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專利名稱：一種基于顯微紅外光譜技術(shù)快速檢測(cè)副溶血弧菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及食品安全領(lǐng)域，具體地涉及一種檢測(cè)副溶血弧菌的方法。
背景技術(shù)：
副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一種革蘭氏陰性嗜鹽桿菌,在海產(chǎn)品中的攜帶率高達(dá)45.7%，在我國(guó)部分沿海地區(qū)，由副溶血弧菌引起的食物中毒在細(xì)菌性食物中毒事件中居首位。經(jīng)加熱、冷凍、脫水等處理后，細(xì)菌或被殺死，或無損的存活下來，還有一些可能受到了亞致死性損傷。在適當(dāng)條件下，受損細(xì)菌可以修復(fù)損傷并恢復(fù)包括毒力和繁殖能力在內(nèi)的所有生理活性，仍具有致病性，嚴(yán)重威脅人類健康。因此，檢測(cè)副溶血弧菌及其亞致死損傷對(duì)于食品安全監(jiān)控和人類健康都具有重要意義。對(duì)于細(xì)菌的鑒定，常規(guī)培養(yǎng)檢測(cè)方法包括增菌培養(yǎng)、選擇性培養(yǎng)、生化試驗(yàn)和血清學(xué)反應(yīng)等過程，耗時(shí)長(zhǎng)、操作繁瑣、檢出率低，不適應(yīng)實(shí)際檢驗(yàn)工作的需要。以免疫學(xué)為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法利用抗原抗體反應(yīng)的顯著特異性，包括ELISA、免疫熒光法和放射免疫試驗(yàn)等?；诤怂岬臋z測(cè)方法如PCR技術(shù)可以在很短時(shí)間內(nèi)將幾個(gè)甚至一個(gè)目標(biāo)序列擴(kuò)增到幾百萬(wàn)個(gè)拷貝，為致病菌檢測(cè)提供了一種快速、靈敏、特異的檢測(cè)方法，但對(duì)于食品樣品中的抑制物質(zhì)非常敏感，有時(shí)會(huì)給出假陰性結(jié)果。目前已公開的副溶血弧菌檢測(cè)相關(guān)的兩個(gè)專利包括實(shí)用新型專利“用于檢測(cè)腸道感染的集合膠體金試紙”(中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?201120375786.7)和發(fā)明專利“PCR-焦磷酸法檢測(cè)副溶血弧菌的檢測(cè)引物、試劑盒和檢測(cè)方法”(中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?201210272737.X)。對(duì)于亞致死損傷細(xì)菌的檢測(cè)，現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)是:常規(guī)培養(yǎng)法工作量大，檢測(cè)周期長(zhǎng)，且可能低估甚至給出假陰性結(jié)果；微生物表面形態(tài)觀察法，則對(duì)實(shí)驗(yàn)者的操作技能要求較高，且儀器昂貴；基因芯片法價(jià)格昂貴，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，需要專業(yè)人員操作等。目前已公開的損傷細(xì)菌檢測(cè)相關(guān)的專利僅有發(fā)明專利“熒光法快速測(cè)定活細(xì)菌總數(shù)”(中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?200810140095.1)。紅外光譜技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、分析速度快、成本低、應(yīng)用范圍廣、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，顯微紅外光譜技術(shù)將光學(xué)顯微鏡與紅外光譜技術(shù)相結(jié)合，比普通紅外光譜技術(shù)更快、更靈敏、更簡(jiǎn)便。但紅外譜圖提供的信息較復(fù)雜，樣品之間差異細(xì)微，一般需要結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)深入分析。