離子液體功能化石墨烯修飾電極用于檢測5-羥色胺和多巴胺的方法
【專利摘要】本發明公開一種離子液體功能化石墨烯修飾電極用于同時檢測5-羥色胺和多巴胺的方法。氨基端的咪唑類離子液體和氧化石墨烯片層的環氧基團之間發生一個親核的開環反應形成離子液體功能化石墨烯，然后將其修飾在玻碳電極上形成一層修飾層，對5-羥色胺和多巴胺同時進行檢測。本發明研究表明，離子液體功能化石墨烯修飾電極對5-羥色胺和多巴胺的氧化具有很好的電催化活性，既可以單獨檢測5-羥色胺或多巴胺，也可以同時檢測5-羥色胺和多巴胺，且檢測過程簡單、靈敏度高、快捷簡便。
【專利說明】離子液體功能化石墨烯修飾電極用于檢測5-羥色胺和多巴胺的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種5-羥色胺和多巴胺的檢測方法。具體是指用離子液體功能化石墨烯修飾電極對5-羥色胺和多巴胺進行檢測。
【背景技術】
[0002]石墨烯(Graphene)是由單層碳原子以正六邊形緊密排列成蜂窩狀的二維平面結構，是一種典型的納米材料，具有化學結構穩定、比表面積大等優異的力學、電學和化學性質，在電化學傳感器中具有潛在的應用價值。然而，分子間作用力使得石墨烯層與層之間容易發生團聚，這不利于其在電極表面的修飾，也不利于修飾后其優點的發揮。
[0003]離子液體(IL)是指室溫及接近室溫下完全由陰、陽離子組成的液體物質，不但具有穩定性好和難揮發的特點，而且還具有電化學窗口寬，能促進電子傳遞，好的導電性和良好的生物兼容性等優點。結合石墨烯和離子液體的優點，石墨烯的團聚可以得到有效的抑制，從而提供更大的比表面積以負載更多的檢測物，增強響應的靈敏性，促進各種氧化還原生物分子有效的電子轉移，可以用來檢測不同類型的分子。
[0004]5-羥色胺(5-HT)和多巴胺(DA)是生理體系中重要的兒茶酚胺類神經遞質，也參與記憶和學習等一些認知功能。許多研究顯示，5-羥色胺和多巴胺在其各自的釋放中相互影響，因此同時檢測5-羥色胺和多巴胺非常重要，它可以為許多疾病如帕金森病、精神疾病、抑郁癥、智力缺陷、自閉癥等的診斷提供信息。目前高效液相色譜法，庫侖法，毛細管電泳，反相離子對高效液相色譜-電化學檢測，薄層色譜法，質譜等方法已用于同時測定5-羥色胺和多巴胺的濃度。但是，以這些技術為基礎的方法需要昂貴的儀器和溶劑，花費時間進行預處理，檢測速度慢，成本高，而且在人體血液中其他電活性分子影響5-羥色胺和多巴胺的檢測，選擇性差。鑒于檢測5-羥色胺和多巴胺的重要性，需要研究一個穩定、簡單、有效的方法來快速監測這兩種化合物。雖然，電化學方法可以滿足上述要求，但通常傳統的電化學方法靈敏度低，選擇性差。所以，研制穩定、簡單和有效的修飾電極用于同時檢測5-羥色胺和多巴胺有著重大的意義。
【發明內容】
[0005]基于上述，本發明的目的在于提供一種制備離子液體功能化石墨烯修飾電極的方法。本發明的另一目的是用離子液體功能化石墨烯修飾電極檢測5-羥色胺和多巴胺的方法。本發明與傳統的方法相比，這種功能化界面的修飾電極能很好的識別5-羥色胺和多巴胺，即5-羥色胺和多巴胺在該電極上有分開的氧化峰，從而實現了對5-羥色胺和多巴胺的同時檢測。
[0006]本發明的目的是這樣實現的:
一種制備離子液體功能化石墨烯修飾電極的方法，其步驟是:
