一種同時測定三種芳香族氨基酸含量的方法
【專利摘要】本發明公開了一種同時測定三種芳香族氨基酸含量的液相色譜方法，步驟包括：a.選用色譜柱規格為4.6×250mmi.d,5μm的watersC18柱；b.以15%甲醇-85%磷酸鹽溶液為流動相，流動相流速為0.9mL/min，待測樣品經2%的高氯酸去蛋白后，采用超聲提取，離心后調節pH為6.0，取30微升上清液直接進樣測定，外標法定量；c.利用二極管陣列檢測器對三種芳香族氨基酸的進行檢測，一次進樣可以同時得到這三種芳香族氨基酸的全波段掃描圖譜，采集到三種氨基酸在每一個瞬間的光譜圖，直觀地鑒定色譜峰的純度，對比標準品和待測樣品的全波段掃描圖譜進行定性。本發明操作簡便、靈敏度高，定性準確。
【專利說明】 一種同時測定三種芳香族氨基酸含量的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于分析化學領域，涉及檢測三種芳香族氨基酸的方法，特別涉及用高效液相色譜法一二極管陣列法同時測定水產品中三種芳香族氨基酸含量的方法。
【背景技術】
[0002]芳香族氨基酸為含有芳香環側鏈的氨基酸,包括苯丙氨酸(Phenylalanine, Phe)>酪氨酸(Tyrosine, Tyr)、色氨酸(Tryptophane, Trp)等三種氨基酸,其中Phe和Trp屬于必需氨基酸，Tyr則屬于半必需氨基酸。芳香族氨基酸在肝、腎、神經等疾病診斷中有很重要的作用，且它們對水產食品的營養風味也有重要的貢獻。因此，準確測定芳香族氨基酸在蛋白質化學研究中有非常重要的意義。
[0003]目前國內外測定芳香族氨基酸的方法主要有高效液相色譜法、熒光分光光度計法、毛細管電泳法、質譜法等。如:陶玉貴等用毛細管電泳法測定發酵液中L-色氨酸的含量(食品與發酵工業，2008，34 (9):140-143)，唐愛國發明了一種高效液相色譜-熒光法同時測定血清中芳香族氨基酸含量的方法(專利號:CN 102128893 A)，陳舜勝等用HPLC法快速測水產品中游離芳香族氨基酸含量的研究(上海海洋大學學報2013，22 (4):629-633)等；其中以HPLC衍生法為主，因其靈敏度高、設備要求適中以及操作簡便。由于Phe、Tyr及Trp的熒光特性不一致，用熒光分光光度計法不能在同一波長下同時對其測定；毛細管電泳法和質譜法的分辨率較高，但也有儀器昂貴、重復性較差等不足之處。
[0004]本發明利用Tyr、Phe和Trp含有不飽和共軛環狀結構，可用二極管陣列檢測器(Photo D1dearray, PDA)對被測物質進行測定并全波長掃描,一次進樣可以得到三種芳香族氨基酸的全波段掃描圖譜，包括三種芳香族氨基酸各自的最大吸收波長進行檢測，比常規紫外可見吸收檢測器的靈敏度更高，定量更準確。由于PDA檢測器具備隨峰快速掃描的特性，在色譜分析同時能夠采集色譜流出物在每一個瞬間的光譜圖，因而可以直觀地鑒定色譜峰的純度，從而對檢測數據作出合理取舍，保證結果更準確，定性更可靠。
【發明內容】
[0005]本發明目的是針對以上現有技術的前處理復雜、靈敏度低、回收率不高、定性不準確等不足，提供一種操作簡單，靈敏度高、分離速度快且定量定性準確，能夠同時測定水產品中三種芳香族氨基酸的HPLC-PDA法，
為實現上述目的，本發明采用的技術方案為:
一種用高效液相色譜一二極管陣列檢測器同時測定水產品中三種芳香族氨基酸含量的方法，包括以下步驟:
