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一種定量測定植物中生長素與脫落酸含量的方法
【專利摘要】本發明提供一種定量測定植物中生長素和脫落酸含量的方法，步驟如下：將樣品研磨后用甲醇進行浸提，加入內標D5-IAA和D6-ABA，用凈化-定量-濃縮多聯機系統的EVA功能濃縮溶液，用乙酸乙酯等體積萃取激素，用氮氣吹干，再用HAc溶解，用凈化-定量-濃縮多聯機系統中的SPE功能過固相萃取柱純化，收集洗脫樣品；將洗脫樣品干燥后，用甲醇溶解得到待測樣品，將待測樣品采用液質聯用方法測定生長素和脫落酸的含量。本發明建立了一個省時、高效的分析方法，分離效果理想。大大減少了分析樣品的用量，有利于操作步驟的簡化，雜質少。本發明實現前處理的自動化，縮短了操作時間，減少系統誤差，使前處理過程更加精準。
【專利說明】一種定量測定植物中生長素與脫落酸含量的方法

【技術領域】
[0001]本發明涉及一種定量測定植物中生長素與脫落酸含量的方法。

【背景技術】
[0002]植物體內具有多種內源激素，其含量及存在形式不斷變化，并產生一系列生理生化反應，在一定程度上影響和控制植物的生長、發育、成熟和衰老等過程。生長素參與根和莖的發育和生長、器官的衰老、維管束組織的形成和分化發育，以及植物的向地和向光反應等。ABA能促進果實與葉片脫落、器官衰老和氣孔關閉、影響植物開花、調節種子和胚的發育等生理功能。果實中激素的種類及含量的多少直接影響果實的發育，因此建立合理實用的激素含量分析方法，對研究植物的生長發育有重要意義。
[0003]植物組織中生長素(吲哚-3-乙酸，IAA)和脫落酸(ABA)含量甚微，測定困難，目前植物內源激素的分析方法主要有酶聯免疫法(ELISA)、放射免疫法(RIA)、高效液相色譜法(HPLC)、氣質聯用(GC-MS)和液質聯用(LC-MS)等。液相色譜選擇性和特異性差，氣質聯用衍生過程繁瑣。液質聯用不需目標物衍生處理，操作簡便，而且靈敏度高、選擇性和特異性好，然而目前所報道的液質方法，前處理凈化只采用傳統的固相萃取凈化，操作繁瑣、耗時費力，無法實現標準化、自動化，人為誤差較大，無法保證定量結果的準確性和可靠性。


【發明內容】

[0004]為了解決現有技術中存在的問題，本發明提供了一種定量測定植物中生長素與脫落酸含量的方法。本發明在多種分析方法的基礎上，通過改進液質聯用分析方法中的前處理方法，采用在線SPE/凝膠凈化/定量濃縮多聯機系統的固相萃取(SPE)和定量濃縮(EVA)功能，該儀器可以自動完成SPE凈化過程，且EVA由真空、加熱、氮吹三位一體構成，三道紅外傳感器可精確定容，具有多種溶劑轉換、蒸發至干、自動稀釋、定量轉移等功能，該系統常見于果蔬中農藥的殘留、土壤及動物血液中有毒物質及食品中塑化劑的前處理過程，在植物激素測定的方法中未見報道。對待測樣品中IAA和ABA進行液相色譜串聯質譜(high-performance liquid chromatography-tandem massspectrometric, LC-MS/MS)石開究，采用添加同位素(D5-1AA, D6-ABA)到樣品中作為定量測定的手段，保證了定性、定量結果的可靠性，為植物體內源激素的研究提供了關鍵技術方法。
[0005]為了實現上述發明目的，本發明采用的技術方案如下:
本發明提供了一種定量測定植物中生長素和脫落酸含量的方法，步驟如下:將樣品研磨后用甲醇進行浸提，加入內標D5-1AA和D6-ABA，用凈化-定量-濃縮多聯機系統的EVA功能濃縮溶液，用乙酸乙酯等體積萃取激素，用氮氣吹干，再用HAc溶解，用凈化-定量-濃縮多聯機系統中的SPE功能過固相萃取柱純化，收集洗脫樣品；將洗脫樣品干燥后，用甲醇溶解得到待測樣品，將待測樣品采用液質聯用方法測定并計算生長素和脫落酸的含量。
[0006]優選地,所述樣品的質量為0.5g-2.0g。
[0007]進一步地,所述樣品的質量為0.5g。
[0008]優選地，所述甲醇的體積百分比濃度為70-90%。
[0009]進一步地，所述甲醇的體積百分比濃度為80%。
[0010]優選地，所述濃縮溶液時的濃縮溫度為35_45°C。
[0011]進一步地，所述濃縮溶液時的濃縮溫度為35°C。
[0012]優選地，所述固相萃取柱為C18柱。
[0013]本發明建立了凈化-定量-濃縮多聯機系統一液相色譜一質譜聯用儀(GPC-HPLC-MS/MS)，內標法定量測定植物組織中吲哚_3_乙酸(IAA)和脫落酸(ABA)的方法。實驗以板栗為材料，通過正交試驗篩選出最適的提取與純化方法，結果表明:經檢測，取材料0.5g,80%甲醇(預冷)4°C冰箱中浸提過夜，并加入500ngD6-ABA，100ngD5_IAA35°C濃縮至水相，用乙酸乙酯等體積萃取激素，氮吹至干，用HAc溶解，經C18小柱純化，ABA與IAA的含量相對較高。
[0014]本發明通過優化板栗IAA、ABA兩種內源激素的提取純化條件，建立了一個省時、高效的LC-MS/MS分析方法，分離效果理想。僅0.50g的樣品用量，大大減少了分析樣品的用量，并有利于操作步驟的簡化，雜質少。實驗中采用GPC純化系統完成多個步驟，實現前處理的自動化，縮短了操作時間，減少系統誤差，使前處理過程更加精準。內源激素與所用內標的結構式非常相近，因而在提取、純化過程中內源激素與內標均同步進行，兩者同時進入色譜柱，幾乎有相同的保留時間。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]附圖用來提供對本發明的進一步理解，并且構成說明書的一部分，與本發明的實施例一起用于解釋本發明，并不構成對本發明的限制。在附圖中:
圖1為板栗果實樣品及激素標準樣的色譜圖；其中，Al為IAA和ABA標樣及內標的總峰圖；A2為D5-1AA的子離子峰圖；A3為IAA的子離子峰圖；A4為D6-ABA的子離子峰圖；A5為ABA的子離子峰圖。BI為樣品中IAA和ABA的總峰圖；B2為樣品中D5-1AA的子離子峰圖；B3為樣品中IAA的子離子峰圖；B4為樣品中D6-ABA的子離子峰圖；B5為樣品中ABA的子離子峰圖。此處將“B3為樣品中d5-1AA的子離子峰圖；”修改為“B3為樣品中IAA的子離子峰圖；”
圖2為使用不同重量的樣品應用本發明的方法檢測到的IAA和ABA含量。

