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一種表面等離子體共振生物芯片及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物芯片領(lǐng)域，具體涉及一種表面等離子體共振生物芯片及其制備方法與應(yīng)用。所述的表面等離子體共振生物芯片是通過在固相載體固定鹽酸克倫特羅-牛血清白蛋白耦聯(lián)物作為生物探針，利用金膜產(chǎn)生表面等離子體共振響應(yīng)，利用自組裝單分子層技術(shù)在金膜表面修飾巰基，芯片活化后在生物芯片上固定探針得到的；該生物芯片的應(yīng)用包括通過利用表面等離子體共振生物芯片直接法檢測克倫特羅抗體的應(yīng)用和利用表面等離子體共振生物芯片通過競爭抑制法檢測克倫特羅的應(yīng)用。該生物芯片具有快速、實時、能現(xiàn)場檢測的特點，可迅速給出定量結(jié)果、靈敏度高而成本低，不污染環(huán)境。
【專利說明】一種表面等離子體共振生物芯片及其制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物芯片領(lǐng)域，具體涉及一種表面等離子體共振生物芯片及其制備方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]二十世紀(jì)九十年代,人類基因組計劃(Human Genome Project, HGP)和分子生物學(xué)相關(guān)學(xué)科的發(fā)展為生物芯片、基因芯片技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展提供了有利條件。生物芯片(biochip)是根據(jù)生物分子間特異相互作用的原理，將生化分析過程固著于芯片表面，從而實現(xiàn)對DNA、RNA、多肽、蛋白質(zhì)以及其他生物成分的高通量快速檢測。蛋白質(zhì)芯片(proteinchip)是將蛋白質(zhì)或抗原等一些非核酸生命物質(zhì)固定在微型載體上獲得，芯片上的探針構(gòu)成為蛋白質(zhì)或芯片作用對象為蛋白質(zhì)者統(tǒng)稱為蛋白質(zhì)芯片。本發(fā)明的生物芯片探針是克倫特羅衍生物，是一種蛋白質(zhì)生物芯片。
[0003]盡管生物芯片技術(shù)已經(jīng)取得了長足的發(fā)展，得到世人的矚目，但仍然存在著許多問題，例如技術(shù)成本昂貴、操作復(fù)雜、重復(fù)性差、分析范圍較狹窄、通常需要放射性元素標(biāo)記或者熒光標(biāo)記等。這些問題主要表現(xiàn)在樣品的制備、探針合成與固定、分子的標(biāo)記、數(shù)據(jù)的讀取與分析等方面。熒光法是目前使用最多的標(biāo)記方法，靈敏度不高，需要避光，用于檢測結(jié)果的激光掃描儀價格昂貴。同位素標(biāo)記法需要同位素和放射自顯影，使用不便，操作復(fù)雜，耗時，有嚴(yán)重的污染。本發(fā)明不 需要標(biāo)記，可解決熒光標(biāo)記和放射性元素標(biāo)記對環(huán)境有污染的問題，同時樣品處理簡單，檢測時間短，操作簡便。
[0004]鹽酸克倫特羅(Clenbuterolhydrochloride, CLB)是一種 3 2-受體激動劑(^2-agonists),因與腎上腺素具有相同的藥理作用，也被稱為P2-腎上腺素受體激動劑(^ 2-addrenoeeptor agonists),主要在臨床上用于治療支氣管哮喘、疫攣，阻塞性肺炎等疾病。20世紀(jì)80年代初，美國一家公司開始將鹽酸克倫特羅添加到飼料中，它具有營養(yǎng)再分配的作用，大大提高了動物的瘦肉轉(zhuǎn)化率，從此P2-受體激動劑被稱為“瘦肉精”。長期食用含有鹽酸克倫特羅的食品的人會發(fā)生頭痛、胸悶、惡心等不良反應(yīng)，1983年西班牙首次發(fā)生克倫特羅食物中毒事件，1998年香港出現(xiàn)克倫特羅食物中毒事件，世界上因克倫特羅引起的食物中毒已超過1000起。克倫特羅及其鹽、酯在中國和很多地區(qū)為禁止使用的獸藥，并規(guī)定在動物性食品中不得檢出，但仍有一些飼養(yǎng)者或者飼料廠非法使用克倫特羅，克倫特羅的藥物殘留檢測已成為研究熱點。目前檢測鹽酸克倫特羅的主要方法是高效液相色譜(High performance liquid chromatography, HPLC)等色譜分析法、酶聯(lián)免疫分析法(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)等免疫學(xué)方法以及電化學(xué)方法,對克倫特羅的檢測限通常是2.0y g/L。上述方法設(shè)備昂貴，檢測周期長，對操作人員要求高，難以滿足快速、現(xiàn)場檢測的需求。