流動相為A:B = 15:85，A為甲醇溶液，B為0.05 mol/L磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀溶液，用磷酸調pH至6.0 ;等度洗脫；流速:0.9 mL/min ;進樣量為30微升；柱溫為40°C。
[0006]流動相使用前用0.45 μ m的水相微孔濾膜過濾后，超聲脫氣10分鐘。
[0007]色譜柱選用Waters Atlantis T3 C18 (4.6 X 250mm, 5 μ m)作為色譜固定相。
[0008]用二極管陣列檢測器掃描確定檢測三種氨基酸的最佳檢測波長,確定Tyr、Phe和Trp的最佳紫外檢測波長分別為274.5nm、256.7nm和279.3nm。
[0009]Tyr、Phe和Trp的標準溶液是用2%的高氯酸溶液溶解、混勻；分別配制濃度1000 μ g/mL、500 μ g/mL、250 μ g/mL。
[0010]用2%的高氯酸溶液提取三種芳香族氨基酸。
[0011]制作標準工作曲線，定性定量方法、評價精密度和考察回收率。
[0012]本發明的優選技術方案為:
配制流動相，由15%的甲醇和85%磷酸鹽溶液組成，磷酸鹽溶液由0.05 mol/L磷酸二氫鉀及磷酸二氫鉀(1:1)組成，PH范圍為6.0?6.3。因采用15%的甲醇和85%磷酸鹽溶液分離出的三種待測氨基酸峰型好，且柱壓也不高，分離速度快、效率高；PH范圍為6.0?
6.3對三種氨基酸的分離效果好。
[0013]以規格為4.6X250_ 1.d, 5 μ m的waters C18色譜柱為固定相。
[0014]用2%的高氯酸溶液配制三種芳香族氨基酸標準混合儲備液。
[0015]取新鮮水產品肉，用2%的高氯酸溶液勻漿、超聲、離心提取，采用2%的高氯酸溶液作為提取劑，對提取水產品中的三種氨基酸回收率高，特別對色氨酸提取效果好。
[0016]設置流動相流速為1.0mL/min,進樣量為30微升。
[0017]將芳香族氨基酸經色譜柱分離后，用二極管陣列檢測器進行分析，選擇Tyr、Phe和Trp的最佳紫外檢測波長進行測定。
[0018]通過外標法進行定量，并通過對比樣品和標準品中三種芳香族氨基酸的全波段色譜掃描圖譜的相似程度，鑒定色譜峰的純度。
[0019]流動相的具體配制方案為:調節流動相中的磷酸鹽溶液pH為6.0,甲醇和磷酸鹽溶液使用前用0.45 μ m的微孔濾膜過濾,超聲脫氣lOmin。
[0020]標準溶液的具體配制方案為:用2%的高氯酸溶液配制三種芳香族氨基酸標準混合儲備液，使Phe、Tyr及Trp的濃度分別為1000 μ g/mL,500 μ g/mL,250 μ g/mL,并用2%的高氯酸溶液將氨基酸標準混合儲備液依次稀釋2、5、10、20、50倍。
[0021]樣品前處理的具體方案為:取新鮮水產品肉5.0g于離心管中，加入1mL預冷5%的高氯酸勻衆2min,用玻璃棒攪拌均勻，超聲提取5min后,在冷凍離心機4°C下1000rpm離心20min，取上清液過濾，過濾后所剩的沉淀物加入預冷的2% PCA溶液再進行浸提、離心，重復2次后合并上清液。用KOH溶液中和上清液至pH為6.0。中和時先加5mol/L的KOH溶液調節，待接近至所需pH=6.0時，改用lmol/L的KOH溶液調節。
[0022]芳香族氨基酸經Waters Atlantis T3 C18分離后，進入二極管陣列檢測器檢測，Tyr、Phe及Trp三種物質的檢測波長設定分別為274.5,256.7和279.3nm。
[0023]本發明的創新在于可以同時測定水產品中芳香族氨基酸含量，且本方法具有操作簡便、靈敏度高、無需柱前衍生等優點。
