国产自产21区,亚洲97,免费毛片网,国产啪视频,青青青国产在线观看,国产毛片一区二区三区精品

專利名稱：胎兒細(xì)胞和核酸的鑒定和分離的制作方法
胎兒細(xì)胞和核酸的鑒定和分離本申請要求2007年9月21日提交的美國臨時(shí)申請No. 60/974，392的優(yōu)先權(quán)，在 此完整引入以供參考。
背景技術(shù)：
通常進(jìn)行產(chǎn)前測試或篩選以在妊娠期間確定胎兒性別或檢測胎兒中的遺傳疾病 和/或染色體異常。如今，已了解一或多種有缺陷的基因?qū)е碌挠?000種遺傳疾病。一些 例子包括囊性纖維變性、亨廷頓氏舞蹈病、β型地中海貧血、強(qiáng)直性肌營養(yǎng)不良、鐮狀細(xì)胞 貧血、嚇啉病、和脆性X染色體綜合征。染色體異常是由染色體數(shù)異常、染色體質(zhì)重復(fù)或缺 失、以及染色體結(jié)構(gòu)缺陷導(dǎo)致的。染色體異常的例子有三體性，例如16三體性，在妊娠期頭 三個(gè)月導(dǎo)致流產(chǎn)的主要原因；21三體性(唐氏綜合征)；13三體性(帕塔綜合征)；18三體 性(愛德華綜合征)；克萊恩費(fèi)爾特(氏)綜合征((47、ΧΧΥ)、(47,XYY)、和(47、ΧΧΧ))；染 色體缺失(單體性)，例如特納綜合征(45、Χ0)；染色體易位、缺失和/或微缺失，例如羅伯 遜易位、Angelman綜合征、迪喬治綜合征和午-希二氏綜合征。目前可行的產(chǎn)前遺傳測試通常涉及侵入性方法。例如，在懷孕10-12周左右的孕 婦上進(jìn)行的絨毛膜絨毛采樣(CVS)和在14-16周左右進(jìn)行的羊膜穿刺都包括侵入性方法， 以獲得用于測試胎兒內(nèi)染色體異常的樣品。一般用細(xì)胞遺傳學(xué)或熒光原位雜交(FISH)分 析測試通過這些采樣過程獲得的胎兒細(xì)胞以測試染色體異常。雖然這些方法對(duì)于檢測染色體畸變是有用的，但是已顯示它們會(huì)引起流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)。 因此，僅僅會(huì)對(duì)察覺危險(xiǎn)增加的婦女，例如高齡孕婦(> 35歲)、具有異常母體血清篩選結(jié) 果的或那些先前已經(jīng)有過胎兒染色體異常的婦女建議羊膜穿刺或CVS。由于這些測試，35 歲以上的婦女生出患有染色體畸變，例如唐氏綜合征的嬰兒的百分比大大下降了。然而，缺 乏對(duì)于大多數(shù)孕婦的合適或相對(duì)安全的產(chǎn)前測試或篩選導(dǎo)致了 35歲下婦女中約80%的唐 氏綜合征嬰兒的出生。因此，需要一種對(duì)于孕婦普遍人群的非侵襲性篩選測試，特別是針對(duì)鑒定胎兒染 色體畸變和其它遺傳變異或缺陷的測試。這需要非侵襲性的檢測、分離可用于產(chǎn)前遺傳篩 選的胎兒細(xì)胞和胎兒核酸的技術(shù)。發(fā)明簡述本發(fā)明部分基于核小體表位可用于胎兒細(xì)胞或胎兒核酸的標(biāo)記的發(fā)現(xiàn)。因此，本 發(fā)明提供了針對(duì)這些核小體表位的抗體，含有這些抗體的試劑盒，以及用這些抗體檢測或 分離胎兒細(xì)胞和/或胎兒核酸的方法。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，提供了一種特異性結(jié)合胎兒核小體表位的抗體。在本 發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，提供了含有本發(fā)明抗體的試劑盒。在本發(fā)明的還有一個(gè)實(shí)施例中，提供了適用于測試胎兒遺傳組成的試劑盒。該試 劑盒含有分離的胎兒核酸樣品，該樣品是用本發(fā)明的抗體分離的。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，提供了一種在胎兒的母體獲得的生物樣品中檢測胎 兒核酸和/或胎兒細(xì)胞存在的方法。該方法包括使生物樣品與本發(fā)明的抗體接觸，并檢測 抗體與生物樣品中核小體的結(jié)合。抗體與核小體的特異性結(jié)合說明胎兒核酸和/或胎兒細(xì)胞的存在。在本發(fā)明的還有一個(gè)實(shí)施例中，提供了分離胎兒的核酸的方法。該方法包括通過 使從胎兒母體獲得的宮頸粘液樣品與本發(fā)明的抗體接觸，分離核酸。在本發(fā)明的還有一個(gè)實(shí)施例中，提供了富集胎兒核酸的方法。該方法包括通過使 獲自胎兒母體的宮頸粘液樣品與本發(fā)明的抗體接觸，分離核酸。在本發(fā)明的還有一個(gè)實(shí)施例中，提供了鑒定胎兒遺傳組成的方法。該方法包括根 據(jù)本發(fā)明的方法分離胎兒核酸，并基于分離的胎兒核酸鑒定遺傳組成。在還有一個(gè)實(shí)施例中，提供了一種組合物，含有一種肽和佐劑，該肽含有與SEQ ID NO 1的序列具有至少80%相同性的氨基酸序列。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，提供了制備與胎兒核小體表位特異性結(jié)合的抗體的 方法。