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同型半胱氨酸（Hcy）測定方法及測定試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種同型半胱氨酸濃度的測定方法，原理是氧化型Hcy被轉(zhuǎn)化成游離Hcy，游離Hcy在CBS催化下和絲氨酸反應(yīng)生成L-胱硫醚。L-胱硫醚在CBL催化下又生成Hcy、丙酮酸和NH3。該循環(huán)反應(yīng)生成的丙酮酸可以用乳酸脫氫酶LDH和NADH檢測到，NADH轉(zhuǎn)變成NAD的速率與樣品中Hcy含量成正比。在340nm處測定NADH+降低速率可以測得同型半胱氨酸的含量。本發(fā)明還提供一種高靈敏度同型半胱氨酸濃度的測定試劑盒。
【專利說明】同型半胱氨酸(Hcy )測定方法及測定試劑盒
[0001]
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及醫(yī)學檢驗測定【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種同型半胱氨酸測定方法及測定試劑盒。
[0003]
【背景技術(shù)】
[0004]目前，測定血漿中同型半胱氨酸濃度的方法有很多，包括循環(huán)酶法、FPIA法、高效液相色譜法(HPLC )、酶聯(lián)免疫分析法(EIA )等。
[0005]1.循環(huán)酶法。測定血清Hcy可用于全自動生化分析儀，其反應(yīng)原理在膦氯化氫(TCEP)作用下氧化型Hcy轉(zhuǎn)化為游離型Hcy與共價底物S-腺苷甲硫氨酸SAM催化反應(yīng)形成甲硫氨酸與S-腺苷同型半胱氨酸SAH。SAH被SAH水解酶水解成腺苷和Hcy，形成的Hcy可以循環(huán)加入反應(yīng)，從而放大了檢測信號，腺苷立即水解為次黃嘌呤和氨，氨在谷氨酸脫氫酶的作用下使NADH轉(zhuǎn)化為NAD+，樣本中的Hey濃度與NADH的變化成正比。測定主要影響因素為血氨，當血氨濃度<50umol / L時，Hey測定值與原始值的偏差〈10% ;當血氨>70umol / L時，測定值與原始值的偏差>10%。
[0006]2.FPIA法。測定原理是先用二硫蘇糖醇將標本中結(jié)合態(tài)的Hcy還原成游離形式后，同時加入腺苷，在S-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶的作用下將Hcy轉(zhuǎn)化為S-腺苷-L-同型半胱氨酸(SAH)，然后加入抗SAH單克隆抗體和熒光標記的SAH抗原，SAH與熒光標記抗原競爭結(jié)合抗SAH抗體，形成大分子的免疫復合物，最后測定其熒光偏振度。此方法要求血標本及時送至實驗室，避免血細胞內(nèi)Hcy的釋放對測定結(jié)果的干擾。FPIA法測定Hcy具有較好的精密度，其批內(nèi)CV為1.16%，批間CV為3.12%，均小于4%，與國外文獻報道相近。說明方法可靠，血清與血漿結(jié)果之間具有良好的相關(guān)性。現(xiàn)有多種方法測定Hcy, FPIA法較適合實驗室常規(guī)應(yīng)用。
[0007]3、高效液相色譜法(HPLC ):是經(jīng)典的參考方法，但其操作比較復雜，試驗耗時比較長，試驗數(shù)據(jù)變異比較大，在臨床應(yīng)用方面逐漸被酶聯(lián)免疫分析法、熒光偏振分析法和酶法所取代。高效液相色譜法:先使用還原劑使血樣中所有形式的同型半胱氨酸轉(zhuǎn)變成還原形式，然后與熒光劑進行衍生生成同型半朧氨酸一熒光物質(zhì)復合物，將衍生后的樣品進行色譜分析。因色譜固定相對不同物質(zhì)的吸附力不同，因此流動相將其洗脫下來的次序也不同，根據(jù)這一原理將樣品中的不同物質(zhì)分開，以熒光檢測器檢測洗脫下同型半胱氨酸一熒光物質(zhì)復合物的熒光強度，將其與標準品/內(nèi)標的比值進行比較和計算，就可以測定血總同型半胱氨酸的水平。 [0008]4、酶聯(lián)免疫分析法(EIA ):是臨床上測定同型半朧氨酸水平的常用方法，操作比較方便、快捷，重復性好，方法穩(wěn)定可靠。其缺點是大部分操作還是手工操作，比較耗時。
[0009]CN98807531.8利用同型半胱氨酸酶來測量樣品中同型半胱氨酸含量； CNZ004 10016789.6利用同型半胱氨酸轉(zhuǎn)甲基酶及腺昔同型半胱氨酸酶的循環(huán)擴增作用，再加上腺昔脫氨酶、嘿吟核營磷酸化酶、黃嘿吟氧化酶、過氧化物酶等，或腺營脫氨酶、谷氨酸脫氫酶等顯色反應(yīng)測定同型半胱氨酸含量；