【具體實施方式】
[0016]以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。
[0017]材料與方法 1.1材料
試材選自懷柔板栗試驗站種質的燕紅板栗(Castanea mollissima)果實,放入液氮中冷凍，然后置于-80 V冰箱保存，用于激素測定。
[0018]1.2 儀器
高效液相色譜一質譜聯用儀(Agilentl200型液相色譜儀一Agilent 6410型串聯四極桿質譜);GPC (凈化-定量-濃縮多聯機系統)；離心機(SIGMA，3K15)。
[0019]1.3 試劑
IAA 內標(Toronto Research Chemicals Inc, D5-1AA) ；ABA 內標(Toronto ResearchChemicals Inc, D6-ABA) ；C18 柱(Cleanert S C18-SPE,500mg/3mL);陰離子交換柱(Cleanert SAX-SPE, 500mg/3mL);纖維素柱(Agilent Bond Elut-Cellulose, 500mg/3mL)；二乙基二硫代氨基甲酸鈉(抗氧化劑);交聯聚乙烯吡咯烷酮(PVPP);甲醇(色譜純);超純水為實驗室提供；其他有機試劑均為分析純，來自北京化工廠。
[0020]1.4樣品的制備
準確稱取1.1中保存的板栗果實樣品，研磨，加入抗氧化劑聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和掩蔽劑二乙基二硫代氨基甲酸鈉(BHJ)各0.1?0.15g，加入體積百分比濃度為80%甲醇(預冷)，約20倍體積，4°C靜置過夜；取出樣品，8000rpm，4°C離心15min，取上清；用1ml體積百分比濃度為80%甲醇(預冷)洗沉淀3次，混合上清；加入10ngD5-1AA和500ngD6_ABA，加入兩滴氨水，搖勻；用凈化-定量-濃縮多聯機系統的EVA功能，在一定溫度下將溶液濃縮至5ml ;濃縮后的液體，3500rpm,4°C離心25min ;用2mol/L HCl調pH至2.5 ;加入少量PVPP，用等體積的乙酸乙酯萃取3次，收集乙酸乙酯相；加入兩滴氨水，混勻^EVA中將乙酸乙酯用N2吹干；用0.lmol/LHAc定容至3mL ;用凈化-定量-濃縮多聯機系統中的SPE功能過固相萃取柱，收集洗脫樣品；加兩滴氨水，真空冷凍干燥至干；用ImL甲醇溶解，得到待測樣品。將待測樣品采用液質聯用方法測定并計算IAA和ABA的含量。
[0021]采用正交試驗設計對前處理過程進行優化，將樣品量設為2g、lg、0.5g ;甲醇抽提體積百分比濃度設為90%、80%、70% ;GPC濃縮溫度設為45°C、40°C、35°C;固相萃取柱為C18、陰離子交換色譜、纖維素柱。
[0022]1.5色譜條件
色譜柱:ZORBAXSB-Aq 柱:5 μ m,4.6 mmX 150 mm ;流速:0.3mL/min ;柱溫:30°C ;進樣量:5 μ L ;流動相Α，含體積百分比0.1%的乙酸水溶液；流動相B，甲醇。
[0023]1.6質譜條件
ESI離子源，正負離子檢測方式，MRM模式。離子源條件為干燥氣溫度350°C，干燥氣流量12L/min，霧化器壓力35psi，毛細管電壓，4000V，最優碎裂電壓(frag)均為155V，最優碰撞能量(CE)為30V。
[0024]1.7凈化-定量_濃縮多聯機系統條件 1.7.1濃縮條件
水加熱溫度(Temperature water heating):35 °C ;濃縮槍底部溫度(Temperaturebottom cone):35°C ;吸液速度(Suct1n speed):20ml/min ;定容溶液(Constant volumesolut1n):超純水。
[0025]1.7.2固相萃取條件
吸液速度(Suct1n speed):20ml/min ;加樣速度(Dispending speed):20ml/min ;甲醇和0.lmol/L醋酸對SPE柱進行活化、洗柱和洗脫。
[0026]2.結果與分析
2.1標樣與樣品的全譜圖(參見圖1)。
[0027]如圖1所示，在以上色譜條件下，IAA和ABA能與其他成分得到很好地分離。從圖中可以看出，標樣從六、05-^^48六和06-六8六保留時間分別為:9.089min,9.123min,9.514min,9.539min。樣品中IAA、D5-1AA, ABA和D6-ABA的保留時間與標樣一致。IAA和ABA的特征離子，如表I所示。
[0028]表I ABA、IAA及相應內標產物的選擇特征離子激素種類 ^ΙΠ/Ζ.......................................................................................1AA.....................................................................................^..........................................................................................176........................................................................................;D5-1AA.1Sl
ABA263
ID6-ABA269丨
2.2板栗果實中IAA與ABA的含量
從圖1中得到內源激素與內標物的峰面積，按照以下公式計算內源激素ABA、IAA的濃度，結果如表2所不。