紅外光譜技術(shù)在微生物檢測(cè)中的應(yīng)用興起于上世紀(jì)九十年代，目前，國(guó)內(nèi)外尚未見到利用紅外光譜技術(shù)研究副溶血弧菌亞致死損傷的報(bào)道，且大多采用普通紅外技術(shù)研究細(xì)菌。目前未見利用紅外光譜技術(shù)對(duì)副溶血弧菌進(jìn)行鑒定和不同狀態(tài)檢測(cè)的專利。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)發(fā)展情況，本發(fā)明的目的就是提供一種快速、簡(jiǎn)便的基于顯微紅外光譜技術(shù)檢測(cè)副溶血弧菌的方法。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的:首先利用顯微紅外光譜儀，通過高級(jí)功能“Map view”自動(dòng)采集不同類別細(xì)菌或不同狀態(tài)副溶血弧菌的多張紅外譜圖，進(jìn)行二階導(dǎo)轉(zhuǎn)換等數(shù)據(jù)預(yù)處理。繼而對(duì)每個(gè)菌株的24個(gè)樣本，分別提取四個(gè)特征中紅外波段(3000-2800011'1800-1500011'1500-1200011'UOO-SOOcnT1) 二階導(dǎo)數(shù)譜的波數(shù)和峰值，進(jìn)行主成分分析(PCA)，建立每個(gè)波段的鑒別模型。最后同樣提取四個(gè)特征波段二階導(dǎo)數(shù)譜的信息，從每個(gè)菌株的24個(gè)樣本中隨機(jī)選取14個(gè)加入訓(xùn)練集，剩下10個(gè)加入預(yù)測(cè)集，進(jìn)行類模擬軟獨(dú)立建模(SMCA)分析，預(yù)測(cè)未知樣本，驗(yàn)證每個(gè)波段模型的可靠性。通過以上步驟既可以特異鑒定副溶血弧菌，也可以檢測(cè)正常和不同程度損傷狀態(tài)的副溶血弧菌。本發(fā)明所述的基于顯微紅外光譜技術(shù)快速檢測(cè)副溶血弧菌的方法，包括如下步驟:(I)制備待檢樣品培養(yǎng)待測(cè)菌株，收集菌體，將菌體懸浮于生理鹽水中，取菌懸液滴在BaF2鹽片上，干燥；(2)光譜采集利用顯微紅外光譜儀采集細(xì)菌的微區(qū)域吸收信號(hào)，獲得原始譜圖(map)文件；(3)數(shù)據(jù)預(yù)處理將原始譜圖(map)文件轉(zhuǎn)換成紅外譜圖，并將紅外譜圖進(jìn)行二階導(dǎo)轉(zhuǎn)換；(4)主成分分析(Principle Component Analysis, PCA)提取特征波段二階導(dǎo)數(shù)譜的信息，進(jìn)行主成分分析(Principle ComponentAnalysis，PCA)建立不同類別或不同狀態(tài)細(xì)菌的鑒別模型；(5)模型驗(yàn)證利用類模擬軟獨(dú)立建模(SoftIndependent Modeling of Class Analogy, SIMCA)預(yù)測(cè)不同類別或不同狀態(tài)的細(xì)菌，驗(yàn)證模型可靠性。優(yōu)選地，所述利用類模擬軟獨(dú)立建模(Soft Independent Modeling of ClassAnalogy, SIMCA)預(yù)測(cè)，是指提取所述特征波段二階導(dǎo)數(shù)譜的信息，將每個(gè)菌株的樣本隨機(jī)分為訓(xùn)練集和預(yù)測(cè)集，對(duì)訓(xùn)練集中每一類樣本測(cè)量數(shù)據(jù)矩陣，建立主成分回歸模型，計(jì)算未知樣本到各類模型的SIMCA距離，以確定未知樣本類別，根據(jù)SIMCA結(jié)果統(tǒng)計(jì)每類樣本在每個(gè)波段的預(yù)測(cè)率和拒絕率，驗(yàn)證模型可靠性具體操作如下:(I)制備待檢樣品將5 μ L溶于生理鹽水的菌懸液滴在BaF2鹽片(Φ 10 X 2mm)上，均勻鋪開，干燥器中放置30min，晾干后上機(jī)檢測(cè)。每塊鹽片上同時(shí)滴5個(gè)樣品，3孔透射支架同時(shí)放置3塊鹽片，一次可完成15個(gè)樣品的測(cè)試。