該方法包括用含有肽和佐劑的組合物免疫動(dòng)物，該肽含有與SEQ IDNO 1的序列具有 至少80%相同性的氨基酸序列。發(fā)明詳述本發(fā)明部分基于核小體表位可用于胎兒細(xì)胞或胎兒核酸的標(biāo)記的發(fā)現(xiàn)。因此，本 發(fā)明提供了針對(duì)這些核小體表位的抗體，含有這些抗體的試劑盒，以及用這些抗體檢測或 分離胎兒細(xì)胞和/或胎兒核酸的方法。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種與胎兒核小體表位特異性結(jié)合的抗體。本文 所用的術(shù)語“抗體”包括抗體結(jié)合區(qū)、CDR、單鏈抗體、嵌合抗體或人源化抗體。本發(fā)明的抗 體可以是單克隆抗體或多克隆抗體。所述抗體可以是任何同工型，例如IgG、IgM、IgA、IgD、 或 IgE0在一個(gè)實(shí)施例中，胎兒核小體表位可以是任何與獨(dú)特的胎兒染色質(zhì)或胎兒核小體 有關(guān)的表位，或與對(duì)應(yīng)母體表位不同的表位。在另一個(gè)實(shí)施例中，胎兒核小體表位具有與對(duì) 應(yīng)母體表位不同的分子結(jié)構(gòu)(例如一級(jí)、二級(jí)或三級(jí))。在另一個(gè)實(shí)施例中，胎兒核小體中 的胎兒核小體表位比母體核小體中的表位更暴露于、或更容易接觸抗體。在真核細(xì)胞中，有五大類組蛋白，它們是染色質(zhì)的主要蛋白質(zhì)組成。這些是Hl (有 時(shí)稱作接頭組蛋白)、H2A、H2B、H3和H4。一般H2A、H2B、H3和H4組蛋白兩兩裝配，通過 使146堿基對(duì)的DNA繞蛋白質(zhì)軸包裹，形成八聚體核小體核心顆粒。接頭組蛋白Hl和接頭 DNA像把珠穿在線上一樣連接各個(gè)核小體。H3類組蛋白包括四種不同蛋白質(zhì)類型主要類 型H3. 1和H3. 2，替換型H3. 3，和睪丸特異性變體H3t。雖然H3. 1和H3. 2密切相關(guān)，僅在 Ser96處不同，但H3. 1和H3. 3至少有5個(gè)氨基酸位點(diǎn)不同。另外，與在成年組織，包括肝 臟、腎臟和心臟中的存在相比，H3. 1在胎肝中高度富集。在成人組織中，H3. 3變體比H3. 1 變體更多，而對(duì)胎肝正相反。這些不同可被本發(fā)明的抗體所用，以在同時(shí)含有胎兒和母體細(xì) 胞和/或胎兒核酸的母體生物樣品中檢測胎兒細(xì)胞和/或胎兒核酸。因此，胎兒核小體表位可以是與組蛋白有關(guān)的表位。在一個(gè)實(shí)施例中，胎兒核小體 表位是與組蛋白H3有關(guān)的表位。在另一個(gè)實(shí)施例中，胎兒核小體表位是與組蛋白H3. 1有 關(guān)的表位。在另一個(gè)實(shí)施例中，胎兒核小體表位是與組蛋白H3. 1有關(guān)，但與組蛋白H3. 3無 關(guān)的表位。在另一個(gè)實(shí)施例中，胎兒核小體表位包含或由一表位構(gòu)成，該表位具有氨基酸序 列Ser-Ala-Val-Met-Ala-Leu-Gln-Glu-Ala-Cys (SEQ ID NO :1)。在另一個(gè)實(shí)施例中，胎兒 核小體表位包括或由一表位構(gòu)成，該表位具有SEQ ID N0:1的氨基酸序列中的2、3、4、5、6、7、8、9、或10個(gè)氨基酸殘基。在另一個(gè)實(shí)施例中，胎兒核小體表位包含或由一表位構(gòu)成，該 表位在含有與SEQ ID NO :1的氨基酸序列具有至少70%、至少80%或至少90%相同性的 氨基酸序列的肽內(nèi)。在另一個(gè)實(shí)施例中，胎兒核小體表位是與組蛋白H3. 1有關(guān)的表位，包 含或由一表位構(gòu)成，該表位在具有SEQ ID NO :1的氨基酸序列的肽內(nèi)。本發(fā)明的抗體包括 與特異性結(jié)合于具有氨基酸序列SEQ ID NO 1的肽內(nèi)的表位的那些抗體。本發(fā)明的抗體還可以針對(duì)組蛋白，特別是組蛋白H3. 1的特異性構(gòu)象或結(jié)構(gòu)特征。 例如，胎兒核小體表位可以是與組蛋白3. 1的一個(gè)區(qū)域有關(guān)的表位，該區(qū)域在胎兒核小體 中與母體核小體中對(duì)應(yīng)的H3. 1相比更暴露。也可利用胎兒和母體H3組蛋白中發(fā)生的翻譯 后修飾(例如甲基化或乙酰化)的不同來靶向要檢測的胎兒H3. 1，以檢測、富集和/或分離 胎兒DNA。也可用兩組抗體分離胎兒核酸，一組設(shè)計(jì)成與特異性組蛋白構(gòu)象或序列結(jié)合，第 二組設(shè)計(jì)成與翻譯后修飾結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施例中，胎兒核小體表位不包括與含有翻譯后修飾的組蛋白(例如組蛋 白H3或H3. 1)有關(guān)的表位。在另一個(gè)實(shí)施例中，胎兒核小體表位不包括與含有翻譯后磷酸 化、甲基化或乙酰化的氨基酸的組蛋白(例如H3或H3. 