[0005]表面等離子體共振(surface plasmon resonance, SPR)是一種基于麥克斯韋電磁波理論的物理光學(xué)現(xiàn)象，它產(chǎn)生于具有復(fù)介電常數(shù)這一特性的金屬表面。表面等離子體共振技術(shù)(SPR)利用P偏振光在玻璃與金屬薄膜界面處發(fā)生全內(nèi)反射時進入金屬薄膜內(nèi)的隱失波(倏逝波)，引發(fā)金屬中的自由電子產(chǎn)生表面等離子體，當(dāng)隱失波的波矢與表面等離子體的波矢相匹配時，二者將發(fā)生共振，入射光的能量被表面等離子體吸收，反射光強急劇下降，發(fā)生SPR現(xiàn)象，這時對應(yīng)的入射角度稱為諧振角或者共振角。如果將探針或配體固定于傳感器芯片表面，含待分析物的樣品流經(jīng)傳感器表面，若流過生物芯片表面的樣品中含有與之結(jié)合的物質(zhì)，它們之間發(fā)生的相互作用將導(dǎo)致芯片表面的介質(zhì)折射率發(fā)生改變，弓丨起SPR共振角發(fā)生改變。通過檢測SPR信號改變檢測分子間的相互作用的特異性、濃度、動力學(xué)、親合性、協(xié)同作用、相互作用模式等。在生物分子相互作用分析過程中，靶物質(zhì)可以天然存在于分析物中，在自然條件下進行分析，保證了所得結(jié)果的真實性。因此，SPR生物傳感器具有實時、免標(biāo)記、操作簡單、可定量檢測生物分子、檢測兩種或多種分子間結(jié)合的優(yōu)點。目前，SPR技術(shù)已廣泛應(yīng)用于食品檢測、藥物篩選、疾病診斷等領(lǐng)域。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，提供一種表面等離子體共振生物芯片，該生物芯片以鹽酸克倫特羅-牛血清白蛋白耦聯(lián)物(CLB-BSA)作為探針。
[0007]本發(fā)明的另一目的在于提供上述表面等離子體共振生物芯片的制備方法。
[0008]本發(fā)明的再一目的在于提供上述表面等離子體共振生物芯片的應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn):
[0010]一種表面等離子體共振生物芯片的制備方法，包含如下步驟:
[0011](I)在玻璃基底上 沉積厚度為45~55nm的金膜作為表面等離子體共振生物芯片的固相載體；
[0012](2)在培養(yǎng)皿中注入含有HS (CH2)ltlCOOH酸)和HS (CH2)60H (巰基己酸)的乙醇溶液，對金膜表面進行化學(xué)修飾；然后通入PBS緩沖液清洗，洗掉未結(jié)合物質(zhì)；氮氣吹干；
[0013](3)將上述固相載體固定在SPR檢測儀上；
[0014](4)流通池中通入PBS緩沖液清洗，待基線穩(wěn)定后加入N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和N-乙基-N’ - (二甲氨基丙基)碳二亞胺(EDC)的混合液活化芯片；然后通入PBS緩沖液清洗；
[0015](5)在生物芯片表面固定鹽酸克倫特羅-牛血清白蛋白耦聯(lián)物(CLB-BSA);記錄表面等離子體共振角的變化，監(jiān)測生物探針固定的過程，SPR響應(yīng)值有大幅升高，則探針固定效果較好，當(dāng)共振角不再升高時，探針固定過程結(jié)束；然后注入PBS緩沖液清洗；
[0016](6)加入乙醇胺(Eth)溶液封閉滅活剩余的酯鍵；然后注入PBS緩沖液清洗；得到表面等離子體共振生物芯片。
[0017]步驟(1)中所述的玻璃基底優(yōu)選直徑為20mm、厚度為1mm的圓形玻璃片；所述的金膜的厚度優(yōu)選為50nm ；
