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專利名稱：乳糖診斷/測定試劑(盒)及乳糖濃度測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種乳糖診斷/測定試劑(盒)，同時本發(fā)明還涉及測定乳糖濃度的方
法，屬于醫(yī)學(xué)/食品檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
乳糖是嬰幼兒主要的能量來源，進入體內(nèi)后經(jīng)小腸乳糖酶作用分解成葡萄糖和半 乳糖，半乳糖是嬰幼兒腦發(fā)育的必需物質(zhì)，與嬰幼兒大腦的迅速成長有密切聯(lián)系。為防止乳 清粉中摻加用其他還原糖如葡萄糖替代乳糖，乳糖的檢測十分必要。 牛奶是一種營養(yǎng)豐富的食品，但如飲用不當(dāng)，也會給健康帶來不良影B向。很多人在 飲奶后出現(xiàn)腹部不適、腹脹、多屁、腹痛甚至腹瀉等癥狀，這種現(xiàn)象在醫(yī)學(xué)上稱為乳糖不耐 受癥，其原因是這些人小腸缺乏乳糖酶、不能消化牛奶中的乳糖，乳糖進入結(jié)腸后，經(jīng)結(jié)腸 中的細(xì)菌發(fā)酵，產(chǎn)生大量氣體、醋酸等物質(zhì)所致。大量研究證實，患有乳糖不耐受的人還有 大部分沒有任何癥狀、只有人體生化指標(biāo)改變的隱性不耐受者，醫(yī)學(xué)上稱為乳糖吸收不良 或乳糖酶缺乏。 據(jù)統(tǒng)計，全世界都存在乳糖不耐受的問題，其中亞洲人發(fā)生率最高，為 95%-100%。據(jù)中國疾病控制中心調(diào)查，我國北京、上海、廣州等地3_13歲兒童乳糖不耐受 癥和乳糖吸收不良的發(fā)生率約為80%。乳糖不耐受除引起消化道癥狀外，還可造成人體營 養(yǎng)吸收不良。據(jù)國外研究，乳糖不耐受可減少鈣的攝入、減少峰值骨量、增加骨丟失從而引 發(fā)骨質(zhì)疏松癥，乳糖不耐受可影響鐵和鋅的吸收，造成鐵缺乏和鋅缺乏，并可影響小兒的腦 發(fā)育，對人體健康危害很大。 在食品分析領(lǐng)域中，酶分析法是廣為使用并倍受諸如ISO等國際標(biāo)準(zhǔn)機構(gòu)推薦的 一種方法。酶析法理論發(fā)展成熟并且已為實驗室普遍接受。使用高質(zhì)量經(jīng)純化的酶可以實 現(xiàn)對復(fù)雜物質(zhì)中特定成份的檢測。該方法可以檢測的目標(biāo)代謝物有糖類、酸類及其鹽類、醇 類和其他物質(zhì)等。由此，各種食品樣品均可被快速檢測并獲得良好的結(jié)果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，計量還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶) 在340nm波長處吸光度的變化，得以測定乳糖濃度的方法，同時，本發(fā)明還將給出用以實現(xiàn) 該方法的乳糖診斷/測定試劑(盒)，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全 自動生化分析儀上進行乳糖濃度測定，而且測定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實的推 廣應(yīng)用。 本發(fā)明乳糖濃度測定方法如下 乳糖+尿苷二磷酸乳糖合成酶尿苷二磷酸_半乳糖+葡萄糖
葡萄糖+腺苷三磷酸葡萄糖激酶腺苷二磷酸+葡萄糖6-磷酸
葡萄糖-6-磷酸+輔酶葡萄糖-6-磷酸脫氡酶葡糖酸內(nèi)酯磷酸+
還原型輔酶 這種方法應(yīng)用乳糖合成酶(lactose synthase ;EC 2. 4. 1. 22)酶(偶)聯(lián)葡萄糖 激酶(glucokinase ;EC 2. 7. 1. 2)、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(glucose-6-phosphatel-dehydr ogenase ;EC 1. 1. 1.49)酶促反應(yīng)比色終點法。乳糖合成酶酶解乳糖反應(yīng)產(chǎn)生葡萄糖，再通 過(偶)聯(lián)合葡萄糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的作用，最終將輔酶(在340nm處沒有吸 收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處 吸光度上升的程度，通過測量340nm處吸光度上升的程度，可以測算乳糖的濃度大小。
實驗表明，從測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟性兩方面綜合考慮，無論是單 劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明乳糖診斷/測定試劑(盒)較為理想緩沖液100,1/L穩(wěn)定劑500,1/L輔酶3mmol/L乳糖合成酶10000U/L葡萄糖激酶12000U/L葡萄糖-6-磷酸脫氫酶12000U/L尿苷二磷酸6mmol/L腺苷三磷酸5mmol/L本發(fā)明的乳糖診斷/測定試劑(盒)可以是單劑，包括緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、乳糖合成酶、葡萄糖激酶、葡萄糖_6-磷酸脫氫酶、尿苷二磷酸、腺苷三磷酸。 試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，
直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑
試劑1 緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、尿苷二磷酸、腺苷三磷酸。
試劑2 緩沖液、穩(wěn)定劑、乳糖合成酶、葡萄糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶。 輔酶、乳糖合成酶、葡萄糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、尿苷二磷酸、腺苷三磷酸