(2)光譜采集利用高級(jí)功能“Map view” 一次自動(dòng)采集8個(gè)微區(qū)域的吸收信號(hào)，光闌為100 μ mX 100 μ m,步長(zhǎng)為100 μ mX 100 μ m,對(duì)每個(gè)類別或狀態(tài)的菌株均準(zhǔn)備3份平行樣品，共獲得3個(gè)map文件。采集參數(shù)為:掃描范圍ΜΟΟΟ-ΘΟΟαιΓ1 ;采集時(shí)間:3s，即16張干涉圖加和；分辨率AcnT1。 (3)數(shù)據(jù)預(yù)處理將每個(gè)原始map文件轉(zhuǎn)換成8張紅外譜圖，選取4000-800(^1波段進(jìn)行大氣背景抑制、自動(dòng)基線校正、歸一化(使酰胺譜帶I1655CHT1的吸收強(qiáng)度等于1)，采用Savitzky-Golay模式，平滑點(diǎn)數(shù)為7，多項(xiàng)式次數(shù)為3，將譜圖進(jìn)行二階導(dǎo)轉(zhuǎn)換。(4) PCA 分析提取以下四個(gè)中紅外特征波段二階導(dǎo)數(shù)譜的波數(shù)和峰值，分別進(jìn)行后續(xù)的PCA分析和 SMCA 分析:3000-2800cm_1U800-1500cm_1U500-1200cm_1U200-800cm_1o 對(duì)每個(gè)菌株的24個(gè)樣本，分別提取上述四個(gè)特征波段二階導(dǎo)數(shù)譜的信息，進(jìn)行PCA分析。PCA屬于無監(jiān)督的分類方法，可將多維的數(shù)據(jù)壓縮成幾個(gè)主要、獨(dú)立的潛在變量(主成分，PC)，這些主成分保存了最相關(guān)和最具代表性的信息。PCl表示能描述目標(biāo)多維數(shù)據(jù)矩陣中最顯著的特性，PC2表示除PCl之外的所能描述目標(biāo)多維數(shù)據(jù)矩陣中最顯著的特性。二維PCA示意圖可直觀區(qū)分不同類別或不同狀態(tài)的細(xì)菌，從而建立每一個(gè)波段的鑒別模型。(5) SIMCA 分析驗(yàn)證對(duì)每個(gè)菌株的24個(gè)樣本，分別提取步驟(4)中四個(gè)特征波段二階導(dǎo)數(shù)譜的信息，從每個(gè)菌株的24個(gè)樣本中隨機(jī)選取14個(gè)加入訓(xùn)練集，剩下10個(gè)加入預(yù)測(cè)集；對(duì)訓(xùn)練集中每一類樣本測(cè)量·數(shù)據(jù)矩陣，建立主成分回歸模型；計(jì)算未知樣本到各類模型的SMCA距離，以確定未知樣本類別；根據(jù)SIMCA結(jié)果統(tǒng)計(jì)每類樣本在每個(gè)波段的預(yù)測(cè)率和拒絕率，考察模型可靠性。本發(fā)明利用顯微紅外光譜儀采集不同類別或狀態(tài)的細(xì)菌譜圖(均為純培養(yǎng)物)，對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行一系列預(yù)處理后，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)中的PCA和SMCA，可特異鑒定副溶血弧菌，也可以檢測(cè)正常和不同程度損傷狀態(tài)的副溶血弧菌。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是:檢測(cè)快速，操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，特異性強(qiáng)，結(jié)果可靠；1、結(jié)果可靠，對(duì)于亞致死損傷副溶血弧菌的檢測(cè)，紅外光譜的結(jié)果得到了傳統(tǒng)經(jīng)典的培養(yǎng)法的驗(yàn)證。2、特異性強(qiáng)，可特異性鑒定副溶血弧菌。3、快速，顯微紅外光譜儀I小時(shí)可采集大于120張譜圖，從樣品前處理到完成數(shù)據(jù)處理的整個(gè)檢測(cè)過程不超過一天。4、簡(jiǎn)單，前處理只需簡(jiǎn)單離心，儀器操作簡(jiǎn)單，“Map view”可自動(dòng)采集多個(gè)微區(qū)域的紅外譜圖。5、靈敏度高，只需5 μ L濃縮菌液就可獲得很強(qiáng)的紅外信號(hào)。6、普及性強(qiáng)，操作者容易學(xué)習(xí)和掌握。7、適用范圍廣，不僅可用于副溶血弧菌的檢測(cè)，也可推廣用于其他食源性致病菌和細(xì)菌的檢測(cè)。8、應(yīng)用領(lǐng)域多，即可應(yīng)用于副溶血弧菌的鑒定，也可應(yīng)用于副溶血弧菌存活和亞致死等各種不同狀態(tài)的檢測(cè)。


