bound]為橫坐標建立Scatchard曲線，以Scatchard曲線的斜率為平衡解離常數Kd,以公式:[Bound]/[Free] =?([Bound]/Kd) + (Bmax/Kd),計算最大吸附容量Bmax。本發明所制備的MIP的Kd=8.26ng/mL, Bmax=2.07ng/cm2,而陰性對照(NIP)的 Kd=27.78ng/mL, Bmax=L 00ng/cm2。
[0023]3、靜態吸附試驗評價MIP吸附特異性:采用IPB( imprinting-1nduced promotionof binding)值來評價 MIP 的選擇性:IPB=(Cmip?Cnip)/CnipX 100%。其中，Cmip 為與MIP結合的乙酰甲胺磷的量，Cnip為與NIP結合的乙酰甲胺磷的量，得到MIP的IPB值為
1.24-1.93。
[0024]本發明公開了所述MIP-酶抑制法試劑盒的構成和使用方法:試劑盒由含MIP的載體材料(酶標板、濾膜、微球等)、乙酰甲胺磷標準溶液(0-200ng/mL)、膽堿酯酶AChE( 500mU/mL)、乙酰膽堿ATCI (20 μ mol/mL)、膽堿氧化酶ChOX (lmg/mL)、辣根過氧化物酶HRP (15U/mL)、魯米諾Luminol (I μ mol/mL)構成。使用方法包括以下步驟(以96孔酶標板為例):
[0025]步驟一:向所得含MIP的酶標板孔內加入300 μ L乙酰甲胺磷標準溶液或樣品，37°C作用l_6h后用純水洗滌2-3次。
[0026]步驟二:每孔加入120 μ L三蒸水和10-20 μ L膽堿酯酶(AChE) (500mU/mL), 37°C孵育 10-20min。
[0027]步驟三:每孔加入105 μ L含0.1 μ mol/mL魯米諾(luminol), 0.5mg/mL膽堿氧化酶(ChOX)和10U/mL辣根過氧化物酶(HRP)的混合液。
[0028]步驟四:檢測前每孔加入10-20 μ L乙酰膽堿(六1'(:1)(2(^11101/1^)，立即用酶標儀檢測5min內的累積發光值變化，讀數間隔為10s。
[0029]步驟五:確定乙酰甲胺磷濃度。以乙酰甲胺磷對膽堿酯酶的抑制率為縱坐標，乙酰甲胺磷濃度為橫坐標建立標準曲線，其中抑制率=(RLUO-RLU)/RLU0X 100% (RLU0:乙酰甲胺磷濃度為O時的發光值；RLU:不同乙酰甲胺磷濃度下的發光值)。通過測定發光值計算出乙酰甲胺磷的抑制率，根據抑制率與乙酰甲胺磷濃度之間的線性關系，即可確定乙酰甲胺磷的濃度。
[0030]另一方面，本發明還公開了一種特異、快速的乙酰甲胺磷檢測方法，以及所述MIP-酶抑制法檢測樣品中痕量乙酰甲胺磷方面的用途。檢測方法包括下列步驟:
[0031](I)環境樣品或蔬菜樣品的制備；
[0032](2)權利要求1所述MIP-酶抑制試劑盒結合酶標儀檢測上述樣品溶液；
[0033](3)獲得乙酰甲胺磷含量。
[0034]本發明建立了一種集特異性樣品預處理和酶抑制-化學發光檢測于一體，可利用酶抑制法直接檢測樣品中痕量乙酰甲胺磷的檢測新方法:人工抗體-酶抑制法(MIP-酶抑制法)，并提供相應的試劑盒。MIP-酶抑制法利用多巴胺氧化聚合法，在不同載體材料(如多孔酶標板、濾膜(如硝酸纖維濾膜、醋酸纖維濾膜、濾紙等)、納米或微米級微球(如四氧化三鐵磁性微球、二氧化硅微球等)上合成可特異性結合乙酰甲胺磷的人工抗體(又稱分子印跡聚合物，MIP)，用MIP特異性分離富集不同樣品中的痕量乙酰甲胺磷后，利用酶抑制-化學發光法測定所富集的乙酰甲胺磷含量。MIP對溫度、有機溶劑耐受性高，可直接特異性分離富集不同樣品中的痕量乙酰甲胺磷，去除其他有機磷農藥、葉綠素等多種干擾物的影響。