[0024]本發明巧妙利用芳香族氨基酸含有不飽和共軛環狀結構，建立了一種同時測定水產品中芳香族氨基酸含量的HPLC-PAD法。水產品去蛋白后取上清液直接進樣，Tyr、Phe和Trp通過色譜柱分離后，采用PAD檢測器進行檢測，本發明明顯優于已公開的技術，操作快速、簡便、靈敏度高，又能達到同時測定水產品中三種芳香族氨基酸含量的要求，因此是一項非常值得廣泛應用和推廣的技術。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0025]圖1為Tyr、Phe及Trp的紫外210?400nm的掃描光譜圖。
[0026]圖2為混合標準品芳香族氨基酸的色譜圖。
[0027]圖3為蝦肉樣品的液相色譜圖。
[0028]圖4為標準添加后的液相色譜圖。
[0029]
【具體實施方式】
[0030]以下結合實施例旨在進一步說明本發明，而非限制本發明。
[0031]實施例1
用2%的高氯酸溶液配制三種芳香族氨基酸標準混合儲備液，使Phe、Tyr及Trp的濃度分別為1000 μ g/mL、500 μ g/mL、250 μ g/mL,并用2%的高氯酸溶液將氨基酸標準混合儲備液依次稀釋2、5、10、20、50倍，分別取上述30 μ L混合標準溶液進行上機測定，根據保留時間定性，以所測峰面積與其相應的濃度作圖，并繪制標準曲線。
[0032]取新鮮蝦肉5.0g于離心管中，加入1mL預冷2%的高氯酸勻漿2min，用玻璃棒攪拌均勻，超聲5min后，在冷凍離心機4°C下1000rpm離心20min，取上清液過濾，過濾后所剩的沉淀物加入預冷的2%高氯酸溶液再進行浸提、離心，重復2次后合并上清液，用KOH溶液中和上清液至PH為6.0。中和時先加5mol/L的KOH溶液調節，待接近至所需pH=6.0時，改用lmol/L的KOH溶液調節。用超純水定容至50 mL容量瓶中。取上述樣液2mL，經孔徑為0.45 μ m的水相微孔濾膜過濾后，上機進樣分析，完成三種芳香族氨基酸的分離與測定。
[0033]工作原理和工作過程:
用自動進樣器吸取30 μ L待測物質進入流動相中，待測物質隨著流動相甲醇和磷酸鹽緩沖液一起流入色譜柱中，Waters Atlantis T3 C18色譜柱將Tyr、Phe及Trp分離,使Tyr、Phe及Trp依次到達二極管陣列檢測器進行檢測。
[0034]通過二極管陣列檢測器掃描確定Tyr、Phe和Trp的最佳紫外檢測波長分別為274.5nm、256.7nm和279.3nm。本發明樣品處理簡單，在進樣12min內即可完成檢測。
[0035]本發明方法的建立過程:
I儀器和試劑
儀器:Waters e2695高效液相色譜儀(美國Waters),配有Waters 2996 二極管陣列檢測器及Empowerf色譜軟件；0.45 μ m濾膜及其抽濾器。
[0036]試劑:Phe、Tyr、Trp標準品購于Sigma公司；甲醇為色譜級，磷酸氫二鉀；磷酸二氫鉀，氫氧化鉀，磷酸等為優級純；實驗用水為超純水。
[0037]2三種芳香族氨基酸含量測定條件的選擇
2.1檢測波長的選擇:
2.2 分別取濃度為 500 μ g/mL、1000 μ g/mL,250 μ g/mL 的 L_Tyr、L-Phe 及 L-Trp 標準溶液進行210?400nm的紫外波段掃描，因構成蛋白質的20多種氨基酸在遠紫外區(波長小于220nm)均有紫外光吸收，其他氨基酸對芳香族氨基酸的測定會有干擾，而在近紫外區(220?320nm)只有芳香族氨基酸有紫外光吸收，故在近紫外區選擇最佳檢測波長。實驗發現Tyr、Phe及Trp三種物質在近紫外區的最大吸收波長分別為274.5,256.7和279.3nm，如圖1所示。因此選擇256.7nm為檢測波長。
