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特異性結合前列腺癌的短肽及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明提供一系列利用噬菌體展示肽庫技術篩選得到的具有靶向前列腺癌特性的多肽。本發明的結合多肽特異性高，可用于前列腺癌高危人群的普查及前列腺癌的早期臨床診斷、以及治療效果的評估。
【專利說明】特異性結合前列腺癌的短肽及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于蛋白質多肽【技術領域】，具體涉及一系列可特異性結合前列腺癌的短肽。
【背景技術】
[0002]前列腺癌是嚴重威脅中老年男性健康的惡性腫瘤之一，而且發病率逐年上升，死亡率高，僅次于肺癌，位居第二。50多年以來，雄激素阻斷治療一直是前列腺癌的標準療法，然而，大多數患者最終會發展為激素抵抗性前列腺癌(hormone refractory prostateCancer，HRPC)。對于HRPC，目前尚無有效的療法，而現有治療手段包括放射治療、化學治療等均不能延長患者生命達一年以上。因此探索新型有效的前列腺癌治療方法，一直是泌尿外科臨床所面臨的重要課題之一。[0003]目前我國對于前列腺癌的篩查率相對較低，這也是造成前列腺癌死亡率偏高的重要原因之一。因此，本領域迫切需要開發可用于前列腺癌診斷的相關蛋白。而多肽因分子量小，組織穿透性好，無免疫原性且對細胞表面受體具有較高親和力而成為靶向傳遞研究中的理想配體。然而已知的天然受體-配體對是非常有限的。
[0004]噬菌體展示肽庫技術的發展則為發現和表征新的配體及對應受體提供了有力的工具，不僅有望實現臨床應用于腫瘤的靶向治療，也有助于解釋疾病發生機制的理論研究。噬菌體展示技術通過將特定片段插入噬菌體DNA中而將相應的多肽表達在pill衣殼蛋白上，從而在噬菌體的DNA和衣殼蛋白之間搭建橋梁，使得各種靶分子的多肽配體可通過體外或體內篩選得以快速鑒定。發展至今，應用此技術已成功篩選得到針對肝癌、結腸癌、乳腺癌等多種人類腫瘤的靶向多肽，但是對于篩選前列腺癌靶向配體的相關報道則很少。
[0005]因此，本發明利用噬菌體展示肽庫技術于前列腺癌腫瘤模型體內篩選得到16條可靶向前列腺癌的短肽，并對此多肽的靶向特性進行了鑒定，以考察其作為靶向配體用于傳遞藥物至前列腺腫瘤部位的可行性。

【發明內容】

[0006]本發明的目的是針對現有技術的不足，提供一系列利用噬菌體展示肽庫技術篩選得到的具有靶向前列腺癌特性的多肽。
[0007]本發明的另一個目的是提供上述多肽在制備前列腺癌診斷試劑盒中的應用。
[0008]本發明的目的通過下述技術方案予以實現:
[0009]用噬菌體展示肽庫減性篩選腫瘤細胞特異性結合多肽或靶肽的方法為:通常用兩個細胞系進行篩選，將噬菌體展示隨機肽庫先通過不含靶抗原的正常細胞篩選，未結合的上清再通過含靶抗原的細胞，篩選出噬菌體擴增后進行下一輪篩選，最終得到特異性結合肽。
[0010]首先，采用上述噬菌體展示肽庫減性篩選技術，以前列腺癌LNCaP和PC3細胞作為靶細胞，正常細胞為吸附細胞，對NEW ENGLAND Biolabs的Ph.D._7? Phage DisplayPeptide Library Kit進行四輪體外篩選，通過逐輪增強洗滌力度，獲得了前列腺癌特異性的噬菌體克隆。上述的篩選后，分別于第二輪、第三輪和第四輪篩選結果中隨機挑取單克隆進行DNA的提取和測序。應用生物信息學工具分析篩選得到的多肽序列，同時酶聯免疫吸附實驗用于分析候選噬菌體單克隆對細胞的結合能力，從而鑒定出與前列腺癌細胞具有較強的親和力的噬菌體16個克隆，將該16個克隆送去測序，并分別命名為PCP1-16，測序結果證實PCP1-16的氨基酸序列分別如SEQ ID NO:1_16所示。
[0011]本發明篩選得到的多肽經鑒定具有以下特性及優點:
[0012]多肽可有效地識別并特異性結合前列腺癌細胞系LNCaP和PC3，而對正常的前列腺細胞系RWPE-1，及其他腫瘤細胞H印G2、A549、SW480的結合能力弱，表現出針對前列腺癌特異的識別和結合能力；