通過將MIP特異性樣品預處理與酶抑制法有機結合，MIP-酶抑制法不僅可利用酶抑制法特異性快速檢測某種農藥，還可提高檢測靈敏度和特異性，可直接、快速、靈敏、高通量地檢測環境和食品中的痕量靶農藥。MIP-酶抑制法試劑盒由含MIP的載體材料(如96孔酶標板、濾膜、微球等)、乙酰甲胺磷標準溶液、膽堿酯酶(AChE)、乙酰膽堿(ATCI)、膽堿氧化酶(ChOX)、辣根過氧化物酶(HRP )、魯米諾(LuminoI)構成。試劑盒對環境和食品中乙酰甲胺磷的檢測靈敏度為1-2.5ng/mL,日內偏差為7.10-16.81%，日間偏差為3.98-7.42%，批次間偏差為4.04-7.25%，可特異、靈敏、高通量地測定環境和食品中的乙酰甲胺磷。
[0035]本發明中用于檢測乙酰甲胺磷的酶抑制-化學發光法，其原理為:膽堿酯酶水解乙酰膽堿生成膽堿，膽堿被膽堿氧化酶氧化生成甜菜堿和H202，后者在辣根過氧化物酶的作用下作為與魯米諾反應產生光子，而有機磷農藥對膽堿酯酶有抑制作用，以致乙酰膽堿無法被水解生成膽堿，連鎖反應被封閉，化學發光值相應降低，發光值的降低與乙酰甲胺磷在一定濃度范圍內呈線性關系，根據發光值的抑制率變化即可測定樣品中乙酰甲胺磷的含量。
[0036]眾所周知，酶抑制法具有簡單、檢測快速、靈敏等特點，但是因為特異性差和抗干擾能力差而無法準確測定某種農藥含量。本發明所制備的人工抗體(MIP)在制備的過程中能形成與乙酰甲胺磷大小和形狀相匹配的立體空腔，并具有特定的非共價結合鍵，能在室溫下特異性地結合乙酰甲胺磷，因而可快速且特異地分離和富集各種樣品中的乙酰甲胺磷。利用MIP的仿生識別能力，建立MIP-酶抑制法，MIP特異性分離富集不同樣品中的痕量乙酰甲胺磷后，使用酶抑制-化學發光法測定所富集的乙酰甲胺磷。MIP可有效去除樣品中的雜質，保證酶抑制-化學發光可特異、靈敏、準確地測定乙酰甲胺磷。MIP-酶抑制法集選擇性樣品預處理和靈敏快速的酶抑制-化學發光檢測于一體，可直接檢測不同樣品中痕量乙酰甲胺磷，特異、靈敏、快速、穩定，特別適合用于現場快速測定復雜樣品如食品和環境樣品中痕量乙酰甲胺磷，在痕量農藥的檢測中具有十分廣泛的應用價值。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0037]載體材料以96孔酶標板為例。
[0038]圖1為本發明制備的MIP和空白對照。左側(A1-H6)為未經任何處理的孔(空白對照)，右側(A7-H12)為MIP的孔。顯示MIP的孔內有棕黑色的MIP膜。
[0039]圖2為本發明制備的MIP的掃描電鏡圖。圖2a為空白，圖2b為MIP，圖2c為NIP(陰性對照)。與空白相比，所制得的MIP和NIP均為高分子膜狀物，且MIP較NIP分布均一。
[0040]圖3a為空白酶標板的傅里葉變換紅外光譜(FT-1R)圖譜，圖3b為本發明制備的MIP的FT-1R圖譜，其縱坐標為吸光度，橫坐標為波數(厘米―1)。FT-1R證實了酶標板表面確實是含多巴胺分子的MIP (圖3b)。與空白相比，MIP和NIP在3100，1600，1000，880和650厘米―1處具有5個明顯的紅外吸收峰，分別代表C-H的伸縮振動，芳烴的骨架振動，N-H的面外彎曲振動，C-H的面外彎曲振動以及O-H的面外彎曲振動，與多巴胺的特征峰一致，證明本發明在96孔酶標板孔內制備了含多巴胺分子的MIP。
[0041]圖4為MIP-酶抑制法檢測乙酰甲胺磷的化學發光動力曲線圖，縱坐標為不同乙酰甲胺磷濃度下(0-200ng/mL)的發光強度；橫坐標為時間(時:分:秒)(HH:麗:SS)。其中，乙酰甲胺磷濃度從上 往下，分別為:0，2.5，5，10，20，100，200ng/mL)。可看出，乙酰甲胺磷的濃度越高，得到的化學發光平衡值越低。說明乙酰膽堿對膽堿酯酶的抑制作用使酶促反應受到影響，因此檢測到的化學發光值相應降低。通過測定發光值的降低，即可確定樣品中含有的乙酰甲胺磷含量，從而定量測定乙酰甲胺磷。