在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后
使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。 還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1 緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、尿苷二磷酸、腺苷三磷酸。
試劑2 緩沖液、穩(wěn)定劑、葡萄糖激酶、葡萄糖_6-磷酸脫氫酶。
試劑3 緩沖液、穩(wěn)定劑、乳糖合成酶。 輔酶、乳糖合成酶、葡萄糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、尿苷二磷酸、腺苷三磷酸 在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。 無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測定乳糖濃度的方法，其輔酶可以是NADP+、 NAD+或thio-NAD+中的一種。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例子對本發(fā)明作進-實施例一
-步的說明,









本實施例的乳糖診斷/; 三(羧甲基)氨基甲烷 穩(wěn)定劑 輔酶
乳糖合成酶
J定試劑為單試劑，包括
鹽酸緩沖液 100mmol/L 500,1/L 3mmol/L 10000U/L 12000U/L
12000U/L 6mmol/L 5mmol/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入純凈 水，復(fù)溶后使用。 在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37t:，反應(yīng)時間10分鐘，起始吸光度《0. l，測
試主波長340nm，測試副波長405nm，被測乳糖樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向為
正反應(yīng)(上升反應(yīng))，延遲時間大約0分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測
主波長340nm吸光度上升的程度，從而測算出乳糖的濃度大小。 實施例二
葡萄糖-6-磷酸脫氫酶
尿苷二磷酸
腺苷三磷酸













本實施例的乳糖診斷/; 試劑l
三(羧甲基)氨基甲烷
穩(wěn)定劑
輔酶
尿苷二磷酸 腺苷三磷酸 試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷 穩(wěn)定劑 乳糖合成酶
J定試劑為雙試劑，包括
鹽酸緩沖液100mmol/L 50mmol/L 3mmol/L 6mmol/L 5mmol/L
鹽酸緩沖液100mmol/L 50mmol/L 10000U/L 12000U/L 12000U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37t:，反應(yīng)時間10分鐘，起始吸光度《0. l，領(lǐng)
葡萄糖-6-磷酸脫氫酶試主波長340nm，測試副波長405nm，被測乳糖樣品與試劑1、試劑2的體積比例為2/20/5， 反應(yīng)方向為正反應(yīng)(上升反應(yīng))，延遲時間大約0分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測 主波長340nm吸光度上升的程度，從而測算出乳糖的濃度大小。
實施例三
本實施例的乳糖診斷/測定試劑為三試劑，包括
















試劑l
三(羧甲基)氨基甲烷
穩(wěn)定劑
輔酶
尿苷二磷酸 腺苷三磷酸 試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷 穩(wěn)定劑
鹽酸緩沖液10Ommol/L 50mmol/L 3mmol/L 6mmol/L 5mmol/L
鹽酸緩沖液100mmol/L 500,1/L 12000U/L 12000U/L
_6-
試劑3
三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液100mmol/L 穩(wěn)定劑 500mmol/L 乳糖合成酶 10000U/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 測定乳糖濃度時，在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37t:，反應(yīng)時間IO分鐘，起始 吸光度《0. 1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測乳糖樣品與試劑1、試劑2、試劑3 的體積比例為4/40/5/5，反應(yīng)方向為正反應(yīng)(上升反應(yīng))，延遲時間大約0分鐘左右，檢測 時間5分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測 主波長340nm吸光度上升的程度，從而測算出乳糖的濃度大小。 申請人:經(jīng)過實驗驗證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他測定方法均能達到本發(fā)明 的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實施例類同，不另一一例舉。 總之，實驗證明采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀器得出所 需的測定結(jié)果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0. 0007 ;吸光度時間反應(yīng)曲線應(yīng)呈上 升曲線直至終點；試劑可測有效(R > 0. 99)線形范圍可達20mmol/L ;試劑測試的不準(zhǔn)確 度，其相對偏差不超過±3% ;試劑測試的精密度(重復(fù)性)的變異系數(shù)(CV)《2% ;試劑 的靈敏度可達O. 0040±0. 0020 AA/mmol/L ;試劑在2-8"下保存，活性可以穩(wěn)定一年；—— 本發(fā)明靈敏度高、精確度好，線形范圍寬廣，穩(wěn)定期長，足以便于推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