圖1 為不同菌株區(qū)分的 PCA 示意圖，A:1200-800(^1 ；B:1500-1200(^1 ；C:1800-1500cm_1 ；D:3000-2800cm_1 ；I:Vibrio parahaemolyticus ATCC17802 ；II:Listeriamonocytogenes EDGe0圖2為未受損與不同程度受損副溶血弧菌ATCC17802區(qū)分的PCA示意圖，A:1200-8000^1 ；B:1500-1200cm_1 ；C: 1800-1500cm_1 ；D:3000-2800cm_1 ；1:未受損；I1:加熱2min ；II1:加熱 4min ；IV:加熱 6min ；V:加熱 8min。本發(fā)明中，所用試劑、儀器以及菌株均可從市售獲得。所用菌株副溶血弧菌Vibrioparahaemolyticus ATCC17802和單增李斯特菌Listeria monocytogenes EDGe購(gòu)自中國(guó)微生物菌種網(wǎng)。不同菌株類型，并不影響本發(fā)明的鑒定效果。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖和附表通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明。實(shí)施例1:基于顯微紅外光譜技術(shù)快速鑒定副溶血弧菌

菌液制備:將供試菌株Vibrio parahaemolyticus ATCC17802 從 _80°C超低溫冰箱中取出，在TCBS培養(yǎng)基上37°C劃線培養(yǎng)16h，挑取典型單菌落，接種于200mL含3%NaCl的胰蛋白胨大豆肉湯中，37°C下175rpm過夜振蕩培養(yǎng)至穩(wěn)定期；將供試菌株Listeriamonocytogenes EDGe從_80°C超低溫冰箱中取出，在TSA-YE培養(yǎng)基上37°C劃線培養(yǎng)18 24h，挑取典型單菌落，接種于200mL胰蛋白胨大豆肉湯中，37°C下250rpm振蕩培養(yǎng)24h至穩(wěn)定期。取IOmL菌液加入50mL離心管中，4000r/min離心4min收集細(xì)胞。為消除代謝產(chǎn)物和培養(yǎng)基對(duì)細(xì)菌紅外譜圖的影響，將細(xì)胞用IOmL無菌生理鹽水洗滌兩次后，倒掉生理鹽水收集菌體，重新懸浮于200 μ L生理鹽水中，供光譜分析。每個(gè)菌株各做3次平行試驗(yàn)，獲得3個(gè)平行樣品。光譜采集:取5 μ L菌液直接滴在BaF2片上，干燥器中放置半小時(shí)，待水分蒸干后，上顯微紅外光譜儀進(jìn)行測(cè)試。每塊鹽片上同時(shí)滴3個(gè)樣品，3孔透射支架同時(shí)放置2塊鹽片，在短時(shí)間內(nèi)完成了 6個(gè)樣品的測(cè)試。掃描范圍:4000-600(31^1 ;采集時(shí)間:3s ;分辨率:ScnT1 ;通過面掃描(Map View)模式,每個(gè)樣品采集8張圖譜,獲得I個(gè)map文件,步長(zhǎng)為100 μ mX 100 μ m，光闌為ΙΟΟμπιΧΙΟΟμπι。每個(gè)菌株共有24張圖譜。數(shù)據(jù)預(yù)處理:將原始map文件轉(zhuǎn)換成8張紅外譜圖，選取4000-8000^1波段進(jìn)行大氣背景抑制、自動(dòng)基線校正、歸一化(使酰胺譜帶I1655CHT1的吸收強(qiáng)度等于1)，采用Savitzky-Golay模式(平滑點(diǎn)數(shù)為7，多項(xiàng)式次數(shù)為3)將譜圖進(jìn)行二階導(dǎo)轉(zhuǎn)換。提取以下四個(gè)特征波段二階導(dǎo)數(shù)譜的波數(shù)和峰值，分別進(jìn)行后續(xù)的PCA分析和SIMCA分析:3000-2800cm_1U800-1500cm_1U500-1200cm_1U200-800cm_1oPCA分析:對(duì)每個(gè)菌株的24個(gè)樣本，分別提取四個(gè)特征波段二階導(dǎo)數(shù)譜的信息，進(jìn)行PCA分析。