[0018]步驟(2)中所述的HS(CH2)iciCOOH的終濃度為0.5~10mM，優(yōu)選為ImM ；
[0019]所述的HS (CH2) 60H的終濃度為4.0~IOOmM,優(yōu)選為9mM ；
[0020]步驟(2)中所述的化學(xué)修飾的條件為37°C溫浴，避光反應(yīng)0.5~6h，優(yōu)選為2h ；
[0021]步驟(2)所述的氮氣吹干的溫度為40~60°C，優(yōu)選為50°C ；
[0022]步驟(4)中所述的N-羥基琥珀酰亞胺的終濃度為0.05mol/L;所述的N-乙基-N’ - (二甲氨基丙基)碳二亞胺的終濃度為0.05mol/L ；
[0023]步驟(4)中所述的活化芯片的時間為10?60min，優(yōu)選為15min ；
[0024]步驟(5)中所述的鹽酸克倫特羅-牛血清白蛋白耦聯(lián)物(CLB-BSA)的濃度為83mg/L ;所述的固定的時間為10?90min,優(yōu)選為30min ；
[0025]步驟(6)中所述的乙醇胺溶液的濃度為lmol/L，pH值為8.5 ;所述的封閉滅活的時間為3?IOmin,優(yōu)選為6min ；
[0026]步驟(2)、(4)、(5)和(6)中所述的PBS緩沖液清洗的次數(shù)優(yōu)選為3次，每次清洗的時間優(yōu)選為3min ；
[0027]所述的PBS緩沖液的組成如下:終濃度為2mmol/L的NaH2PO4,終濃度為2mmol/L的Na2HPO4、終濃度為150mmol/L的NaCl和水，pH值為7.4 ；
[0028]一種表面等離子體共振生物芯片，通過上述制備方法得到；
[0029]所述的表面等離子體共振生物芯片的應(yīng)用，包括利用表面等離子體共振生物芯片通過直接法檢測鹽酸克倫特羅抗體的應(yīng)用和利用表面等離子體共振生物芯片通過競爭抑制法檢測鹽酸克倫特羅的應(yīng)用；
[0030]所述的利用表面等離子體共振生物芯片通過直接法檢測鹽酸克倫特羅抗體，包含如下步驟:
[0031](一)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線:
[0032]已知濃度的鹽酸克倫特羅抗體用PBS緩沖液配制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以PBS緩沖液為基準(zhǔn)，各個標(biāo)準(zhǔn)溶液分別注入表面等離子共振儀的微流通池，與表面等離子體共振生物芯片上的探針發(fā)生免疫反應(yīng)，對生物芯片反應(yīng)區(qū)進行表面等離子體共振掃描，記錄SPR共振角的變化，獲得各個標(biāo)準(zhǔn)溶液的表面等離子共振動力學(xué)曲線，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度作為橫坐標(biāo)，共振角作為縱坐標(biāo)，繪制工作曲線，并進行多項式曲線擬合，獲得回歸標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0033](二)未知樣品的檢測:
[0034]將未知樣品注入微流通池與表面等離子體共振生物芯片上的探針發(fā)生免疫反應(yīng)，對表面等離子體共振生物芯片反應(yīng)區(qū)進行表面等離子體共振掃描，記錄SPR共振角的變化，獲得未知樣品的表面等離子體共振動力學(xué)曲線，結(jié)合步驟(一)得到的回歸標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出未知樣品中鹽酸克倫特羅抗體的濃度；
[0035](H)下一樣品檢測:
[0036]步驟(二)中的免疫反應(yīng)結(jié)束后，微流通池先通入PBS緩沖液清洗I?5次，每次清洗的時間是I?5min ;再通入SDS-HCl溶液清洗I?3次，每次清洗時間是I?3min，使抗原-抗體結(jié)合物解離；然后通入PBS緩沖液I?5次，每次清洗的時間是I?3min ；SPR響應(yīng)值降回基線，繼續(xù)檢測下一個樣品。
[0037]步驟(一)中所述的鹽酸克倫特羅抗體標(biāo)準(zhǔn)溶液的優(yōu)選濃度范圍為0.5mg/L?100mg/L ；