1)有關(guān)的表位。在另一個(gè)實(shí)施例 中，胎兒核小體表位不包括與含有翻譯后磷酸化的色氨酸(“S”)殘基或翻譯后被甲基化 或乙酰化的賴氨酸(“K”)或精氨酸(“R”)殘基的組蛋白(例如組蛋白H3或H3. 1)有關(guān) 的表位。在另一個(gè)實(shí)施例中，胎兒核小體表位不包括與含有甲基化的N-末端4位賴氨酸 (“K4”)，甲基化或乙酰化的9位賴氨酸殘基(“K9”)，或磷酸化的10位色氨酸(“S10”) 的組蛋白(例如組蛋白H3或H3. 1)有關(guān)的表位。一般來說，本發(fā)明的抗體含有可檢測的部分(例如標(biāo)記)。本領(lǐng)域存在許多可檢 測的標(biāo)記，而且本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知標(biāo)記方法。可用于本發(fā)明的一般標(biāo)記類型包括但不限 于，放射性同位素、熒光、化學(xué)發(fā)光和生物發(fā)光分子、生色團(tuán)、酶、酶底物、酶的輔因子、酶抑 制劑、生色團(tuán)、染料、金屬離子、金屬液膠、配體(例如生物素、親和素、鏈霉親和素、地高辛 或半抗原)等。可檢測的標(biāo)記包括那些發(fā)熒光的標(biāo)記，包括能在可檢測范圍內(nèi)顯示熒光的 那些物質(zhì)或其部分。可用于本發(fā)明的標(biāo)記的具體例子包括但不限于，放射性標(biāo)記，包括但不限于1251、 mI、35S、32P、14C和3H;化學(xué)發(fā)光物質(zhì)，包括但不限于魯米諾、異氨基苯二酰胼、theromatic吖 啶酯(theromatic acridinium ester)、咪唑、吖啶鹽和草酸酯；生物發(fā)光化合物，包括但不 限于熒光素、熒光酶、和水母素；熒光物質(zhì)，包括但不限于熒光素、FITC、羅丹明、藻紅蛋白、 藻藍(lán)蛋白、別藻藍(lán)蛋白、鄰苯二醛、得克薩斯紅、丹磺酰氯、二氯三吖嗪基胺熒光素、綠色熒 光蛋白、和熒光胺；酶，包括但不限于β-葡糖醛酸酶、β-D-糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、 脲酶、過氧化酶(例如辣根過氧化酶(HRP))、堿性磷酸酶、乙酰膽堿酯酶、葡萄糖氧化酶、 己糖激酶和鳥苷二磷酸酶、核糖核酸酶、熒光酶、磷酸果糖激酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、天 冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、磷酸烯醇丙酮酸脫羧酶、α-磷酸甘油、天冬酰胺酶(aspariginase)、葡萄 糖-6-磷酸脫氫酶、葡萄糖淀粉酶、和β -內(nèi)酰胺酶。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的抗體被熒光標(biāo)記。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的抗體是 熒光標(biāo)記的，而且抗體與胎兒細(xì)胞或胎兒核酸的特異性結(jié)合可通過流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法，例如 通過熒光激活細(xì)胞分揀(FACS)檢測。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的抗體固定在固相載體上。抗體可直接或間接(例如通過接頭)固定在固相載體上。使抗體結(jié)合于固相載體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的， 可使用任何已知或?qū)戆l(fā)現(xiàn)的方法。在一個(gè)實(shí)施例中，固相載體是一群磁性顆粒、柱(例如 樹脂柱)中的顆粒、微通道的表面、微孔、平板、陣列、濾器、膜或載玻片。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的抗體可以被固定、或涂布在裝置(例如微流裝置)表 面。示范性的微流裝置包括注入裝置、流出裝置和在注入裝置和流出裝置之間延伸的微通 道排列。微通道排列可以是任何為生物樣品提供隨機(jī)流徑的微通道。例如，微通道排列可 包括多條整合在微通道基面上并從其伸出的橫向分隔柱。所述柱通常排列成能夠提供隨機(jī) 化流徑的模式。微流裝置的例子如美國臨時(shí)申請11/458，668和11/331，988所述，兩者都 在此完整弓丨入以供參考。可用本發(fā)明的抗體部分或完全涂布微流裝置的微通道排列表面。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了含有本發(fā)明抗體的試劑盒。在一個(gè)實(shí)施例中，試 劑盒還包括使用試劑盒檢測來自母體生物學(xué)樣品的胎兒細(xì)胞或胎兒核酸的說明書。在一些 實(shí)施例中，試劑盒包括涂布有本發(fā)明抗體的微流裝置或其它固相。