IflllX加入內■ X氘代率
__麵』變歷.......￥,γ5-

徉品重:1

ΣΑ176
—--，D5-1AA的加入量為

IAiSi
10ng,氣代率為98% ；
一 1C-1 A263
ABA內源峰面積/內標峰面積=\ ___，D6-ABA的加入量為500ng,氘代率

Ζ.*ΣΑ2_
為 100%O
[0030]通過以上公式計算得到IAA和ABA的含量,如表2所示。
[0031]通常測定激素需要大量的樣品，有時候很難滿足，在提取液用量一定的情況下，適當減少樣品的用量，使得提取液提取的更加充分，得到更好的效果。本 申請人:將樣品量設為三個梯度，分為0.5、1和2g。本 申請人:發現甲醇的提取率高、雜質較少，采用甲醇為提取溶齊U，設置三個濃度梯度70%、80%和90%。在體外的條件下，植物激素很容易降解或轉化為其它形式，控制溫度很重要，在甲醇濃縮過程中要既要將甲醇去除又要保持激素不被破壞，因此在濃縮的過程中采用了 35°C、40°C和45°C三個溫度。在純化過程中，為了達到更好的分離效果，選取了三種類型的純化小柱，分別為C18、陰離子交換柱和纖維素柱。綜合以上的結果，發現:取0.5g樣品在80%甲醇中浸泡抽提，35°C下濃縮，經C18柱純化達到的效果最好，如表2所示，使用組8提取純化方法，IAA和ABA的含量都較高，這個方法適合用于這兩種激素的提取。
[0032]表2不同處理條件板栗果實中IAA、ABA含量

【權利要求】
1.一種定量測定植物中生長素和脫落酸含量的方法，其特征在于:步驟如下:將樣品研磨后用甲醇進行浸提，加入內標D5-1AA和D6-ABA,用凈化-定量-濃縮多聯機系統的EVA功能濃縮溶液，用乙酸乙酯等體積萃取激素，用氮氣吹干，再用HAc溶解，用凈化-定量-濃縮多聯機系統中的SPE功能過固相萃取柱純化，收集洗脫樣品；將洗脫樣品干燥后，用甲醇溶解得到待測樣品，將待測樣品采用液質聯用方法測定并計算生長素和脫落酸的含量。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:所述樣品的質量為0.5g-2.0g。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于:所述樣品的質量為0.5g。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:所述甲醇的體積百分比濃度為70-90%。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于:所述甲醇的體積百分比濃度為80%。
6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:所述濃縮溶液時的濃縮溫度為35-45°C。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于:所述濃縮溶液時的濃縮溫度為35°C。
8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:所述固相萃取柱為C18柱。
【文檔編號】G01N30/06GK104165947SQ201410413383
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年8月21日 優先權日:2014年8月21日
【發明者】楊柳, 秦嶺, 王建立, 劉帥, 曹慶琴, 邢宇, 張卿 申請人:北京農學院