a.在冰浴條件下，將石墨加入到濃硫酸中，持續攪拌，再加硝酸鈉和高錳酸鉀，得到的渾濁混合物冷卻至室溫；取水加到上述混合物中，15分鐘后，再加入25°C溫水將其稀釋，然后加入30%的雙氧水，溶液變成了亮黃色；將溶液過濾，得到的氧化石墨烯真空干燥；
b.稱取氨基化的離子液體加到氧化石墨烯分散液中，再加入氫氧化鉀，然后將得到的混濁混合物進行超聲處理，分散液呈透明、均勻的液體，并將其在80°C劇烈攪拌24 h，得到的產品進行離心分離，用水和無水乙醇洗滌，風干，然后把制得的離子液體功能化石墨烯超聲分散在二次蒸餾水中得到0.5mg/mL的分散液，待用；
c.將裸玻碳電極依次用0.3 μ m、0.05 μ m的三氧化二鋁懸濁液拋光成鏡面，依次經體積分數為95 %的乙醇、二次蒸餾水超聲清洗，得到處理后的裸玻碳電極；插入含有ImM鐵氰化鉀探針分子的0.1M氯化鉀電解質溶液中，并采用裸玻碳電極為工作電極、鉬柱為對電極、飽和甘汞電極為參比電極的三電極體系進行循環伏安掃描，對裸玻碳電極進行表征，再將裸玻碳電極取出用二次蒸餾水沖洗并吹干，備用；
d.在上述處理好的裸玻碳電極上滴涂的離子液體功能化石墨烯分散液，并置于紅外燈下烤干，制得離子液體功能化石墨烯修飾的玻碳電極。
[0007]用離子液體功能化石墨烯修飾的玻碳電極同時檢測5-羥色胺和多巴胺的方法，其步驟是:
a.以離子液體功能化石墨烯修飾的玻碳電極為工作電極、鉬柱為對電極、飽和甘汞電極為參比電極組成三電極體系，并將其共同浸入含有不同濃度5-羥色胺和多巴胺的0.2MPH為7.0磷酸鹽緩沖溶液中進行差示脈沖掃描，得到不同濃度5-羥色胺和多巴胺的差示脈沖伏安曲線圖；
b.采用origin軟件作圖，繪制IL-graphene/GCE在不同濃度5-輕色胺和多巴胺溶液中的差示脈沖伏安曲線和相應的氧化峰電流與其濃度的線性關系圖。
[0008]本發明優點和產生的有益效果是:
1、本發明制備的離子液體功能化石墨烯修飾電極與傳統檢測5-羥色胺、多巴胺的方法相比，本發明提供的離子液體功能化石墨烯修飾電極用于同時檢測5-羥色胺和多巴胺的方法，具有制備簡單、響應快、重現性及選擇性好等優點。既可以對5-羥色胺溶液或多巴胺溶液進行單獨檢測，也可以同時檢測5-羥色胺和多巴胺。在檢測5-羥色胺和多巴胺時表現出靈敏度高，線性范圍寬，較好的選擇性等優異的性能。這主要是由于離子液體具有高的離子導電性，促進了 5-羥色胺和多巴胺的電子轉移速率，而且通過離子液體的靜電排斥作用提高了材料的分散性，為負載5-羥色胺和多巴胺提供了大的有效面積，使更多的5-羥色胺和多巴胺分子附著在修飾電極的表面，增加其峰電流響應，在差示脈沖伏安掃描中的峰電流增大，降低該修飾電極對5-羥色胺和多巴胺的檢測限。而且該修飾電極在差示脈沖伏安掃描中顯示出不同的峰電位響應，有分開的氧化峰，能很好的識別5-羥色胺和多巴胺，實現該修飾電極對5-羥色胺和多巴胺的同時檢測。
[0009]2、與目前5-羥色胺和多巴胺測定通常采用的高效液相色譜法和毛細管電泳法相t匕，本發明中的化學修飾電極不需要昂貴的設備和復雜的過程，其制備簡單迅速，成本低，樣品用量少，方法可靠?；?-羥色胺和多巴胺特征峰位置不同，可以根據其各自的特征峰快速、準確的檢測出5-羥色胺和多巴胺的濃度，也可以避免其他電活性分子(尿酸、抗環血酸等)的干擾，抗干擾性好，在5-羥色胺和多巴胺的同時測定中具有優異的特性，而且可以用來估算人體血清中5-羥色胺和多巴胺的含量。[0010]3.離子液體功能化石墨烯修飾電極不論是對5-羥色胺和多巴胺的單獨檢測，還是對其同時檢測，都具有線性范圍寬，檢測限低，檢測過程簡單，靈敏度高及快速簡便的優點，有很好的應用前景。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0011]圖1為不同修飾(玻碳)電極在含有5.0 mM鐵氰化鉀和亞鐵氰化鉀的0.1M KCl溶液中的電化學阻抗譜圖。其中，a:裸電極；b:氧化石墨烯修飾電極；c:1L-graphene修飾電極。