[0042]圖5為MIP-酶抑制法測定乙酰甲胺磷的標準曲線，圖中:Y:利用發光平衡值計算出乙酰甲胺磷對膽堿酯酶的抑制率，抑制率=(RLUO-RLU)/RLUO*100 (RLU:不同乙酰甲胺磷濃度下的發光值；RLU0:乙酰甲胺磷濃度為O時的發光值)；X:乙酰甲胺磷濃度(ng/mL)。縱坐標為不同濃度的乙酰甲胺磷對膽堿酯酶的抑制率；橫坐標為標準品乙酰甲胺磷濃度。隨著乙酰甲胺磷濃度的增加，其抑制率增加，抑制率與乙酰甲胺磷濃度在2.5~200ng/mL范圍內存在較好的線性關系。通過測定發光值計算出乙酰甲胺磷的抑制率，即可定量測定樣品中乙酰甲胺磷含量。
[0043]圖6為本發明方法流程圖，圖中各物質為:
[0044]
【權利要求】
1.一種采用多巴胺氧化聚合法在載體材料上合成可特異性結合乙酰甲胺磷的人工抗體(MIP)的方法，包括以下步驟: 步驟一:聚合反應: Ca)將模板分子乙酰甲胺磷與多巴胺按摩爾比為1:10-50的比例溶于PH=7.6的Tris-HCL緩沖溶液中，混勻的混合液； (b)加入載體材料， (c)聚合:室溫下暴露于空氣中48-72h進行聚合； 步驟二:洗脫模板分子:使用10%冰乙酸的水溶液和三蒸水反復震蕩洗滌載體材料，再得到含MIP的載體材料。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的所述的載體材料是多孔酶標板、濾膜、納米級微球或微米級微球。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述的濾膜如是硝酸纖維濾膜、醋酸纖維濾膜或濾紙。
4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述的微球是四氧化三鐵磁性微球或二氧化硅微球。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的載體材料是多孔酶標板，在步驟一之步驟(b)中，所述的加入載體材料的具體方法是:將混合液加入到多孔酶標板的孔中；在步驟二中，所述的使用10%冰乙酸的水溶液和三蒸水反復震蕩洗滌載體材料的具體方法是:使用10%冰乙酸的水溶液反復震蕩洗滌多孔酶標板7-14次，每次30-50min，再用三蒸水震蕩洗滌7-14次，每次30-50min，即得到含MIP的酶標板。
6.按權利要求1所述方法制備的可特異性結合乙酰甲胺磷的人工抗體(MIP)。
7.—種檢測乙酰甲胺磷的試劑盒，它有權利要求6所述的可特異性結合乙酰甲胺磷的人工抗體(MIP)。
8.—種檢測乙酰甲胺磷的試劑盒，由含MIP的載體材料、乙酰甲胺磷標準溶液(0-200ng/mL)、膽堿酯酶 AChE(500mU/mL)、乙酰膽堿 ATCI (20 μ mol/mL)、膽堿氧化酶 ChOX(lmg/mL)、辣根過氧化物酶HRP (15U/mL)、魯米諾Luminol (I μ mol/mL)組成,所述的含MIP的載體材料按權利要求1所述的方法制得。
【文檔編號】G01N33/531GK103837523SQ201410072679
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2014年2月28日 優先權日:2014年2月28日
【發明者】呂斌, 王雪娟, 劉燕婕, 石云 申請人:華中科技大學
專業數控銑床產品供應商
20年生產經驗，實力工廠，精工品質，質量有保障