[0038]2.3流動相中緩沖溶液的選擇:
2.4本發明分別比較了乙酸銨和磷酸鹽兩種緩沖溶液對芳香族氨基酸含量測定的影響，通過試驗發現，用乙酸銨緩沖液作流動相，基線波動較大，穩定時間較長，且色譜峰型不好。而選用0.05 mol/L的磷酸鹽緩沖液不但可將目標物完全分離，且三種芳香族氨基酸的峰型很好，如圖2，能滿足芳香族氨基酸分析的要求。
[0039]2.5流動相中甲醇濃度的選擇:
因色氨酸在波長為256.7nm處測定時保留時間較長，有文獻報道用乙睛來縮短，但乙腈的價格昂貴而且毒性大，本發明用甲醇替代。結果表明，適當濃度的甲醇完全能達到乙睛所得到的理想結果。本發明分別比較了比例為5:95、10:90、15:85、20:80的甲醇與磷酸鹽緩沖液，對三種芳香族氨基酸含量測定的影響。結果發現，隨著甲醇比例的增加，氨基酸的保留時間越小，但同時儀器系統的壓力也會相應升高。因此考慮到檢測的效率及防止儀器的壓力過高，本實驗選擇甲醇與0.05 mol/L磷酸二氫鉀及磷酸二氫鉀(1:1)的體積比例為15:85，三種芳香族氨基酸出峰時間快，柱壓適中，同時分離度及峰型也滿足要求。
[0040]2.5流動相中pH的選擇:
本發明發現Trp、Phe、Tyr的等電點分別為5.89,5.48,5.66，在pH大于6時Trp、Phe、Tyr都遠離其等電點，可以避免該三種氨基酸因在等電點處有最小溶解度而容易析出的問題，且此時三者都攜帶負電荷，故選擇pH在6.0?6.3之間分析。通過實驗發現，在磷酸鹽與甲醇的體積比例不變的情況下，改變流動相的PH測定三種芳香族氨基酸，當pH為6.0時，三種芳香族氨基酸保留時間最小，并且各個峰都達到了完全分離。因此，選擇流動相的PH為6.0。通過上述實驗結果，用所確定的色譜條件上機測定三種芳香族氨基酸標樣的混合溶液，三種芳香族氨基酸達到基線分離，峰型對稱。如圖2所示:
2.6蛋白質沉淀劑的選擇:
本發明比較了磺基水楊酸、三氯乙酸、高氯酸和甲醇等提取劑的提取效果，結果表明:用高氯酸作為提取劑時，三種芳香族氨基酸的回收率最高。試驗同時又比較了濃度為1%、2%、5%及10%高氯酸提取效果，結果發現2%的高氯酸溶液回收率最高。可能因為色氨酸上有一個吲哚環(苯并呋喃環)，在高濃度的強酸下呋喃環可能會質子化開環并形成呋喃樹月旨，導致色氨酸含量減少。而高氯酸濃度過低則會影響蛋白質的沉淀效果，因此本文選擇2%的高氯酸溶液作為提取溶劑。
[0041]3三種芳香族氨基酸的定性與定量分析
三種芳香族氨基酸采用峰保留值比較法和標準疊加法進行定性分析，即比對混合標準品和樣品在相同條件下的色譜峰和相對保留時間。實驗結果表明，在樣品中加入標準品前后，三種芳香族氨基酸的出峰位置是一致的，用外標法測定峰面積進行定量分析，計算公式表示為:
X= (CXV) /100m
I為樣品中氨基酸的含量(g/kg)；
C為由工作曲線上查出的樣品中芳香族氨基酸的濃度(μ g/mL)；
V為樣品提取液的體積(mL)；Ill為樣品的質量(g)。
[0042]方法學評價
線性范圍與檢測限
將濃度為500 μ g/mL、1000 μ g/mL、250 μ g/mL的Tyr、Phe及Trp標準混合液，用2%的高氯酸溶液將其依次稀釋2、5、10、20、50倍，按色譜條件檢測，以峰面積I與濃度X做標準曲線。經回歸分析，Tyr、Phe、Trp 分別在 6 ~500 μ g/mL,3 ~1000 μ g/mL 和 30 ~250 μ g/mL范圍內有良好的線性關系，其線性相關系數Oa )在0.9986~0.9995之間。根據信噪比，當色譜峰的峰高為噪音3倍時(s/n=3),確定最低檢測限，由實驗結果:Tyr、Phe、Trp的最低檢測限分別為2 μ g/mL、10 μ g/mL和I μ g/mL,其線性范圍及檢測限都能滿足檢測要求。如表1所示。
