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反相-高效液相色譜對(duì)人體血液和尿液中草酸濃度的測(cè)定方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種反相-高效液相色譜測(cè)定人體血液和尿液中草酸濃度的方法，屬于用色譜法分析材料領(lǐng)域，本發(fā)明包括血液和尿液的預(yù)處理、血液和尿液的衍生處理、高效液相色譜操作條件、草酸工作曲線的制備以及血液和尿液中草酸含量的測(cè)定。本發(fā)明以鄰苯二胺為衍生劑，與尿液與血液中草酸反應(yīng)，生成具有強(qiáng)紫外吸收化合物——2，3-二羥基喹喔啉，此衍生物在314nm有強(qiáng)吸收峰，且與草酸具有一一對(duì)應(yīng)的濃度關(guān)系，草酸的保留時(shí)間為7.2min，此峰高與濃度具有良好的線性關(guān)系，因而能準(zhǔn)確測(cè)定人體尿液與血液中草酸的含量。本發(fā)明方法簡(jiǎn)單快速，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠，為檢測(cè)草酸濃度提供了良好的檢測(cè)手段。
【專利說明】[0001] 反相-高效液相色譜對(duì)人體血液和尿液中草酸濃度的測(cè)定 方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本發(fā)明屬于用色譜法分析材料領(lǐng)域，具體涉及一種反相-高效液相色譜對(duì)人體血 液和尿液中草酸濃度的測(cè)定方法。

【背景技術(shù)】
[0003] 草酸，即乙二酸，是最簡(jiǎn)單的有機(jī)二元酸之一，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)式為H00CC00H。它一般是無 色透明結(jié)晶，對(duì)人體有害，會(huì)使人體內(nèi)的酸堿度失去平衡，影響兒童的發(fā)育等。草酸遍布于 自然界，常以草酸鹽形式存在，幾乎所有的植物都含有草酸鹽。
[0004] 據(jù)Doseh 1979年總結(jié)，人體體液內(nèi)草酸濃度檢測(cè)方法有氧化滴定法、比色法、原 子吸收光譜法、酶分析法、極譜描記法、同位素稀釋法、離子特異性電極法和各種色譜法等。 而高效液相色譜法（HPLC)憑借其靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、重現(xiàn)性好等優(yōu)勢(shì)特點(diǎn)而倍受研究者 的青睞，尤其對(duì)大量樣本的檢測(cè)高效液相色譜法可能是更好的選擇。
[0005] 對(duì)將要使用高效液相色譜法檢測(cè)成分的樣本是有一定要求的，必須除去樣本中大 量的蛋白等雜質(zhì)，一般使用流動(dòng)相溶解樣本并必須過〇.45um或更細(xì)的膜，否則會(huì)對(duì)柱子造 成損害，甚至無法完成實(shí)驗(yàn)。無論尿中、血中抑或其它物質(zhì)中的草酸，如果選定了正確的方 法學(xué)，只是將各樣本前期處理好，均可采用此方法進(jìn)行監(jiān)測(cè)。近幾年有關(guān)草酸測(cè)定的文獻(xiàn)， 不乏使用離子色譜法、分光光度色譜法等監(jiān)測(cè)草酸。而使用高效液相色譜法測(cè)定草酸流動(dòng) 相一般使用磷酸二氫鉀，由于該流動(dòng)相從柱子上洗脫的成分較多，故出峰繁雜。而要測(cè)定的 目標(biāo)成分草酸出峰情況并不明顯，只是夾雜在諸峰之中，無法達(dá)到非常精確的要求。同時(shí)， 由于雜質(zhì)峰較多故出峰時(shí)間較長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)一個(gè)樣本需要30分鐘以上。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的高效液相色譜法測(cè)定草酸出峰情況并不明顯、 雜峰多且出峰時(shí)間較長(zhǎng)的缺點(diǎn)而提出的，其目的是提供一種反相-高效液相色譜測(cè)定人體 血液和尿液中草酸濃度的方法。