從二維PCA示意圖(圖1)可以看出，在四個(gè)光譜波段中，單核細(xì)胞增生李斯特菌與副溶血弧菌能夠各自聚成一組，彼此區(qū)分開。PCA結(jié)果表明，紅外光譜法能夠特異地鑒定副溶血弧菌與單核細(xì)胞增生李斯特菌，從而建立了副溶血弧菌的特異鑒定模型。SIMCA分析:首先對(duì)每個(gè)菌株的24個(gè)樣本，分別提取四個(gè)特征波段二階導(dǎo)數(shù)譜的信息，從每個(gè)菌株中隨機(jī)抽取14個(gè)樣本加入訓(xùn)練集(共28個(gè)樣本)，剩余的10個(gè)樣本加入預(yù)測(cè)集(共20個(gè)樣本)；然后分別計(jì)算各類的主成分回歸模型；最后根據(jù)未知樣本到各類模型的距離進(jìn)行模式判別。根據(jù)SIMCA結(jié)果統(tǒng)計(jì)每類樣本在每個(gè)波段的預(yù)測(cè)率和拒絕率，驗(yàn)證模型可靠性。預(yù)測(cè)率考察某類樣品有多少落在該類模型的區(qū)域內(nèi)，而拒絕率是考察某類樣品模型對(duì)于其它不屬于該類的未知樣品的拒絕程度，當(dāng)兩個(gè)值都為100%時(shí)，表明某類樣品與其他類樣品之間沒有重疊，可以較好地將其聚類分開。從表I可見，兩個(gè)菌株都在四個(gè)光譜區(qū)域都取得了 100%的預(yù)測(cè)率和100%的拒絕率，即在每一個(gè)波段中，每一個(gè)菌株的10個(gè)未知樣本都被正確歸類，都能將非本組的10個(gè)細(xì)菌樣本全部排斥在外。SIMCA結(jié)果表明，PCA模型可靠度高，能夠有效地預(yù)測(cè)未知樣本的歸屬。實(shí)施例2:基于顯微紅外光譜技術(shù)快速檢測(cè)熱激亞致死損傷的副溶血弧菌熱激試驗(yàn):供試菌株Vibrio parahaemolyticus ATCC17802 從 _80°C超低溫冰箱中取出，在TCBS培養(yǎng)基上37°C劃線培養(yǎng)16h，挑取典型單菌落，接種于200mL含3%NaCl的胰蛋白胨大豆肉湯中，37°C下175rpm過夜振蕩培養(yǎng)至穩(wěn)定期。取IOmL菌液加入50mL離心管中，4000r/min離心4mi n收集細(xì)胞。為消除代謝產(chǎn)物和培養(yǎng)基對(duì)細(xì)菌紅外譜圖的影響，將細(xì)胞用IOmL無菌生理鹽水洗滌兩次后，重新懸浮于5mL生理鹽水中，制得熱處理培養(yǎng)液。每個(gè)處理皆準(zhǔn)備3個(gè)平行樣品。將I個(gè)熱處理培養(yǎng)液作為空白對(duì)照，另外4個(gè)裝有5mL熱處理培養(yǎng)液的離心管同時(shí)浸入55°C水浴,彼此保有一定空間以利于熱傳導(dǎo),分別于2、4、6、Smin后取出并立即置于冰浴上冷卻至少5min。每熱激試驗(yàn)重復(fù)3次。光譜采集:將菌液離心，倒掉生理鹽水收集菌體，重新懸浮于200 μ L生理鹽水中。取5 μ L菌液直接滴在BaF2片上，干燥器中放置半小時(shí)，待水分蒸干后，上顯微紅外光譜儀進(jìn)行測(cè)試。每塊鹽片上同時(shí)滴5個(gè)樣品，3孔透射支架同時(shí)放置3塊鹽片，在短時(shí)間內(nèi)完成了15個(gè)樣品的測(cè)試。掃描范圍:4000-600(^1 ;采集時(shí)間:3s ;分辨率:8(^1 ;通過面掃描(MapView)模式，每個(gè)樣品采集8張圖譜，步長(zhǎng)為100 μ mX 100 μ m，光闌為ΙΟΟμπιΧΙΟΟμπι。每個(gè)菌株共有24張圖譜。數(shù)據(jù)預(yù)處理:將原始map文件轉(zhuǎn)換成8張紅外譜圖，選取4000-8000^1波段進(jìn)行大氣背景抑制、自動(dòng)基線校正、歸一化(使酰胺譜帶I1655CHT1的吸收強(qiáng)度等于1)，采用 Savitzky-Golay 模式(7-point, polynomial degree3)將譜圖進(jìn)行二階導(dǎo)轉(zhuǎn)換。提取以下四個(gè)特征波段二階導(dǎo)數(shù)譜的波數(shù)和峰值，分別進(jìn)行后續(xù)的PCA分析和SIMCA分析:3000-2800cm_1U800-1500cm_1U500-1200cm_1U200-800cm_1oPCA分析:對(duì)每個(gè)菌株的24個(gè)樣本，分別提取四個(gè)特征波段二階導(dǎo)數(shù)譜的信息，進(jìn)行PCA分析。