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了適用于測試胎兒遺傳組成的試劑盒。該試劑盒 包含使用本發(fā)明抗體分離或富集的胎兒的分離或富集的核酸樣品。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了檢測胎兒母體獲得的生物學(xué)樣品中胎兒核酸存 在的方法。該方法包括使生物學(xué)樣品與本發(fā)明抗體接觸，并檢測抗體與生物學(xué)樣品中核小 體的結(jié)合。抗體與核小體的特異性結(jié)合表明了胎兒細(xì)胞的存在。所述生物學(xué)樣品可以是任何母體生物學(xué)樣品，例如體液或其組分，其可能含有胎 兒細(xì)胞或胎兒核酸。在一個(gè)實(shí)施例中，生物學(xué)樣品是血液、血漿、血清、尿、宮頸粘液、羊水、 絨毛膜絨毛樣品、或其組分。在另一個(gè)實(shí)施例中，生物學(xué)樣品是血液、血漿、血清、尿或其組 分。在另一個(gè)實(shí)施例中，生物學(xué)樣品是宮頸粘液樣品。可從胎兒的母體通過任何本領(lǐng)域已 知或?qū)戆l(fā)現(xiàn)的方法獲得生物學(xué)樣品。在另一個(gè)實(shí)施例中，檢測步驟包括檢測本發(fā)明的抗體與細(xì)胞或其片段(例如凋 亡體)的特異性結(jié)合。本發(fā)明的抗體與細(xì)胞的特異性結(jié)合表明胎兒細(xì)胞的存在。一般說， 可用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測本發(fā)明抗體與生物學(xué)樣品中的核小體或細(xì)胞的特異性結(jié)合。例 如，當(dāng)抗體被熒光標(biāo)記時(shí)，可使用的示范性流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法，包括但不限于熒光激活細(xì)胞分 揀(FACS)。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了分離或富集胎兒核酸的方法。所述方法包括通 過使生物學(xué)樣品與本發(fā)明抗體接觸，分離從胎兒母體獲得的生物學(xué)樣品中的核酸。可在任何時(shí)間從胎兒的母體獲得生物學(xué)樣品，例如在妊娠最初三個(gè)月的第一、第 二、或第三個(gè)月。在一個(gè)實(shí)施例中，在妊娠頭三個(gè)月中獲得生物學(xué)樣品。在另一個(gè)實(shí)施例中， 在妊娠中三個(gè)月期間獲得生物學(xué)樣品。在另一個(gè)實(shí)施例中，在妊娠第4-12周、8-12周、或 10-12周獲得生物學(xué)樣品。在另一個(gè)實(shí)施例中，在妊娠13-28周、13-24周、13-20周、13-16 周、17-20周、或21-24周獲得生物學(xué)樣品。生物學(xué)樣品可以是任何上述母體生物學(xué)樣品。在一個(gè)實(shí)施例中，生物學(xué)樣品是血 液、血漿、血清、尿液、宮頸粘液、羊水、絨毛膜絨毛樣品、或其組分。在另一個(gè)實(shí)施例中，生物 學(xué)樣品是尿液、宮頸粘液、羊水、絨毛膜絨毛樣品或其組分。在另一個(gè)實(shí)施例中，生物學(xué)樣品 是宮頸粘液樣品或其組分。宮頸粘液樣品，例如宮頸內(nèi)粘液樣品或經(jīng)宮頸的粘液樣品可用 本領(lǐng)域任何已知或?qū)頃?huì)開發(fā)的技術(shù)獲得。這些技術(shù)包括但不限于，經(jīng)宮頸拭子、宮頸內(nèi)灌洗、刮板、細(xì)胞刷、抽吸、子宮內(nèi)灌洗或其組合。宮頸粘液樣品可以是新鮮樣品，例如不經(jīng)過充分保存的，或從新鮮樣品保存的樣 品，例如保存在合適的水相保存介質(zhì)中的，或者可以是從一或多個(gè)宮頸粘液樣品過濾出的 含有核酸的介質(zhì)樣品。本發(fā)明的宮頸粘液樣品可以維持或儲(chǔ)藏在約4-20°C之間，例如在低 鈣堿性介質(zhì)內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施例中，宮頸粘液樣品是處理過的樣品，例如用合適試劑處理過，以促使 粘液溶解，從而幫助從樣品分離核酸組分的新鮮或保存的樣品。例如，本發(fā)明的宮頸粘液樣 品可以是用粘液溶解劑或粘蛋白酶，例如N-乙酰-L-半胱氨酸、L-半胱氨酸、二硫蘇糖醇 (DTT)、鹽酸溴己銨(brornhexine hydrochloride)、和任何透明質(zhì)酸酶，包括透明質(zhì)酸分解 酶、透明質(zhì)酸氨基葡糖苷酶(hyaluronoglucosarninidase)和透明質(zhì)酸葡糖苷酸酶處理過 的樣品。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的宮頸粘液樣品是用酶，例如糖水解酶(例如半乳 糖苷酶或轉(zhuǎn)化酶)；蛋白酶；胃蛋白酶；或其組合處理過的樣品。