[0038]步驟(一)所述的標(biāo)準(zhǔn)溶液的檢測量優(yōu)選為100 u L ;所述的免疫反應(yīng)的反應(yīng)時間為3?5min，優(yōu)選反應(yīng)時間為3min ;所述的表面等離子體共振掃描范圍為0.5?4°，優(yōu)選為I ?2° ;
[0039]步驟(二)中所述的未知樣品的檢測量優(yōu)選為100 U L ;所述的免疫反應(yīng)的反應(yīng)時間為3?5min，優(yōu)選反應(yīng)時間為3min ;所述的表面等離子體共振掃描范圍為0.5?4°，優(yōu)選為I?2。；
[0040]步驟(三)中所述的SDS-HCl溶液中SDS的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%，HCl的濃度為0.0lmol/L ；
[0041]步驟(三)中所述的PBS緩沖液清洗次數(shù)優(yōu)選為3次，每次清洗的時間優(yōu)選為3min ；所述的SDS-HCl溶液清洗次數(shù)優(yōu)選為3次，每次清洗的時間優(yōu)選為3min ；
[0042]所述的PBS緩沖液的組成如下:終濃度為2mmol/L的NaH2PO4,終濃度為2mmol/L的Na2HPO4、終濃度為150mmol/L的NaCl和水，pH值為7.4 ；
[0043]在生物芯片表面固定鹽酸克倫特羅-牛血清白蛋白耦聯(lián)物(CLB-BSA)，直接檢測鹽酸克倫特羅抗體，可進行抗體篩選和研究免疫反應(yīng)動力學(xué)。同一個芯片至少可連續(xù)檢測50個樣品，一個樣品檢測完，通入PBS緩沖液，然后通入SDS-HCl溶液，使抗原-抗體結(jié)合物解離，再通入PBS緩沖液，SPR響應(yīng)值降回基線，可繼續(xù)檢測下一個樣品。
[0044]所述的利用表面等離子體共振生物芯片通過競爭法檢測鹽酸克倫特羅，包含如下步驟:
[0045](I)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線:
[0046]鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品用PBS緩沖液配制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，不同濃度的鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液分別與定量鹽酸克倫特羅抗體溶液混合，靜置，得到各個標(biāo)準(zhǔn)溶液與定量鹽酸克倫特羅抗體的混合溶液；以PBS緩沖液為基準(zhǔn)，各個標(biāo)準(zhǔn)溶液與定量鹽酸克倫特羅抗體的混合溶液分別注入表面等離子共振儀的微流通池，與表面等離子體共振生物芯片上的探針發(fā)生免疫反應(yīng)，對表面等離子體共振生物芯片反應(yīng)區(qū)進行表面等離子體共振掃描，記錄SPR共振角的變化，獲得各個標(biāo)準(zhǔn)溶液的表面等離子共振動力學(xué)曲線，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度作為橫坐標(biāo)，共振角作為縱坐標(biāo)，繪制工作曲線，并進行多項式曲線擬合，獲得回歸標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0047]( II )未知樣品的檢測:
[0048]將未知樣品提取液和定量鹽酸克倫特羅抗體的混合溶液注入微流通池進行免疫反應(yīng)，對表面等離子體共振生物芯片反應(yīng)區(qū)進行表面等離子體共振掃描，記錄SPR共振角的變化，獲得待測樣品的表面等離子體共振動力學(xué)曲線，結(jié)合步驟(I )得到的回歸標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出未知樣品中鹽酸克倫特羅小分子的濃度；
[0049](III)下一樣品的檢測:
[0050]步驟(II )中的免疫反應(yīng)結(jié)束后，微流通池先通入PBS緩沖液清洗I?5次，每次清洗的時間是I?5min ;再通入SDS-HCl溶液清洗I?3次，每次清洗時間是I?3min ；，使抗原-抗體結(jié)合物解離；然后通入PBS緩沖液I?5次，每次清洗的時間是I?3min ；SPR響應(yīng)值降回基線，繼續(xù)檢測下一個樣品。