[0012]圖2.裸電極(a)、氧化石墨烯修飾電極(b)、IL-graphene修飾電極(C)在含有
0.1mM 5-羥色胺的0.2M磷酸鹽緩沖溶液(pH=7.0)中的循環伏安曲線。掃速:50mV/s。
[0013]圖3.裸電極(a)、氧化石墨烯修飾電極(b)、IL-graphene修飾電極(C)在含有
0.1mM多巴胺的0.2M磷酸鹽緩沖溶液(pH=7.0)中的循環伏安曲線。掃速:50mV/s。
[0014]圖4.裸電極(a)、氧化石墨烯修飾電極(b)、IL-graphene修飾電極(C)在含有
0.1mM 5-羥色胺和多巴胺的混合溶液的0.2M磷酸鹽緩沖溶液(pH=7.0)中的循環伏安曲線。掃速:50mV/s。
[0015]圖5.1L-graphene/GCE電極在5_輕色胺溶液中的差示脈沖伏安曲線圖(從a到j:0.7，2，5，10，20，30，40，50，70和90 //M),插圖是相應的氧化峰電流與其濃度的線性關系圖。
[0016]圖6 IL-graphene/GCE電極在多巴胺溶液中的差示脈沖伏安曲線圖(從a到j:
1.5，3，7，10，20，30，50，70，90和100 // M)，插圖是相應的氧化峰電流與其濃度的線性關系圖。
[0017]圖7.1L-graphene/GCE電極在含3mM多巴胺的5_羥色胺溶液中的差示脈沖伏安曲線圖(從a到k:0.2,0.5，0.8，1，2，3，4，5，7，8和10 //M)，插圖是相應的氧化峰電流與其濃度的線性關系圖。
[0018]圖8.1L-graphene/GCE電極在含ImM 5_羥色胺的多巴胺溶液中的差示脈沖伏安曲線圖(從a至IJ j:1,5,9,10,20,30,40,60,80和100 //M)，插圖是相應的氧化峰電流與其
濃度的線性關系圖。
[0019]圖9為本發明IL-graphene/GCE對5_輕色胺和多巴胺同時檢測的差示脈沖伏安曲線圖，插圖為相應的氧化峰電流與其濃度的線性關系圖。
【具體實施方式】
[0020]為了更清楚的說明本發明的內容，下面結合附圖對本發明的【具體實施方式】作進一步的說明:
本發明實施過程中所使用的儀器和藥品:
CHI 660C電化學工作站(上海辰華儀器公司)用于進行循環伏安的實驗。石英管加熱式自動雙重純水蒸餾器(1810B，上海亞太技術玻璃公司)用于蒸二次蒸餾水。電子天平(北京賽多利斯儀器有限公司)，用于稱量藥品。超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。三氧化二鋁打磨粉(0.30 Pm, 0.05 P m，上海辰華儀器試劑公司)用于處理玻碳電極。飽和甘汞參比電極，鉬柱對電極，磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鉀(西安化學試劑廠)。石墨(99.99%SP-1，平均粒徑45 μ Μ)、硝酸鈉、高錳酸鉀、濃硫酸、5-羥色胺、多巴胺(Sigma公司)。實驗過程中使用的水均為二次蒸餾水，實驗所用的試劑均為分析純。