在另一個(gè)實(shí)施例中，從胎兒母體獲得的生物學(xué)樣品經(jīng)過凋亡誘導(dǎo)處理，或經(jīng)處理 促使胎兒核酸從完整的胎兒細(xì)胞釋放，然后與抗體接觸。例如，生物學(xué)樣品可以是用試劑、 或經(jīng)過高ΡΗ、剪切或熱休克處理的樣品。依托泊苷等試劑，包括但不限于VP16和其它相當(dāng) 的酶可用于促使胎兒核酸釋放。在另一個(gè)實(shí)施例中，處理生物樣品以富集胎兒核酸和/或減少母體核酸含量。例 如，可處理生物學(xué)樣品，以減少或使任何核酸降解，例如母體DNA特征的DNA。這樣的核酸的 一個(gè)例子是高甲基化的母體DNA。可用任何減少、降解或選擇性除去高甲基化母體DNA的方 法，包括但不限于，甲基化特異性限制酶，例如McrBC(BioLabs)，對(duì)高甲基化母體DNA特異 性的抗體，例如抗-5’ -甲基-胞嘧啶抗體和/或抗-甲基CpG結(jié)合蛋白-2(MeCP2)抗體， 或配體或蛋白(例如與母體DNA中的甲基化CpG島特異性結(jié)合的MeCP2)。還可用胎兒核酸的特異性標(biāo)記富集胎兒核酸。例如，低甲基化的乳腺絲抑蛋白 (Hiaspin)DNA可用作用于胎兒DNA的標(biāo)記。在一個(gè)實(shí)施例中，來自生物學(xué)樣品的總DNA可以 用亞硫酸氫鈉處理，它誘導(dǎo)低甲基化胎兒DNA中的化學(xué)改變，從而將胎兒DNA的未甲基化的 胞嘧啶轉(zhuǎn)化成尿苷(U)。可用這種改變優(yōu)勢分離或富集胎兒DNA，例如優(yōu)勢擴(kuò)增含有從胞嘧 啶轉(zhuǎn)化過來的尿苷的胎兒DNA。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了鑒定胎兒基因組成的方法。該方法包括根據(jù)本 發(fā)明的方法分離胎兒核酸，和基于分離的胎兒核酸鑒定胎兒的基因組成。胎兒的基因組成可指示胎兒性別或胎兒中的狀況或疾病。在一個(gè)實(shí)施例中，基因 組成包括但不限于單體性、部分單體性、三體性、部分三體性、染色體易位、染色體重復(fù)、染 色體缺失或微缺失、和染色體倒位。一般來說，術(shù)語“單體性”指一對(duì)染色體中僅存在一條。單體性是一類非整倍性。 當(dāng)染色體的長或短臂缺失時(shí)，部分單體性發(fā)生。單體性引起的常見人類遺傳病包括xo，僅 有一條X染色體而不是在正常女性中可見的通常兩條(XX)，也被稱為特納綜合征；貓叫綜 合征，由于5號(hào)染色體短P (來自單詞petit，法語中的“小”)臂末端缺失導(dǎo)致的部分單體 性；和1ρ36缺失綜合征，一種由于1號(hào)染色體短ρ臂末端缺失導(dǎo)致的部分單體性。相反，術(shù)語“三體性”指體內(nèi)對(duì)特別編號(hào)的類型(numbered type)存在三條，而不是 正常的兩條染色體。因此，額外的21號(hào)染色體的存在被稱為21三體性。大部分三體性，與大部分其它染色體數(shù)目異常一樣，導(dǎo)致明顯的出生缺陷。許多三體性導(dǎo)致流產(chǎn)或早年死亡。 當(dāng)一段額外的染色體結(jié)合在其它染色體之一上，或者如果染色體之一具有其染色質(zhì)部分的 兩個(gè)拷貝時(shí)，發(fā)生部分三體性。嵌合三體性是這樣一種情況，即僅在生物體的一些細(xì)胞中存 在額外的染色體物質(zhì)。雖然三體性可以發(fā)生于任何染色體上，具有許多三體性的少數(shù)嬰兒 活到了出生。在人類中，最常見的存活而沒有自發(fā)流產(chǎn)的類型包括21三體性(唐氏綜合 征)；18三體性(愛德華綜合征)；13三體性(帕塔綜合征)；9三體性；8三體性(Warkany 綜合征2)；和16三體性(在人類中最常見的三體性，發(fā)生于以上的妊娠中，雖然常在頭 三個(gè)月導(dǎo)致自發(fā)流產(chǎn))。涉及性染色體的三體性包括XXX(三X染色體綜合征)；XXY(克萊 恩費(fèi)爾特(氏)綜合征)；和XYY (XYY綜合征)。在另一個(gè)實(shí)施例中，基因組成包括等位或基因異常，例如一個(gè)或多個(gè)突變，例如一 個(gè)或多個(gè)基因中的點(diǎn)突變、插入、缺失。在另一個(gè)實(shí)施例中，基因組成包括但不限于一種或多種多態(tài)性模式或遺傳標(biāo)記， 例如短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)、單核苷酸多態(tài)性(SNP)等。在另一個(gè)實(shí)施例中，基因組成表明疾病或異常。疾病或異常的例子包括但不限于 囊性纖維變性、鐮狀細(xì)胞貧血、苯并酮尿癥、Tay-Scahs病、腎上腺增生、范可尼貧血、脊髓 性肌萎縮、進(jìn)行性假肥大性肌營養(yǎng)不良、亨廷頓氏舞蹈病、Beta地中海貧血、強(qiáng)直性肌營養(yǎng) 不良、脆性X染色體綜合征、唐氏綜合征、愛德華綜合征、帕塔綜合征、克萊恩費(fèi)爾特(氏) 綜合征、三X染色體綜合征、XYY綜合征、8三體性、16三體性、特納綜合征、羅伯遜易位、 Angelman綜合征、迪喬治綜合征、午-希二氏綜合征、RhD綜合征、結(jié)節(jié)性硬化、毛細(xì)血管擴(kuò) 張性共濟(jì)失調(diào)和普拉德_威利綜合征。