[0051]步驟(I )中所述定量鹽酸克倫特羅抗體在混合溶液中終濃度為20mg/L ；
[0052]步驟(I )中所述的鹽酸克倫特羅小分子分子量為313.7 ；
[0053]步驟(I )中所述的標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度范圍為0.5?100 μ g/L ；
[0054]步驟(I )中所述的靜置時間為I?15min，優(yōu)選時間為5min ；
[0055]步驟(I )中所述的鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品與鹽酸克倫特羅抗體的混合溶液的檢測量優(yōu)選為100 μ L ;所述的免疫反應(yīng)的反應(yīng)時間為3?5min ;優(yōu)選反應(yīng)時間為3min ;所述的表面等離子體共振掃描范圍為0.5?4°，優(yōu)選為I?2° ；[0056]步驟(II)中所述未知樣品提取液，包含如下具體步驟:
[0057]①稱2g豬肉或豬肝；
[0058]②加入0.1M 的 HC16mL,振蕩 IOmin,室溫下 4000r/min 離心 IOmin ；
[0059]③取上清液，加入0.1M的Na0H2mL,加入6mL乙酸乙酯，振蕩IOmin,室溫下4000r/min 離心 IOmin ；
[0060]④取步驟③得到的上清液于50°C氮氣吹干；
[0061]⑤加入ImL三蒸水復(fù)溶，得到未知樣品提取液；
[0062]步驟(II)中所述定量鹽酸克倫特羅抗體在混合溶液中終濃度為20mg/L ;未知樣品提取液與定量鹽酸克倫特羅抗體的混合溶液檢測量為IOOii L ;所述的免疫反應(yīng)的反應(yīng)時間為3?5min，優(yōu)選反應(yīng)時間為3min ;所述的表面等離子體共振掃描范圍為0.5?4°，優(yōu)選為I?2° ；
[0063]步驟(III)中所述的SDS-HCl溶液中SDS的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%，HCl的濃度為0.0lmol/L ；
[0064]步驟(III)中所述的PBS緩沖液清洗次數(shù)優(yōu)選為3次，每次清洗的時間優(yōu)選為3min ；
[0065]所述的PBS緩沖液的組成如下:終濃度為2mmol/L的NaH2PO4,終濃度為2mmol/L的Na2HPO4、終濃度為150mmol/L的NaCl和水，pH值為7.4 ；
[0066]本發(fā)明的原理:在固相載體(鍍金膜的玻璃片)固定鹽酸克倫特羅-牛血清白蛋白耦聯(lián)物(CLB-BSA)作為生物探針，利用金膜產(chǎn)生表面等離子體共振(SPR)響應(yīng)，利用自組裝單分子層技術(shù)在金膜表面修飾巰基，經(jīng)活化后芯片可以固定探針，樣品注入微流通池，與探針發(fā)生免疫反應(yīng)，由P偏振光檢測生物芯片探針與樣品的反應(yīng)(圖1、圖2)。當(dāng)檢測樣品中有與探針匹配的物質(zhì)時，共振角發(fā)生變化，SPR檢測儀記錄檢測結(jié)果，獲得檢測樣品的表面等離子體共振動力學(xué)曲線，結(jié)合回歸標(biāo)準(zhǔn)曲線，分析實驗結(jié)果。鹽酸克倫特羅的分子量較小(313.7)，不適于直接檢測。如果生物芯片表面固定鹽酸克倫特羅抗體作為探針，鹽酸克倫特羅能與抗體結(jié)合，但對芯片表面附近的折射率影響小，SPR共振峰的變化小，直接檢測效果不好。為了檢測鹽酸克倫特羅痕量小分子物質(zhì)，本發(fā)明提出抑制免疫型生物芯片法。芯片表面固定CLB-BSA作為探針，CLB小分子與定量的鹽酸克倫特羅抗體混合后注入流通池，CLB小分子和芯片表面的CLB-BSA都可以與鹽酸克倫特羅抗體結(jié)合，是競爭的關(guān)系，CLB小分子抑制了鹽酸克倫特羅抗體與芯片表面的探針CLB-BSA結(jié)合，樣品中CLB的濃度與響應(yīng)值的變化成反比。如果樣品中CLB濃度小，則更多的鹽酸克倫特羅抗體與芯片表面探針結(jié)合，SPR響應(yīng)值即共振角的變化更大。