CNZ00510053210.8利用L-蛋氨酸Y-裂解酶作用于同型半胱氨酸使之產(chǎn)生硫化氫后再與瑩光化合物DMPDZHCI作用產(chǎn)生熒光，該方法使用全自動熒光分析儀測試，具有快速、準確、方便的優(yōu)點。其基本分析原理:用基因重組酶將同型半胱氨酸分解，所形成之硫化氫產(chǎn)物再與熒光顯色劑發(fā)生化學反應(yīng)形成可測量的熒光化合物。
[0010]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明的目的是:提供一種測定同型半胱氨酸濃度的方法，以及應(yīng)用該方法配制而成的同型半胱氨酸測定試劑盒。具體技術(shù)方案如下:
一種同型半胱氨酸濃度的測定方法，包括以下步驟:
將待測樣品與含有絲氨酸、胱硫醚β-合酶、胱硫醚β-裂解酶、乳酸脫氫酶和還原型輔酶的試劑混勻，使之發(fā)生以下反應(yīng)，
絲氨睡+同型半胱氨-胱硫醚+Η:01-胱硫醚-同型半胱黃:酸-丙酮酸—NHi
丙酮酸+乳酸+ NAD';
檢測主波長340nm的吸光度的下降速度，測算出同型半胱氨酸濃度大小。
[0012]檢測儀器包括Hitachi7080,Olympus AU400, Beckman LX20, Abbott Aeroset ；Toshiba 120FR, Mindray BS-200, Dimension AR 自動生化分析儀等。
[0013]一種同型半胱氨酸測定試劑盒，它由下述試劑組成:
試劑1:
乳酸脫氫酶(LD)35KU/L ；
絲氨酸(SER)0.71-0.76 mmol/L ；
NADH0.42-0.47 mmol/1 ；
試劑2:
胱硫醚β -合成酶(CBS)18-20KU/L ；
胱硫醚β -分解酶(CBL)8-10KU/L ；
優(yōu)選地，所述試劑盒由下述試劑組成:
試劑1:
乳酸脫氫酶(LD)35KU/L ；
絲氨酸(SER)0.73 mmol/L;
NADH0.45 mmol/1 ；
試劑2:
胱硫醚β -合成酶(CBS)18KU/L ；
胱硫醚β -分解酶(CBL)8KU/L ； 優(yōu)選地，所述試劑盒由下述試劑組成:
試劑1:
乳酸脫氫酶(LD)35KU/L ；
絲氛酸(SER)0.76 mmol/L;
NADH0.47 mmol/1 ；
試劑2:
胱硫醚β -合成酶(CBS )20KU/L ；
胱硫醚β -分解酶(CBL)10KU/L ；
所述試劑盒還可以包括如下緩沖液=Tris-HCL緩沖液，或三乙醇胺緩沖液，或二乙醇胺緩沖液，或2-氨基-2甲基-1-丙醇AMP緩沖液，或甲基葡糖胺ALP緩沖液。
[0014]所述緩沖液優(yōu)選為由12mmol/L pH8.3 Tris-HCL和KCL60mmol/L組成的緩沖液。
[0015]所述試劑盒還可以包括如下穩(wěn)定劑:硫酸銨、甘油、甘露醇、維生素C、丙二醇、疊氮鈉、乙二醇中的至少一種。
[0016]所述穩(wěn)定劑優(yōu)選為甘油和甘露醇的混合物，其中甘油:甘露醇=15:1。
[0017]所述還原型輔酶NADH 還可以是 NADPH、thio-NADH 或 thio_NADPH+。
[0018]所述的同型半胱氨酸測定試劑盒，所述試劑可以配成單劑、雙劑或者三劑。
[0019]單劑:
乳酸脫氫酶(LD)30.33KU/L ；
絲氛酸(SER)0.66 mmol/L;
NADH0.41 mmol/1 ；
胱硫醚β -合成酶(CBS)2.67KU/L ；
胱硫醚β -分解酶(CBL)1.33KU/L。
[0020]
雙劑:
試劑1:
乳酸脫氫酶(LD)35KU/L ；
絲氛酸(SER)0.76 mmol/L;
NADH0.47 mmol/1 ；
試劑2:
胱硫醚β -合成酶(CBS )20KU/L ；
胱硫醚β -分解酶(CBL)10KU/L。
[0021] 三劑
試劑 1:NADH0.47 mmol/1 ；
試劑2:
乳酸脫氫酶(LD)35KU/L ；
絲氛酸(SER)0.76 mmol/L;
試劑3:
胱硫醚β -合成酶(CBS )20KU/L ；
胱硫醚β -分解酶(CBL)10KU/L。[0022]所述的同型半胱氨酸測定試劑盒，可以是液體試劑盒。
[0023]本方法及試劑盒具有測定速度快、靈敏、準確度高、穩(wěn)定性好的優(yōu)點:
分析靈敏度:最低檢出限≤0.Ιμηιο? /L;
分析特異性:回收率在90%_110%內(nèi)；
線性范圍:1.0-100.0 μ mo I /L, r ^ 0.9900;
準確性:相對偏差≤±4.0%;
批內(nèi)精密度:CV≤4.0%;
批間精密度:CV≤5.0%;