一種酶比色法及酶聯(lián)法的乳糖的濃度測定方法，其方法如下乳糖+尿苷二磷酸 乳糖合成酶 尿苷二磷酸-半乳糖+葡萄糖葡萄糖+腺苷三磷酸 葡萄糖激酶 腺苷二磷酸+葡萄糖6-磷酸葡萄糖-6-磷酸+輔酶 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶 葡糖酸內(nèi)酯磷酸+ 還原型輔酶將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度，測算出乳糖的濃度大小測定結(jié)果。
2. —種乳糖診斷/測定試劑(盒)，主要成分包括緩沖液 20-500mmol/L穩(wěn)定劑 1-4000mmol/L輔酶 1-6mmol/L乳糖合成酶 1000——80000U/L1000-80000U/L-6-磷酸脫氫酶 1000——80000U/L尿苷二磷酸 1——50mmol/L腺苷三磷酸 1——50mmol/L試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內(nèi)效果較好，在此范圍外，試劑仍會 反應(yīng)作用。其特征在于試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液 體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述乳糖診斷/測定試劑(盒)，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、乳糖合成酶、葡萄糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、尿苷二磷酸、腺苷三磷酸組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述乳糖診斷/測定試劑(盒)，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、乳糖合成酶、葡萄糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、尿苷二磷酸、腺苷三磷酸組成雙劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、尿苷二磷酸、腺苷三磷酸組 成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、乳糖合成酶、葡萄糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶組成。輔酶、 乳糖合成酶、葡萄糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、尿苷二磷酸、腺苷三磷酸在試劑1或試劑 2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述乳糖診斷/測定試劑(盒)，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、乳糖合成酶、葡萄糖激酶、葡萄糖_6-磷酸脫氫酶、尿苷二磷酸、腺苷三磷酸組成多劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、尿苷二磷酸、腺苷三磷酸組 成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、葡萄糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、乳糖合成酶組成。輔酶、乳糖合成酶、葡萄糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、尿苷二 磷酸、腺苷三磷酸在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述乳糖診斷/測定試劑(盒)，其特征在于還包括穩(wěn)定劑l-4000mmol/L或0. 1% _100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(A,niaSulfate)、甘油 (Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一 種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的乳糖診斷/測定試劑(盒)，同時本發(fā)明還涉及測定乳糖濃度的方法、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)/食品檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑(盒)主要成分包括緩沖液、輔酶、尿苷二磷酸、腺苷三磷酸、乳糖合成酶、葡萄糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度上升的程度，從而測算出乳糖的濃度大小。
文檔編號G01N35/00GK101793698SQ200910028210
公開日2010年8月4日 申請日期2009年2月4日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月4日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司