[0067]本發(fā)明的優(yōu)點與效果如下:
[0068](I)本發(fā)明不需要對樣品標(biāo)記，對環(huán)境無污染。
[0069](2)本發(fā)明只需單一抗體，樣品處理簡單且用量少，簡化了操作步驟，縮
[0070]短了檢測時間。
[0071](3)本發(fā)明采用CLB-BSA作為探針，應(yīng)用SPR技術(shù)進行信號檢測，不需要昂貴的檢測儀器，降低了芯片的使用成本及實驗條件。
[0072](4)本發(fā)明可以用便攜式SPR檢測儀實現(xiàn)樣品的現(xiàn)場快速檢測，可以廣泛應(yīng)用于普通實驗室，有望在超市、市場、工廠等需要食品質(zhì)量實時監(jiān)控的場所，實現(xiàn)大量樣品的現(xiàn)場快速檢測。
[0073]本發(fā)明可實現(xiàn)生物芯片技術(shù)的快速、實時、能現(xiàn)場檢測的特點，可迅速給出定量結(jié)果、靈敏度高而成本低，不污染環(huán)境。直接檢測法檢測鹽酸克倫特羅抗體可研究抗原-抗體親和力及動力學(xué)反應(yīng)過程，適用于基礎(chǔ)研究和抗體的篩選等。競爭抑制檢測法可檢測豬肝中提取的克倫特羅小分子，靈敏度高，與目前常用的HPLC和ELISA方法檢出限相同，可用于食品檢測、藥物篩選、疾病診斷等領(lǐng)域，將會產(chǎn)生較好的經(jīng)濟效益和社會效益。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0074]圖1是本發(fā)明生物芯片檢測系統(tǒng)結(jié)構(gòu)模式圖。
[0075]圖2是本發(fā)明芯片系統(tǒng)模式圖。[0076]圖3 是實施例 2 制備的標(biāo)準(zhǔn)溶液(5mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L、30mg/L和 50mg/L)發(fā)生免疫反應(yīng)的表面等離子共振動力學(xué)曲線圖。
[0077]圖4是實施例3制備的標(biāo)準(zhǔn)溶液發(fā)生免疫反應(yīng)的表面等離子共振動力學(xué)曲線圖。
[0078]圖5是實施例3建立的回歸標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
【具體實施方式】
[0079]下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
[0080]鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品(100g/mL的乙醇溶液)由農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所提供，分子量為313.7 ;克倫特羅-牛血清白蛋白(CLB-BSA)耦聯(lián)物、克倫特羅抗體購于廣州弗賽生物科技有限公司；N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、N-乙基-N’ - (二甲氨基丙基)碳二亞胺(EDC)、乙醇胺(Eth)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、HS (CH2)ltlCOOH (巰基十一酸)和 HS (CH2)6OH (巰基己酸)購于美國Sigma公司；其它試劑購于北京化學(xué)試劑公司；PBS緩沖液的組成如下:終濃度為2mmol/L的NaH2PO4,終濃度為2mmol/L的Na2HPO4、終濃度為150mmol/L的NaCl和水；所述的PBS緩沖液的PH為7.4 ；SDS-HCl溶液中SDS的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%，HC1的濃度為
0.01mol/L。
[0081]實施例1表面等離子體共振生物芯片的制備
[0082](I)以直徑為20mm、厚度為1mm的圓形玻璃片作為基底，在玻璃基底上沉積厚度為50nm的金膜作為表面等離子體共振生物芯片的固相載體；