[0021]下面結合附圖對本發明的【具體實施方式】作進一步的說明:
一種制備離子液體功能化石墨烯修飾電極的方法，包括以下步驟:
1.在冰浴條件下,將粒徑45μ M、2g石墨加入到持續攪拌的46mL的濃硫酸中，再加Ig的硝酸鈉和6g高錳酸鉀，得到的渾濁混合物冷卻至室溫；將92mL的水加到上述混合物中，15分鐘后，再加入25°C溫水將其稀釋，然后加入30%的雙氧水，溶液變成了亮黃色；將溶液過濾，濾餅用二次蒸餾水反復沖洗，懸浮液進行離心分離，得到的氧化石墨烯真空干燥；
2.稱取IOmg氨基化的離子液體加到IOmL氧化石墨烯分散液中，再加入IOmg氫氧化鉀，得到的混濁混合物進行超聲處理，分散液呈透明、均勻的液體，將其在80°C劇烈攪拌24h，得到的產品進行離心分離，用水和乙醇洗滌，風干。然后把制得的離子液體功能化石墨烯超聲分散在二次蒸餾水中得到0.5mg/mL的分散液，待用；
3.將裸玻碳電極依次用0.3 μ m、0.05 μ m的三氧化二鋁懸濁液拋光成鏡面，再依次經體積分數為95 %的乙醇、二次蒸餾水超聲清洗，得到處理后的裸玻碳電極；插入含有ImM鐵氰化鉀和ImM亞鐵氰化鉀探針分子的0.1M氯化鉀電解質溶液中，并采用以裸玻碳電極為工作電極、鉬柱為對電極、飽和甘汞電極為參比電極的三電極體系進行循環伏安掃描，對裸玻碳電極進行表征；再將裸玻碳電極取出用二次蒸餾水沖洗并吹干，備用；
4.在上述處理好的裸玻碳電極上滴涂3μ L的離子液體功能化石墨烯分散液，并置于紅外燈下烤干，制得離子液體功能化石墨烯修飾的玻碳電極；
5.用離子液體功能化石墨烯修飾電極檢測5-羥色胺和多巴胺的電化學表征:
在電化學工作站的技術選項中選擇循環伏安技術和電化學阻抗技術，飽和甘萊電極為參比電極，鉬柱為對電極，直徑3mm的玻碳電極為工作電極。并將其共同浸入含有5-羥色胺和多巴胺的0.2M磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.0)中進行差示脈沖掃描，采用origin軟件作圖，得到不同濃度5-羥色胺和多巴胺的差示脈沖伏安曲線圖和相應的氧化峰電流與其濃度的線性關系圖。循環伏安技術的電位窗設置為0V-0.8V、-0.2V-0.6V和-0.2V-0.8V。
[0022]圖1為本發明不同修飾(玻碳)電極在含有5.0 mM鐵氰化鉀和亞鐵氰化鉀的
0.1M KCl溶液中的電化學阻抗譜圖。其中，a:裸玻碳電極；b:氧化石墨烯修飾電極；c:1L-graphene修飾電極。電化學阻抗譜(EIS)可以得到電極表面阻抗變化的信息。一般一個典型的阻抗譜圖包括兩部分，其中高頻區測得的半圓部分由電子傳遞過程控制，其直徑大小等于電極表面電子傳遞電阻(Ret)的數值，反映的是一個典型的受電子傳遞控制的過程；而在低頻部分是一段和特征半圓相連的直線，反映的是一個由擴散控制的電子傳遞過程。圖1中，a裸玻碳電極的阻抗譜是由一個小的半圓(電阻:74Ω)和一條接近于直線的尾線組成，從圖1中可以看出裸玻碳電極的電阻比較大，阻礙了溶液中電子的傳遞。當氧化石墨烯修飾到玻碳電極表面后，形成了與a曲線相似的b曲線，但是電子轉移時的電阻值增加到157 Ω，電阻值的增加主要是由于氧化石墨烯片層上含有許多的含氧官能團，阻礙了電子的轉移，而且氧化石墨烯上有許多帶負電的離子化的官能團，和帶負電荷的[Fe (CN)6] 3_Λ_會產生排斥力，使氧化石墨烯修飾電極的導電性比裸電極還差。然而，當IL-graphene修飾到玻碳電極表面后，高頻區幾乎是一條直線C，該修飾電極的導電性比較好，有利于溶液中電子的傳遞，這說明離子液體對氧化石墨烯導電性的提高起著重要的作用。[0023]圖2、圖3、圖4分別為不同修飾電極在含有0.1mM 5_羥色胺、0.1mM多巴胺和