在另一個(gè)實(shí)施例中，基因組成包括任何不與Y染色體獨(dú)特相關(guān)的基因病況或異常。在另一個(gè)實(shí)施例中，基因組成包括任何對(duì)應(yīng)于或與胎兒的親子關(guān)系相關(guān)的遺傳病 況。本發(fā)明的遺傳測試可以直接使用本發(fā)明的分離的核酸樣品或?qū)⑵渥鳛椤盎跀U(kuò) 增”的基因組成測試法的模板。這些測試是本領(lǐng)域熟知的，包括但不限于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (“PCR”)，實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(“RT-PCR”)，連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(“LCR”)，自持續(xù)序列復(fù)制 (“3SR”)，也稱為基于核酸的擴(kuò)增(“NASBA”)，Q-B-復(fù)制酶擴(kuò)增，滾環(huán)復(fù)制(“RCA”)，轉(zhuǎn) 錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(“TMA”)，接頭輔助DNA擴(kuò)增(“LADA”)，多次置換擴(kuò)增(“MDA”)，和侵入 物和鏈?zhǔn)街脫Q擴(kuò)增(“SDA”)。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種組合物，含有肽和佐劑，該肽具有與SEQ ID NO 1的序列具有至少70%、至少80%、或至少90%相同性的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施例 中，所述肽含有一氨基酸序列，它與SEQ ID NO :1的序列100%相同。合適的佐劑包括但不 限于弗氏完全佐劑、弗式不完全佐劑、弗式完全佐劑的替換物、明礬、乙烯乙酸乙烯酯共聚 物、L-酪氨酸、二縮甘露醇_油酸酯(manide-oleate)、皂甙/膽固醇微囊、或硝基纖維素 (即肽抗原吸附的硝基纖維素)。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種制備與胎兒核小體表位特異性結(jié)合的抗體 的方法。該方法包括用含有肽和佐劑的組合物免疫動(dòng)物，該肽具有與SEQ IDNO 1的序列具 有至少80%相同性的氨基酸序列。該動(dòng)物可以是例如哺乳動(dòng)物(例如小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、山羊、馬等)。在一些實(shí)施例中，該方法包括從被免疫的動(dòng)物獲得細(xì)胞(例如脾細(xì)胞)， 產(chǎn)生單克隆抗體，并篩選這些單克隆抗體與胎兒核小體的特異性結(jié)合。在其它實(shí)施例中，該 方法包括從被免疫的動(dòng)物獲得多克隆抗體，和可任選的從多克隆抗血清純化胎兒核小體特 異性抗體。
實(shí)施例下列實(shí)施例是為了說明，而不是為了以任何方法、方式、形式明確或含蓄地限制本 發(fā)明。雖然它們是可能使用的方法中典型的例子，但是也可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其 它過程、方法或技術(shù)。實(shí)施例1通過從妊娠中三月早期(或頭三個(gè)月晚期)的孕婦拭取或灌洗獲得宮頸粘液樣 品。將收集裝置上的宮頸粘液樣品置于含有緩沖液的試管中，儲(chǔ)藏于約4°C，并轉(zhuǎn)移到處理 實(shí)驗(yàn)室中，同時(shí)維持樣品溫度為約4°C。可用合適的冰袋等實(shí)現(xiàn)維持在4°C。在到達(dá)處理實(shí)驗(yàn)室后，登記樣品并將其給實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員進(jìn)行處理。樣品溫至室 溫，用于隨后處理。接著，可將樣品置于37°C溫箱內(nèi)的搖床上約15-30分鐘，以釋放截留在 粘液中的DNA。可用粘蛋白酶進(jìn)一步溶解粘液，以釋放DNA，也可將樣品置于例如化學(xué)處理等本領(lǐng) 域熟知的條件下誘導(dǎo)樣品凋亡，以釋放胎兒核小體。除去收集裝置，用例如0. 22gm濾膜過 濾緩沖液，以除去污染物，該污染物包括母體細(xì)胞和精細(xì)胞。另外，可離心來自樣品的液體 以沉淀細(xì)胞，以從高分子量粘液和細(xì)胞中分離游離的DNA。可任選地在緩沖液中的樣品內(nèi)加 入DNA酶I以除去未被保護(hù)的高分子量DNA。然后，使清潔的濃縮樣品通過美國專利申請11/038,920中公開的那類微流裝置， 其具有一收集區(qū)，該收集區(qū)具有多個(gè)隨機(jī)定位的柱，該柱是通過使組蛋白特異性抗體結(jié)合 在其含柱的收集區(qū)內(nèi)制備的。