從二維PCA示意圖(圖2)可以看出，在四個(gè)光譜波段中，正常細(xì)菌與受損傷細(xì)菌能夠清楚、完全地區(qū)分開，而受損傷程度不同的細(xì)菌也能基本分離，從而建立了正常和不同程度亞致死損傷副溶血弧菌的鑒別模型。SIMCA分析:首先對(duì)每個(gè)菌株的24個(gè)樣本，分別提取四個(gè)特征波段二階導(dǎo)數(shù)譜的信息，從每個(gè)菌株中隨機(jī)抽取14個(gè)樣本加入訓(xùn)練集(共70個(gè)樣本)，剩余的10個(gè)樣本加入預(yù)測(cè)集(共50個(gè)樣本)；然后分別計(jì)算各類的主成分回歸模型；最后根據(jù)未知樣本到各類模型的距離進(jìn)行模式判別。根據(jù)SIMCA結(jié)果統(tǒng)計(jì)每類樣本在每個(gè)波段的預(yù)測(cè)率和拒絕率，驗(yàn)證模型可靠性。從表2可見，除3個(gè)例外，不同程度熱損傷(包括未受損)的副溶血弧菌的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確程度均大于80% ;拒絕率均大于90%。SIMCA結(jié)果表明，四個(gè)光譜區(qū)域模型的預(yù)測(cè)程度都較好。以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，并不用于限制本發(fā)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、改進(jìn)等，均應(yīng)包括在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
表I不同菌株的SIMCA判別結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種基于顯微紅外光譜技術(shù)快速檢測(cè)副溶血弧菌的方法，包括以下步驟: (1)制備待檢樣品 培養(yǎng)待測(cè)菌株，收集菌體，將菌體懸浮于生理鹽水中，取菌懸液滴在BaF2鹽片上，干燥； (2)光譜采集 利用顯微紅外光譜儀采集菌株的微區(qū)域吸收信號(hào)，獲得原始圖譜文件； (3)數(shù)據(jù)預(yù)處理 將原始圖譜文件轉(zhuǎn)換成紅外譜圖，并將紅外譜圖進(jìn)行二階導(dǎo)轉(zhuǎn)換； (4)主成分分析 提取特征波段二階導(dǎo)數(shù)譜的信息，進(jìn)行主成分分析建立不同類別或不同狀態(tài)細(xì)菌的鑒別豐旲型; (5)模型驗(yàn)證 利用類模擬軟獨(dú)立建模預(yù)測(cè)不同類別或不同狀態(tài)的細(xì)菌，驗(yàn)證模型可靠性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于顯微紅外光譜技術(shù)快速檢測(cè)副溶血弧菌的方法，其特征在于:所述的副溶血弧菌為純培養(yǎng)物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的 基于顯微紅外光譜技術(shù)快速檢測(cè)副溶血弧菌的方法，其特征在于:所述步驟(2)中，利用顯微紅外光譜儀采集菌株的紅外譜圖，是指利用顯微紅外光譜儀自動(dòng)采集微區(qū)域的吸收信號(hào)，光闌為100 μ mX 100 μ m，步長(zhǎng)為100 μ mX 100 μ m，采集參數(shù)為:掃描范圍，4000-6000^1 ;采集時(shí)間，3s ;分辨率，8CHT1。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基于顯微紅外光譜技術(shù)快速檢測(cè)副溶血弧菌的方法，其特征在于:所述步驟(2)中一次自動(dòng)采集8個(gè)微區(qū)域的吸收信號(hào)，對(duì)每個(gè)待測(cè)菌株均準(zhǔn)備3份平行樣品，進(jìn)行檢測(cè)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于顯微紅外光譜技術(shù)快速檢測(cè)副溶血弧菌的方法，其特征在于:所述步驟(3)中， 所述將原始圖譜文件轉(zhuǎn)換成紅外譜圖，條件為選取^OO-SOOcnT1波段進(jìn)行大氣背景抑制、自動(dòng)基線校正、歸一化，使酰胺譜帶I1655CHT1的吸收強(qiáng)度等于I。