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案是： 一種反相-高效液相色譜對(duì)人體血液和尿液中草酸濃度的測(cè)定方法，包括以下步驟： a. 樣品預(yù)處理 ① 血液預(yù)處理，禁食12h后上肢靜脈血3ml，加入肝素抗凝后，4°C離心，取上層血漿 lml，加入lml乙睛和50 μ 1 pH = 7. 0的磷酸鹽緩沖液，混旋，離心，37°C的N2氣流將上層 液中的乙睛蒸發(fā)掉，用去離子水補(bǔ)足液體至lml ; ② 尿液預(yù)處理，24h尿液與濃鹽酸按體積比100:1酸化尿液，置于4°C中備用； b. 樣品衍生處理 ① 血液衍生處理，取經(jīng)預(yù)處理的血漿上清液0. 5ml于帶蓋離心管中，加入5 μ 1濃鹽酸 和0. 5ml 10g/L的鄰苯二胺標(biāo)準(zhǔn)液，140°C加熱30min，室溫冷卻，用5mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié) 其pH值為5-6,離心后的上清液經(jīng)0. 22 μ m微孔濾膜過濾后，上機(jī)測(cè)定； ② 尿液衍生處理，取經(jīng)預(yù)處理的尿液lml于帶蓋離心管中，加入5μ 1濃鹽酸和0. 5ml l〇g/L的鄰苯二胺標(biāo)準(zhǔn)液，140°C加熱30min，室溫冷卻，用5mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)其pH值 為5-6,離心后的上清液過0. 22 μ m微孔濾膜過濾后，上機(jī)測(cè)定； c. 高效液相色譜操作條件 儀器：Aligent 1100型高效液相色譜儀；色譜柱：150_X4. 6_，5 μ m，Agilent XDBC18 ;予頁柱：4. 6mmX 12. 5mm, 5 μ m, Agilent Zorbax extend- C18 ； 流動(dòng)相組成體積比：甲醇：醋酸胺水溶液=15:85 ;流速：1. 2ml ;檢測(cè)器：紫外可 見光多波長(zhǎng)檢測(cè)器；柱溫：26. 3°C ;進(jìn)樣量：50 μ L ;草酸的保留時(shí)間：7. 2min ; d. 草酸工作曲線的制備 取正常人經(jīng)預(yù)處理的血漿，另取正常人經(jīng)衍生處理的尿液，分別制成草酸血漿溶液 以及草酸尿溶液，濃度均分別為 125 mg/L，62.5 mg/L，31.25 mg/L，15.625 mg/L，7.813 mg/L，1.953mg/L;對(duì)各個(gè)濃度的草酸血漿溶液、草酸尿溶液、空白血漿、空白尿液進(jìn)行衍 生處理后，進(jìn)行色譜分析，以峰面積A對(duì)濃度C進(jìn)行線性回歸，得血液中草酸工作曲線： A=12. 8289C+3. 239, r=0. 9995 ;尿液中草酸工作曲線：A=11. 343C+56. 599, r=0. 9993 ； e. 血液和尿液中草酸含量的測(cè)定 將經(jīng)過衍生處理的待測(cè)血液和尿液樣品上機(jī)測(cè)定，根據(jù)待測(cè)血液和尿液樣品的對(duì)應(yīng)峰 面積由工作曲線計(jì)算出待測(cè)血液和尿液樣品中草酸的濃度。
[0008] 所述磷酸鹽選自磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鈉或磷酸二氫鉀中的一種或 其混合物。
[0009] 所述血液和尿液樣品制備時(shí)是在2000-2300r/min離心10-15min條件下進(jìn)行的。
[0010] 所述步驟流動(dòng)相中醋酸胺水溶液的濃度為〇. lmol/L。
[0011] 所述紫外可見光多波長(zhǎng)檢測(cè)器的檢測(cè)波長(zhǎng)314nm。
[0012] 所述血液中草酸工作曲線和尿液中草酸工作曲線均在1.953?125 mg .171范圍 內(nèi)，峰面積與草酸濃度呈線性關(guān)系，按照信噪比3/1，最低檢測(cè)濃度為0. 5 mg/L。