可設(shè)計(jì)抗體與具有以下氨基酸殘基序列的十肽偶聯(lián)=Ser-Al a-Val-Met-Ala-Leu-Gln-Glu—Ala-CySo如上制備的經(jīng)處理的粘液樣品在真空泵的牽引下，緩慢通過微流裝置。抗體通過 與暴露的獨(dú)特序列偶聯(lián)，與含有胎兒組蛋白3. 1的樣品中的染色質(zhì)偶聯(lián)并螯合。然后用緩 沖液洗滌微流裝置，洗滌重復(fù)2-3次，以除去可能存在于宮頸粘液中的任何非特異性結(jié)合 的生物物質(zhì)。還可使用設(shè)計(jì)成與翻譯后修飾，例如糖基化、磷酸化和/或甲基化胎兒核酸的抗 體偶聯(lián)。另外，可用兩組抗體，它們設(shè)計(jì)成與特異組蛋白構(gòu)象以及上述翻譯后修飾偶聯(lián)。從微流裝置上釋放抗體螯合的生物材料，并純化以除去可能存在的鹽。然后用市 售DNA抽提試劑盒，例如Roche (羅氏)出售的，從樣品抽提DNA。然后將DNA濃縮到合適的體積，即，20-50 μ 1，用實(shí)時(shí)PCR或基于熒光的PCR進(jìn)行 分析以檢測染色體Y-特異性序列。分析結(jié)果顯示在DNA中有男性Y-序列的陽性檢測結(jié)果， 這是胎兒DNA存在于被抗體螯合的生物材料中的證據(jù)。用兩個(gè)位點(diǎn)的定量實(shí)時(shí)PCR顯示在 螯合的DNA材料中以顯著程度不存在母體DNA。例如，顯示Y-水平與至少一半的第二獨(dú)特 序列(例如β-球蛋白)的水平相當(dāng)證明，大部分，或幾乎所有DNA是胎兒來源的。或者， 可通過鑒定Η3. 1對(duì)Η3. 3在DNA中的相對(duì)比例來顯示，存在的相對(duì)比例是存在于胎兒來源的核小體中的比例，其可確認(rèn)DNA的胎兒來源。在該確認(rèn)后，能可靠地分析DNA中的非整倍性或其它遺傳異常或疾病，該分析可 提示妊娠并發(fā)癥。可對(duì)分離的胎兒DNA進(jìn)行分子DNA測序或多態(tài)性DNA序列分析。該分析 可利用實(shí)時(shí)PCR來計(jì)量與特異性DNA序列有關(guān)的DNA水平，以篩選非整倍性，或用PCR擴(kuò)增 DNA，然后將其在微陣列或基因-特異性微陣列中溫育。本文所弓I用的所有專利和出版物在此完整弓丨入以供參考。雖然本發(fā)明已用目前的優(yōu)選例進(jìn)行了描述，但是應(yīng)理解，可在不違背本發(fā)明的精 神的前提下進(jìn)行各種修改。因此，本發(fā)明僅以所附權(quán)利要求書進(jìn)行限定。
權(quán)利要求
一種與胎兒核小體表位特異性結(jié)合的抗體。
2.如權(quán)利要求1所述的抗體，其特征在于，所述胎兒核小體表位是與組蛋白H3有關(guān)的表位。
3.如權(quán)利要求1所述的抗體，其特征在于，所述胎兒核小體表位是與組蛋白H3.1有關(guān) 的表位。
4.如權(quán)利要求1所述的抗體，其特征在于，所述胎兒核小體表位是與組蛋白H3.1的一 個(gè)區(qū)域有關(guān)的表位，所述區(qū)域在胎兒核小體中比在母體核小體中更暴露。
5.如權(quán)利要求1所述的抗體，其特征在于，所述胎兒核小體表位是與組蛋白H3.1有關(guān)， 但與組蛋白3. 3無關(guān)的表位。
6.如權(quán)利要求1所述的抗體，其特征在于，所述胎兒核小體表位是在具有SEQIDNO 1 的氨基酸序列的肽內(nèi)的表位。
7.一種與胎兒核小體表位特異性結(jié)合的抗體，其特征在于，所述抗體與權(quán)利要求6所 述的抗體競爭與含有所述表位的肽結(jié)合。
8.如權(quán)利要求1所述的抗體，其特征在于，所述胎兒核小體表位是在肽內(nèi)的表位，所述 肽具有與SEQ ID NO 1的氨基酸序列具有至少90%相同性的氨基酸序列。
9.如權(quán)利要求1所述的抗體，其特征在于，所述抗體含有可檢測的部分。
10.如權(quán)利要求1所述的抗體，其特征在于，所述抗體被熒光標(biāo)記。
11.如權(quán)利要求1所述的抗體，其特征在于，所述抗體被固定在固相載體上。
12.—種含有權(quán)利要求1的抗體的試劑盒。
13.如權(quán)利要求12所述的試劑盒，其特征在于，還含有用試劑盒檢測胎兒細(xì)胞或從母 體的生物樣品中分離胎兒核酸的說明書。
14.一種適合測試胎兒的基因組成的試劑盒，其特征在于，包括胎兒的分離的核酸樣 品，所述樣品是用權(quán)利要求1所述的抗體分離的。
15.一種在生物樣品中檢測胎兒核酸存在的方法，包括使生物樣品與權(quán)利要求1所述的抗體接觸，和檢測所述抗體與生物樣品中的核小體的結(jié)合，其中，所述抗體與核小體的特異性結(jié)合表明胎兒核酸的存在。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述生物樣品是血液、血漿、血清、尿液、 宮頸粘液、羊水或絨毛膜絨毛樣品。