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于顯微紅外光譜技術(shù)快速檢測(cè)副溶血弧菌的方法，其特征在于:所述步驟(4)中所述特征波段是指3000-2800011^1800-1500011^1500-12000^1和1200-800cm_1 波段。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于顯微紅外光譜技術(shù)快速檢測(cè)副溶血弧菌的方法，其特征在于:所述步驟(4)中 所述二階導(dǎo)數(shù)譜的信息是指二階導(dǎo)數(shù)譜的波數(shù)和峰值； 所述主成分分析是指二維主成分分析。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于顯微紅外光譜技術(shù)快速檢測(cè)副溶血弧菌的方法，其特征在于:所述步驟(5)中， 所述利用類模擬軟獨(dú)立建模預(yù)測(cè)，是指提取所述特征波段二階導(dǎo)數(shù)譜的信息，將每個(gè)菌株的樣本隨機(jī)分為訓(xùn)練集和預(yù)測(cè)集，對(duì)訓(xùn)練集中每一類樣本測(cè)量數(shù)據(jù)矩陣，建立主成分回歸模型，計(jì)算未知樣本到各類模型的類模擬軟獨(dú)立建模距離，以確定未知樣本類別，根據(jù)類模擬軟獨(dú)立建模結(jié)果統(tǒng)計(jì)每類樣本在每個(gè)波段的預(yù)測(cè)率和拒絕率，驗(yàn)證模型可靠性。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的基于顯微紅外光譜技術(shù)快速檢測(cè)副溶血弧菌的方法，其特征在于:所述步驟(3)中，采用Savitzky-Golay模式，設(shè)置平滑點(diǎn)數(shù)為7，多項(xiàng)式次數(shù)為3。
10.根據(jù)上述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的基于顯微紅外光譜技術(shù)快速檢測(cè)副溶血弧菌的方法，其特征在于:所述方法能夠特異鑒定副溶血弧菌，也能夠檢測(cè)正常和不同程度損傷狀態(tài)的副溶血 弧菌。
全文摘要
本發(fā)明涉及食品安全領(lǐng)域，建立了一種基于顯微紅外光譜技術(shù)快速檢測(cè)副溶血弧菌的方法。本發(fā)明方法為利用顯微紅外光譜儀采集細(xì)菌的紅外譜圖，進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理后提取特征中紅外波段(3000-2800cm-1、1800-1500cm-1、1500-1200cm-1、1200-800cm-1)的信息，進(jìn)行主成分分析(Principle Component Analysis,PCA)以建立鑒別模型，進(jìn)行類模擬軟獨(dú)立建模分析(Soft Independent Modeling of Class Analogy,SIMCA)以驗(yàn)證模型可靠性。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是結(jié)果可靠，特異性強(qiáng)，檢測(cè)快速，操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，普及性強(qiáng)，應(yīng)用范圍廣；可特異鑒定副溶血弧菌；可檢測(cè)正常和不同程度損傷狀態(tài)的副溶血弧菌。
文檔編號(hào)G01N21/35GK103149173SQ201310072019
公開日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2013年3月6日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月6日
發(fā)明者史賢明, 喻文娟, 施春雷, 侯靜文, 王瑞斌, 朱邦尚, 王大鵬 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)