[0013] 本發(fā)明的有益效果是： 本發(fā)明以鄰苯二胺為衍生劑，與尿液與血液中草酸反應(yīng)，生成具有強(qiáng)紫外吸收化合 物--2, 3-二羥基喹喔啉，此衍生物在314nm有強(qiáng)吸收峰，且與草酸具有--對(duì)應(yīng)的濃度 關(guān)系，草酸的保留時(shí)間為7. 2min，此峰高與濃度具有良好的線性關(guān)系，因而能準(zhǔn)確測(cè)定人體 尿液與血液中草酸的含量。本發(fā)明方法簡(jiǎn)單快速，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠，為檢測(cè)草酸濃度提供了良 好的檢測(cè)手段。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014] 圖1是利用本發(fā)明的檢測(cè)方法所得尿液草酸標(biāo)準(zhǔn)液色譜圖； 圖2是利用本發(fā)明的檢測(cè)方法所得人體尿液中草酸色譜圖； 圖3是利用本發(fā)明的檢測(cè)方法所得血漿草酸標(biāo)準(zhǔn)液色譜圖； 圖4是利用本發(fā)明的檢測(cè)方法所得人體血漿中草酸色譜圖。

【具體實(shí)施方式】
[0015] 下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明： 一種反相-高效液相色譜測(cè)定人體血液和尿液中草酸濃度的方法，采用反相-高效液 相色譜衍生法，以鄰苯二胺為衍生劑，包括以下步驟： a.樣品預(yù)處理 ①血液預(yù)處理： 禁食12h后抽取上肢靜脈血3ml，加入肝素抗凝后，立即以2300r/min于4°C離心 lOmin，取上層血漿lml，向其中加入lml乙睛和50 μ 1 pH = 7.0的磷酸鹽緩沖液，混旋后再 以2000r/min離心15min，37°C的N2氣流將上層液中的乙睛蒸發(fā)掉，用去離子水補(bǔ)足液體至 lml ； pH = 7. 0的磷酸鹽緩沖液的配制：取磷酸二氫鉀0. 68g，加0. lmol/L氫氧化鈉溶液 29. lml，用水稀釋至100ml，即得。
[0016] ②尿液預(yù)處理： 收集24h尿液，按照尿液與濃鹽酸的體積比100 :1酸化尿液，酸化完成的尿液置于4°C 中備用； 濃鹽酸為市售質(zhì)量分?jǐn)?shù)為37. 5%的鹽酸。
[0017] b.樣品衍生處理 ① 血液衍生處理，取經(jīng)預(yù)處理的血漿上清液0. 5ml，于帶蓋離心管中，加入5 μ 1濃鹽 酸和0. 5ml 10g/L的鄰苯二胺標(biāo)準(zhǔn)液，旋緊蓋子于140°C加熱30min，室溫冷卻，用5mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)其pH值為5-6,再以2000r/min離心15min，離心后的上層清液經(jīng)0. 22 μ m微 孔濾膜過濾后，即可上機(jī)進(jìn)行測(cè)定； ② 尿液衍生處理，取經(jīng)預(yù)處理的尿液lml,于帶蓋離心管中，加入5μ 1濃鹽酸和0. 5ml l〇g/L的鄰苯二胺標(biāo)準(zhǔn)液，旋緊蓋子于140°C加熱30min，室溫冷卻，用5mol/L NaOH溶液調(diào) 節(jié)其pH值為5-6,再以2300r/min離心15min，離心后的上層清液過0. 22 μ m微孔濾膜過濾 后，即可上機(jī)進(jìn)行測(cè)定； c. 高效液相色譜操作條件 儀器：Aligent 1100型高效液相色譜儀； 色譜柱：150mmX 4. 6mm，5 μ m，Agilent XDBC18 ; 予頁柱：4. 6mmX 12. 5mm，5 μ m，Agilent Zorbax extend- C18 ； 流動(dòng)相組成體積比：甲醇：醋酸胺水溶液=15:85 ; 其中醋酸胺水溶液的濃度為〇. lmol/L ; 流速：1. 