[0043]表1回歸方程、線性相關系數和檢測限
【權利要求】
1.一種同時測定三種芳香族氨基酸含量的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: (1)配制流動相，由15%的甲醇和85%磷酸鹽溶液組成，磷酸鹽溶液由0.05 mol/L磷酸二氫鉀及磷酸氫二鉀(1:1)組成，PH范圍為6.0?6.3 ; (2)以規格為4.6X 250mm 1.d, 5 μ m的waters C18色譜柱為固定相，1.d為內徑； (3)用2%的高氯酸溶液配制三種芳香族氨基酸標準混合儲備液； (4)取新鮮水產品肉，用2%的高氯酸勻漿、超聲、離心提取； (5)設置流動相流速為1.0mL/min，進樣量為30微升； (6)將芳香族氨基酸經色譜柱分離后，用二極管陣列檢測器進行分析，選擇Tyr、Phe和Trp的最佳紫外檢測波長進行測定； (7)通過外標法進行定量，以標準品峰面積與濃度做標準曲線，待測樣品進樣后可得到樣品峰面積，通過標準曲線可計算出樣品濃度；并通過對比樣品和標準品中三種芳香族氨基酸的全波段色譜掃描圖譜的相似程度，鑒定色譜峰的純度。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:調節流動相中的磷酸鹽溶液PH為6.0,甲醇和磷酸鹽溶液使用前用0.45 μ m的微孔濾膜過濾,超聲脫氣lOmin。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:用2%的高氯酸溶液配制三種芳香族氨基酸標準混合儲備液，使Phe、Tyr及Trp的濃度分別為1000 μ g/mL、500 μ g/mL、250 μ g/mL,并用2%的高氯酸溶液將氨基酸標準混合儲備液依次稀釋2、5、10、20、50倍。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:取新鮮水產品肉5.0g于離心管中，加入1mL預冷5%的高氯酸勻漿2min，用玻璃棒攪拌均勻，超聲提取5min后，在冷凍離心機4°C下1000rpm離心20min，取上清液過濾，過濾后所剩的沉淀物加入預冷的2% PCA溶液再進行浸提、離心，重復2次后合并上清液；用KOH溶液中和上清液至pH為6.0 ;中和時先加5mol/L的KOH溶液調節，待接近至所需ρΗ=6.0時，改用lmol/L的KOH溶液調節。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:芳香族氨基酸經WatersAtlantis T3C18分離后，進入二極管陣列檢測器檢測，Tyr, Phe及Trp三種物質的檢測波長設定分別為274.5,256.7 和 279.3nm。
【文檔編號】G01N30/06GK104198643SQ201410481491
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年9月21日 優先權日:2014年9月21日
【發明者】謝晶, 邱偉強, 王金鋒, 楊勝平, 葉藻 申請人:上海海洋大學
專業數控銑床產品供應商
20年生產經驗，實力工廠，精工品質，質量有保障