因而可以得到切實的推廣應(yīng)用。該方法在普通紫外-可見光分析儀或者半自動、全自動生化分析儀上便可快速檢測，不需要特殊或額外儀器，測試成本低廉，便于行業(yè)內(nèi)推廣應(yīng)用。而且穩(wěn)定性好，經(jīng)_20°C、室溫、37°C穩(wěn)定性考察證明，本發(fā)明試劑盒穩(wěn)定，樣品檢測專一性強，靈敏度高，儲存時間長。
[0024]加入本發(fā)明所述穩(wěn)定劑和緩沖液可以有效提高試劑盒穩(wěn)定性。至少可以保持12小時內(nèi)Hcy含量穩(wěn)定，24小時內(nèi)Hcy濃度增加尚不足4%。緩沖液選12mmol/L pH8.3Tris-HCL和KCL60mmol/L組成的緩沖液，穩(wěn)定劑選甘油:甘露醇=15:1時，穩(wěn)定性最好，可以保持15小時內(nèi)Hcy含量穩(wěn)定，30小時內(nèi)Hcy濃度增加不超過5%。
[0025]
【具體實施方式】
[0026]現(xiàn)通過以下實施例來進一步描述本發(fā)明的有益效果，實施例僅用于例證的目的，不限制本發(fā)明的范圍，同時本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明所做的顯而易見的改變和修飾也包含在本發(fā)明范圍之內(nèi)。
[0027]實施例1 (雙劑)
按以下成分和用量配制同型半胱氨酸測定試劑盒:
試劑1:
乳酸脫氫酶(LD)35KU/L ；
絲氛酸(SER)0.76 mmol/L;
NADH0.47 mmol/1 ；
試劑2:
胱硫醚β -合成酶(CBS )20KU/L ；
胱硫醚β -分解酶(CBL)10KU/L。
[0028]所述試劑1、2還可以包括由12mmol/L pH8.3 Tris-HCL和KCL60mmol/L組成的緩沖液；甘油和甘露醇的混合物，其中甘油:甘露醇=15:1。所述緩沖液和穩(wěn)定劑可以顯著提高試劑盒的穩(wěn)定性。
[0029]檢測方法:
1.基本參數(shù)
方法:速率法樣本/試劑:1/17
主波長:340nm反應(yīng)溫度:37°C
副波長:405nm反應(yīng)時間:IOmin2、測定
空白樣本校準
生理鹽水/Η20(μ1) 16OO
樣本(μL)O16O
校準品(μ I)OO16
試劑 Rl ( μ I)234234234
混勻，37 °C孵育1-5分鐘
試劑 R2 ( μ I)363636
混勻，37°C孵育90秒后，連續(xù)監(jiān)測1-3 min，計算ΛΑ/min
3、結(jié)果計算
【權(quán)利要求】
1.同型半胱氨酸濃度的測定方法，包括以下步驟: 將待測樣品與含有絲氨酸、胱硫醚β-合酶、胱硫醚β-裂解酶、乳酸脫氫酶和還原型輔酶的試劑混勻，使之發(fā)生以下反應(yīng)，
2.—種同型半胱氨酸測定試劑盒，其特征在于它由下述試劑組成:
3.一種同型半胱氨酸測定試劑盒，其特征在于它由下述試劑組成:
4.一種同型半胱氨酸測定試劑盒，其特征在于它由下述試劑組成:
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的同型半胱氨酸測定試劑盒，其特征在于:還可以包括如下緩沖液:Tris_HCL緩沖液,或二乙醇胺緩沖液,或二乙醇胺緩沖液,或2-氨基-2甲基-1-丙醇AMP緩沖液，或甲基葡糖胺ALP緩沖液。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的同型半胱氨酸測定試劑盒，其特征在于:所述緩沖液為由12mmol/L pH8.3 Tris-HCL 和 KCL60mmol/L 組成的緩沖液。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的同型半胱氨酸測定試劑盒，其特征在于:還可以包括如下穩(wěn)定劑:硫酸銨、甘油、甘露醇、維生素C、丙二醇、疊氮鈉和乙二醇中的至少一種。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的同型半胱氨酸測定試劑盒，其特征在于:所述穩(wěn)定劑為甘油和甘露醇的混合物，其中甘油:甘露醇=15:1。
9.權(quán)利要求2-4中任意一項所述同型半胱氨酸測定試劑盒，其特征在于:所述試劑配成單劑、雙劑或者三劑。
10.權(quán)利要求2-4中任意一項所述同型半胱氨酸測定試劑盒，其特征在于:所述試劑盒為液體試劑盒。
【文檔編號】G01N31/22GK103926248SQ201410190202
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年5月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月7日
【發(fā)明者】邢力策, 陳青松, 林耀文 申請人:浙江夸克生物科技有限公司