2ml · mirT1 ; 檢測(cè)器：紫外可見光多波長(zhǎng)檢測(cè)器，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)314nm ; 柱溫：26. 3°C ; 進(jìn)樣量：50yL ; d. 草酸工作曲線的制備 ①血液中草酸工作曲線的制備，取正常人經(jīng)預(yù)處理的血漿8ml，用血漿制成濃度分別為 125 mg/L，62.5 mg/L，31.25 mg/L，15. 625 mg/L，7.813 mg/L，1.953mg/L 草酸溶液；對(duì)各個(gè) 濃度的草酸溶液和空白血漿進(jìn)行衍生處理后，進(jìn)行色譜分析； 以峰面積A對(duì)濃度C進(jìn)行線性回歸，得工作曲線：A=12. 8289C+3. 239， r=0. 9995 ； 在1. 953?125 mg/L范圍內(nèi)，峰面積與草酸濃度呈線性關(guān)系 按信噪比3/1得最低檢測(cè)濃度為0. 3 mg/L ; ②尿液中草酸工作曲線的制備 取正常人經(jīng)衍生處理的尿液，用尿液制成濃度分別為125mg/L，62. 5mg/L，31. 25mg/L， 15. 625mg/L，7. 813mg/L和1. 953 mg/L草酸溶液；對(duì)各個(gè)濃度的草酸溶液和空白尿液進(jìn)行 衍生處理后，進(jìn)行色譜分析； 以峰面積A對(duì)濃度C (mg/L)進(jìn)行線性回歸，得工作曲線：A=11. 343C+56. 599， r=0. 9993 ； 在1. 953?125 mg/L范圍內(nèi)，峰面積與草酸濃度呈線性關(guān)系； 按照信噪比3/1，最低檢測(cè)濃度為0. 5 mg/L; e.血液和尿液中草酸含量的測(cè)定 將經(jīng)過衍生處理的待測(cè)血液和尿液樣品上機(jī)測(cè)定，根據(jù)待測(cè)血液和尿液樣品的對(duì)應(yīng)峰 面積由工作曲線計(jì)算出待測(cè)血液和尿液樣品中草酸的濃度。
[0018] 檢測(cè)結(jié)果： 一、色譜分離圖 (一）尿液中草酸色譜分離圖 分別對(duì)草酸標(biāo)準(zhǔn)液，人體尿液進(jìn)行色譜分離，結(jié)果見附圖1和2。從圖中所示可知：草 酸的分離均能達(dá)到基線分離，而且尿樣中草酸的測(cè)定無明顯雜質(zhì)干擾。草酸的保留時(shí)間為 7. 2min〇
[0019] (二）血液中草酸色譜分離圖 分別對(duì)草酸標(biāo)準(zhǔn)液，人體血漿進(jìn)行色譜分離，見附圖3和4。從圖中所示可知：草酸的 分離均能達(dá)到基線分離，血中草酸的測(cè)定無明顯雜峰干擾，草酸的保留時(shí)間為7. 2min。
[0020] 二、精密度試驗(yàn) (一） 尿液中草酸精密度試驗(yàn) 按樣本處理法操作，對(duì)尿樣本進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)（η = 5)，并經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。結(jié)果顯示：樣 本測(cè)定重復(fù)性均較好，見表1. 表1尿液中草酸精密度實(shí)驗(yàn)

【權(quán)利要求】
1. 一種反相-高效液相色譜對(duì)人體血液和尿液中草酸濃度的測(cè)定方法，其特征在于： 包括以下步驟： a. 樣品預(yù)處理 ① 血液預(yù)處理，禁食12h后上肢靜脈血3ml，加入肝素抗凝后，4°C離心，取上層血漿 lml，加入lml乙睛和50 μ 1 pH = 7. 0的磷酸鹽緩沖液，混旋，離心，37°C的N2氣流將上層 液中的乙睛蒸發(fā)掉，用去離子水補(bǔ)足液體至lml ; ② 尿液預(yù)處理，24h尿液與濃鹽酸按體積比100:1酸化尿液，置于4°C中備用； b. 樣品衍生處理 取經(jīng)預(yù)處理的血漿上清液0. 5ml，另取經(jīng)預(yù)處理的尿液lml，分別置于帶蓋離心管中進(jìn) 行衍生處理，所述衍生處理是向離心管中加入5 μ 1濃鹽酸和0. 