0.1mM 5-羥色胺和多巴胺的混合溶液的0.2M磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.0)中的循環伏安曲線。其中a:裸電極；b:氧化石墨烯修飾電極；c:1L-graphene修飾電極。由圖2、3、4中可以看出:5_羥色胺和多巴胺在IL-graphene/GCE電極上的循環伏安響應比其在G0/GCE和裸玻碳電極上都大得多，究其原因，離子液體對促進5-羥色胺和多巴胺的電化學氧化起著重要的作用，離子液體具有高的離子導電性，促進了 5-羥色胺和多巴胺的電子轉移速率。而且通過離子液體的靜電排斥作用提高了 IL-graphene材料的分散性，為負載5_羥色胺和多巴胺提供了大的有效面積，為證明此結論，并根據Randles - Sevcik方程計算了修飾電極的有效面積。
[0024]Ip = 2.69 X IO5 X ^ X D1/2 X n3/2 X v1/2 X c(I)
此方程中Ip表示氧化還原峰電流，A表示修飾電極的有效面積，溶液中分子的擴散系數D是(6.70+0.02) X 1(T6 cm2/s, η表示電子轉移數，c表示氧化還原探針的濃度(mol/cm3), V表示掃速(V/s)。根據方程(I)，用DA分子作為電化學探針，得到了 A的近似值，IL-graphene/GCE 電極的有效面積(0.192 cm2)比 G0/GCE (0.119 cm2)和裸 GCE (0.071cm2)電極都大，這為負載5-羥色胺和多巴胺提供了大的有效面積，使該修飾電極對溶液響應的峰電流明顯增大。
[0025]圖5、圖6、圖7、圖8分別為IL-graphene/GCE電極在5_羥色胺溶液(圖5)，多巴胺溶液(圖6)，含3 μ M多巴胺的5-羥色胺溶液(圖7)，含I μ M 5-羥色胺的多巴胺溶液(圖8)中的差示脈沖伏安曲 線圖，圖中的插圖是相應的氧化峰電流與其濃度的線性關系圖。由圖5、圖6、圖7、圖8可以看出，分別檢測5-羥色胺和多巴胺時，5-羥色胺的線性范圍為0.7-90//Μ，檢測限為0.23//Μ，多巴胺的線性范圍為1.5-100//Μ，檢測限為0.5//Μ。在含3 μ M多巴胺的5-羥色胺溶液的混合溶液中測定5-羥色胺時，5-羥色胺的線性范圍為0.2-10//Μ，檢測限為0.067//Μ。含IyM 5-羥色胺的多巴胺溶液的混合溶液中測定多巴胺時，多巴胺的線性范圍為1.0-100//Μ，檢測限為0.33//Μ。從圖5、圖6、圖7、圖8中可以得知，如果用修飾的玻碳電極(IL-graphene/GCE)單獨檢測5-羥色胺溶液或多巴胺溶液時，它們的線性范圍一致，都約為兩個數量級，但5-羥色胺的檢測限低于多巴胺的檢測限；若同時檢測含多巴胺的5-羥色胺溶液或含5-羥色胺的多巴胺溶液時，共存物質對檢測物的檢測沒有影響，它們的線性范圍也基本一致，也都約為兩個數量級，且5-羥色胺的檢測限還是低于多巴胺的檢測限。