17.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述生物樣品是宮頸粘液樣品。
18.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述檢測包括檢測抗體與細(xì)胞的特異性 結(jié)合，所述抗體與細(xì)胞的特異性結(jié)合顯示胎兒細(xì)胞的存在。
19.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述檢測是用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法進(jìn)行的。
20.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述檢測是用熒光激活細(xì)胞分揀(FACS) 進(jìn)行的，其中所述抗體被熒光標(biāo)記。
21.一種從胎兒分離核酸的方法，其特征在于，包括用權(quán)利要求1所述的抗體分離獲自胎兒的母體的生物樣品中的核酸。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述生物樣品是尿、宮頸粘液、羊水或絨 毛膜絨毛樣品。
23.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述抗體被固定在固相表面。
24.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，在與抗體接觸前，所述生物樣品經(jīng)過凋亡 誘導(dǎo)處理。
25.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，在與抗體接觸前，所述生物樣品經(jīng)過凋亡 誘導(dǎo)處理，其中，所述凋亡誘導(dǎo)處理包括化學(xué)處理、高PH、剪切或熱休克。
26.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述生物樣品是在頭三個(gè)月妊娠期間獲 得的。
27.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述生物樣品是宮頸粘液樣品，其中，所 述宮頸粘液樣品是通過經(jīng)宮頸拭子、宮頸內(nèi)灌洗、細(xì)胞刷、抽吸、子宮內(nèi)灌洗或其組合獲得 的。
28.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述生物樣品是宮頸粘液樣品，并且所述 宮頸粘液樣品在與抗體接觸前經(jīng)粘液溶解劑處理。
29.一種鑒定胎兒基因組成的方法，其特征在于，包括根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法分離胎兒核酸；和基于分離的胎兒核酸鑒定胎兒的基因組成。
30.如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于，所述基因組成選自單體性、部分單體性、 三體性、部分三體性、染色體易位、染色體重復(fù)、染色體缺失或微缺失、和染色體倒位。
31.如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于，所述基因組成指示疾病或異常，所述疾病 或異常選自囊性纖維變性、鐮狀細(xì)胞貧血、苯并酮尿癥、Tay-Scahs病、腎上腺增生、范可 尼貧血、脊髓性肌萎縮、進(jìn)行性假肥大性肌營養(yǎng)不良、亨廷頓氏舞蹈病、地中海貧血、強(qiáng) 直性肌營養(yǎng)不良、脆性X染色體綜合征、唐氏綜合征、愛德華綜合征、帕塔綜合征、克萊恩費(fèi) 爾特(氏)綜合征、三X染色體綜合征、XYY綜合征、8三體性、16三體性、特納綜合征、羅伯 遜易位、Angelman綜合征、迪喬治綜合征、午-希二氏綜合征、RhD綜合征、結(jié)節(jié)性硬化、毛細(xì) 血管擴(kuò)張性共濟(jì)失調(diào)和普拉德_威利綜合征。
32.—種組合物，其特征在于，所述組合物含有肽和佐劑，所述肽具有與SEQID ΝΟ:1的 序列有至少80%相同性的氨基酸序列。
33.如權(quán)利要求32所述的組合物，其特征在于，所述氨基酸序列與SEQIDNO :1的序列 100%相同。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于檢測存在于獲自母體的生物樣品中的胎兒細(xì)胞和/或胎兒核酸的方法、抗體和試劑盒。還提供了用于從母體宮頸粘液樣品分離胎兒核酸，和用于測試或篩選分離的胎兒核酸以診斷胎兒基因異常的方法和試劑盒。
文檔編號(hào)G01N33/53GK101883851SQ200880108751
公開日2010年11月10日 申請日期2008年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月21日
發(fā)明者F·比肖夫 申請人:生物概念股份有限公司