5ml 10g/L的鄰苯二胺標(biāo)準(zhǔn) 液，140°C加熱30min，室溫冷卻，用5mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)其pH值為5-6,離心后的上清液 經(jīng)0. 22 μ m微孔濾膜過濾后，上機(jī)測(cè)定； c. 高效液相色譜操作條件 儀器：Aligent 1100型高效液相色譜儀；色譜柱：150_X4. 6_，5 μ m，Agilent XDBC18 ;予頁柱：4. 6mmX 12. 5mm, 5 μ m, Agilent Zorbax extend- C18 ； 流動(dòng)相組成體積比：甲醇：醋酸胺水溶液=15:85 ;流速：1. 2ml ;檢測(cè)器：紫外可 見光多波長(zhǎng)檢測(cè)器；柱溫：26. 3°C ;進(jìn)樣量：50 μ L ;草酸的保留時(shí)間：7. 2min ; d. 草酸工作曲線的制備 取正常人經(jīng)預(yù)處理的血漿，另取正常人經(jīng)衍生處理的尿液，分別制成草酸血漿溶液 以及草酸尿溶液，濃度均分別為 125 mg/L，62.5 mg/L，31.25 mg/L，15.625 mg/L，7.813 mg/L，1.953mg/L;對(duì)各個(gè)濃度的草酸血漿溶液、草酸尿溶液、空白血漿、空白尿液進(jìn)行衍 生處理后，進(jìn)行色譜分析，以峰面積A對(duì)濃度C進(jìn)行線性回歸，得血液中草酸工作曲線： A=12. 8289C+3. 239, r=0. 9995 ;尿液中草酸工作曲線：A=11. 343C+56. 599, r=0. 9993 ； e. 血液和尿液中草酸含量的測(cè)定 將經(jīng)過衍生處理的待測(cè)血液和尿液樣品上機(jī)測(cè)定，根據(jù)待測(cè)血液和尿液樣品的對(duì)應(yīng)峰 面積由工作曲線計(jì)算出待測(cè)血液和尿液樣品中草酸的濃度。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種反相-高效液相色譜測(cè)定人體血液和尿液中草酸濃度的 方法，其特征在于：所述磷酸鹽選自磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鈉或磷酸二氫鉀中 的一種或其混合物。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種反相-高效液相色譜測(cè)定人體血液和尿液中草酸濃度的 方法，其特征在于：所述血液和尿液樣品制備時(shí)是在2000-2300r/min離心10-15min條件下 進(jìn)行的。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種反相-高效液相色譜測(cè)定人體血液和尿液中草酸濃度的 方法，其特征在于：所述步驟流動(dòng)相中醋酸胺水溶液的濃度為0. lmol/L。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種反相-高效液相色譜測(cè)定人體血液和尿液中草酸濃度的 方法，其特征在于：所述紫外可見光多波長(zhǎng)檢測(cè)器的檢測(cè)波長(zhǎng)314nm。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種反相-高效液相色譜測(cè)定人體血液和尿液中草酸濃度 的方法，其特征在于：所述血液中草酸工作曲線和尿液中草酸工作曲線均在1. 953?125 mg · Γ1范圍內(nèi)，峰面積與草酸濃度呈線性關(guān)系，按照信噪比3/1，最低檢測(cè)濃度為0. 5 mg/
【文檔編號(hào)】G01N30/89GK104101679SQ201410355066
【公開日】2014年10月15日 申請(qǐng)日期:2014年7月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月24日
【發(fā)明者】劉宏勝, 徐新女, 吳勝群, 王玉亮, 王樹森, 劉濤 申請(qǐng)人:天津市第一中心醫(yī)院