[0026]圖9 為 IL-graphene/GCE 分別對 1，3，5，7，9，20，30 和 40 // M 的 5_ 羥色胺和多巴胺同時檢測的差示脈沖伏安曲線圖，圖中的插圖為相應的氧化峰電流與其濃度的線性關系圖。由圖9可以看出，同時檢測5-羥色胺和多巴胺的線性范圍為1.0-40//M。圖5、圖6、圖
7、圖8和圖9說明:本發明與現有傳感器相比，既能分別檢測5-羥色胺溶液或多巴胺溶液，也能同時檢測5-羥色胺和多巴胺，從而實現了對5-羥色胺和多巴胺的同時檢測。這主要是由于該修飾電極能很好的識別5-羥色胺和多巴胺，即5-羥色胺和多巴胺在該修飾電極上的差示脈沖伏安掃描的特征峰位置不同，有分開的氧化峰，可以根據其各自的特征峰快速、準確的檢測出5-羥色胺和多巴胺的濃度，而且該修飾電極良好的離子導電性提高了 5-羥色胺和多巴胺的檢測限，檢測過程簡單，靈敏度高，快速簡便。解決了傳統的電化學方法檢測5-羥色胺和多巴胺靈敏度低，選擇性差的問題。[0027]6.修飾電極的后處理:
檢測完畢后，將修飾電極從電化學檢測池中取出，用0.05 μ M的三氧化二鋁拋光，電極表面的離子液體功能化石墨烯可以完全脫落。
【權利要求】
1.一種制備離子液體功能化石墨烯修飾電極的方法，其步驟是: a.在冰浴條件下，將石墨加入到濃硫酸中，持續攪拌，再加硝酸鈉和高錳酸鉀，得到的渾濁混合物冷卻至室溫；取水加到上述混合物中，15分鐘后，再加入25°C溫水將其稀釋，然后加入30%的雙氧水，溶液變成了亮黃色；將溶液過濾，得到的氧化石墨烯真空干燥； b.稱取氨基化的離子液體加到氧化石墨烯分散液中，再加入氫氧化鉀，然后將得到的混濁混合物進行超聲處理，分散液呈透明、均勻的液體，并將其在80°C劇烈攪拌24 h，得到的產品進行離心分離，用水和無水乙醇洗滌，風干，然后把制得的離子液體功能化石墨烯超聲分散在二次蒸餾水中得到0.5mg/mL的分散液，待用； c.將裸玻碳電極依次用0.3 μ m、0.05 μ m的三氧化二鋁懸濁液拋光成鏡面，依次經體積分數為95 %的乙醇、二次蒸餾水超聲清洗，得到處理后的裸玻碳電極；插入含有ImM鐵氰化鉀探針分子的0.1M氯化鉀電解質溶液中，并采用裸玻碳電極為工作電極、鉬柱為對電極、飽和甘汞電極為參比電極的三電極體系進行循環伏安掃描，對裸玻碳電極進行表征，再將裸玻碳電極取出用二次蒸餾水沖洗并吹干，備用； d.在上述處理好的裸玻碳電極上滴涂的離子液體功能化石墨烯分散液，并置于紅外燈下烤干，制得離子液體功能化石墨烯修飾的玻碳電極。
2.權利要求1制備的離子液體功能化石墨烯修飾的玻碳電極用于同時檢測5-羥色胺和多巴胺的方法，其步驟是: a.以離子液體功能化石墨烯修飾的玻碳電極為工作電極、鉬柱為對電極、飽和甘汞電極為參比電極，組成三電極體系，并將其共同浸入含有不同濃度5-羥色胺和多巴胺的0.2MPH為7.0磷酸鹽緩沖溶液中進行差示脈沖掃描，得到不同濃度5-羥色胺和多巴胺的差示脈沖伏安曲線圖； b.采用origin軟件作圖，繪制IL-graphene/GCE在不同濃度5-輕色胺和多巴胺溶液中的差示脈沖伏安曲線和相應的氧化峰電流與其濃度的線性關系圖。
【文檔編號】G01N27/30GK103954673SQ201410112938
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年3月25日 優先權日:2014年3月25日
【發明者】劉秀輝, 劉盼盼, 董明君, 盧小泉 申請人:西北師范大學
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