[0013]該多肽具有分子量小，組織穿透性好，無免疫原性且對細胞表面受體具有較高親和力的普遍特點，該多肽可用于制備前列腺癌診斷試劑藥盒，該試劑盒診斷靈敏度高、特異性高，可用于前列腺癌高危人群的普查及前列腺癌的早期臨床診斷、以及治療效果的評價與病人病情轉歸、預后的判斷。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1為ELISA檢測第四輪篩選噬菌體克隆與LNCaP和PC3的親和力對比柱狀圖；
[0015]其中，圖1A為PCP1-20這20個噬菌體克隆分別對LNCaP的親和力，圖1B為PCP1-20這20個噬菌體單克隆分別對PC3的親和力，21為原庫隨機噬菌體克隆對LNCaP的親和力，22為原庫隨機噬菌體克隆對PC3的親和力。
[0016]圖2為噬菌體克隆對不同細胞的體外靶向能力鑒定(噬菌體相對結合=TUit3ps菌體
克隆/ TU空白對照B旌菌體)。
[0017]其中，圖2A為噬菌體PCP1-6分別對不同細胞的結合能力結果圖，圖2B為噬菌體PCP7-11分別對不同細胞的結合能力結果圖，圖2C為噬菌體PCP12-16分別對不同細胞的結合能力結果圖。
【具體實施方式】
[0018]本發明通過以下實施例作進一步說明，但不作為本發明的限制。
[0019]實施例1前列腺癌特異性結合多肽的篩選
[0020]本實施例采用噬菌體展示隨機12肽庫減性篩選與前列腺癌細胞特異性結合的多肽，其具體步驟如下:
[0021]用胰酶消化人前 列腺癌細胞LNCaP和PC3后，調整細胞密度，接種于預先包被多聚賴氨酸的培養皿中，待細胞長至80% -90%融合度時進行篩選實驗。
[0022]取上述LNCaP和PC3細胞，用無血清DMEM培養后，加入牛血清白蛋白BSA封閉，再加入20 μ I噬菌體肽庫，孵育1.5h后，傾倒除去未結合噬菌體，倒置拍甩除去殘余溶液。用洗滌液0.2% (v / v)TBST緩沖液沖洗4次，加入非特異性緩沖液0.2M甘氨酸-鹽酸(pH2.2) 2ml，吸出洗脫液，加入250 μ 15MTris_HCl (pH9.0)中和后，將洗脫液轉至RWPE-1細胞中，孵育3h后，收集上清，即為第一輪篩選得到的噬菌體，將得到的噬菌體取少量利用大腸桿菌通過滴定法確定噬菌體的濃度，其余的噬菌體感染大腸桿菌進行擴增，用于下一輪的篩選。
[0023]第二輪篩選時，洗滌液TBST中Tween-20濃度提高至0.5%，與LNCaP和PC3孵育時間為40min，洗滌次數增加至7次，其余條件、步驟與第一輪相同。
[0024]第三輪篩選時，洗滌液TBST中Tween-20濃度提高至0.8%，與LNCaP和PC3孵育時間減少至25min，并且洗滌次數增加至10次，其余條件、步驟與第一輪相同。
[0025]第四輪篩選時，洗滌液TBST中Tween-20濃度提高至1.0%，與LNCaP和PC3孵育時間減少至20min，并且洗滌次數增加至15次，其余條件、步驟與第一輪相同。
[0026]測定第四輪篩選獲得的噬菌體的滴度后，在LB / IPTG / Xgal平板上隨機挑取藍色噬菌斑，制備噬菌體單克隆用于鑒定。
[0027]實施例2噬菌體的擴增
[0028]將實施例1中，每輪篩選獲得的噬菌體用LB培養基進行100倍比稀釋后，取20 μ I稀釋后噬菌體與200 μ I對數生長早期的大腸桿菌菌液混勻，加入到于45°C保溫的LB頂層瓊脂后迅速傾倒于含有IPTG / Xgal的LB固體平板，處理24小時，計數平板上噬菌體可生長的斑數，然后用此數目乘以稀釋倍數即得到每10 μ I噬菌體的空斑形成單位(pfu)滴度。
[0029]前列腺癌細胞特異結合的噬菌體多肽的富集:如表1所示，與LNCaP和PC3結合的陽性噬菌體克隆經四輪篩選后噬菌體回收率提高1000倍。
[0030]表1經過四輪篩選后陽性噬菌體的回收率
[0031]
【權利要求】
1.一種短肽，其特征在于:能特異性結合前列腺癌細胞。
2.如權利要求1所述的短肽，其特征在于:其為PCP1-16，其氨基酸序列分別如SEQIDNO:1-16 所示。
3.如權利要求1-2所 示的短肽在制備檢測前列腺癌細胞的制劑中的應用。
4.如權利要求3所述的應用，其特征在于:所述前列腺細胞為LNCaP和PC3。
5.權利要求1-2任一項所述的短肽在制備前列腺癌診斷試劑盒中的應用。
【文檔編號】G01N33/68GK103897037SQ201410115439
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年3月24日 優先權日:2014年3月24日
【發明者】華國光 申請人:華國光