[0083](2)培養(yǎng)皿中注入含有終濃度為Imia^HS(CH2)iciCOOH (巰基十一酸)和9mMHS (CH2) 60H (巰基己酸)的乙醇溶液4mL，37°C溫浴，避光，對金膜表面進行化學(xué)修飾2h ;然后通入PBS緩沖液充分清洗3次，每次3min，洗掉未結(jié)合物質(zhì)；50°C氮氣吹干；
[0084](3)將上述固相載體固定在SPR檢測儀上；
[0085](4)流通池中通入PBS緩沖液清洗3次，每次3min，待基線穩(wěn)定后加入N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和N-乙基-N’ - (二甲氨基丙基)碳二亞胺(EDC)的混合液150 μ L，活化芯片15min ;然后通入PBS緩沖液清洗3次，每次3min ;其中，混合液中，N-羥基琥珀酰亞胺的終濃度為0.05mol/L、N-乙基-N’ - (二甲氨基丙基)碳二亞胺的終濃度為0.05mol/L ；
[0086](5)在生物芯片表面通入83mg/L的CLB-BSA100 μ L，固定生物探針，固定時間為30min ;記錄表面等離子體共振角的變化，監(jiān)測生物探針固定的過程，當(dāng)共振角不再升高時，探針固定過程結(jié)束；然后通入PBS緩沖液清洗3次，每次3min ；
[0087](6)加入lmol/L的乙醇胺溶液(pH=8.5) 150 y L，封閉滅活剩余的酯鍵6min ;然后通入PBS緩沖液清洗3次，每次3min。
[0088]實施例2利用表面等離子體共振生物芯片通過直接法檢測鹽酸克倫特羅抗體
[0089]( 1)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線:
[0090]用PBS緩沖液配制成不同濃度的CLB抗體標(biāo)準(zhǔn)溶液:濃度分別為0.5mg/L、lmg/L、5mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L、30mg/L、50mg/L 和 lOOmg/L ；以 PBS 緩沖液為基準(zhǔn)，各個標(biāo)準(zhǔn)溶液分別取100 u L依次注入表面等離子共振儀的微流通池，與實施例1制備得到的表面等離子體共振生物芯片上的探針發(fā)生免疫反應(yīng)，反應(yīng)時間設(shè)定為3min ;對生物芯片反應(yīng)區(qū)進行表面等離子體共振掃描，掃描范圍為I~2° ;記錄SPR共振角的變化，獲得各個標(biāo)準(zhǔn)溶液發(fā)生免疫反應(yīng)的表面等離子體共振動力學(xué)曲線(圖3)，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度作為橫坐標(biāo)，共振角作為縱坐標(biāo)，繪制工作曲線，并進行多項式曲線擬合，獲得回歸標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0091](2)未知樣品的檢測:
[0092]將100 U L的未知樣品通入微流通池與表面等離子體共振生物芯片上的探針發(fā)生免疫反應(yīng)，反應(yīng)時間設(shè)定為3min ;對表面等離子體共振生物芯片反應(yīng)區(qū)進行表面等離子體共振掃描，掃描范圍為I~2° ;記錄SPR共振角的變化，獲得未知樣品的表面等離子體共振動力學(xué)曲線，結(jié)合步驟(1)得到的回歸標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出未知樣品中CLB抗體的濃度；
[0093](3)下一樣品檢測:
[0094]一個樣品檢測結(jié)束后，微流通池先通入PBS緩沖液清洗3次，每次清洗3min ;再通A SDS-HCl溶液處理I~3次，使抗原-抗體結(jié)合物解離，每次處理3min ;然后通入PBS緩沖液3次，每次清洗的時間是3min ；SPR響應(yīng)值降回基線，繼續(xù)檢測下一個樣品。
[0095]配制不同濃度的CLB抗體標(biāo)準(zhǔn)溶液，樣品濃度分別為:lmg/L、5mg/L、10mg/L、30mg/L,記為其真實值；同時利用表面等離子體共振生物芯片通過直接法檢測上述CLB抗體標(biāo)準(zhǔn)溶液中CLB抗體的含量:通過SPR檢測儀測定的數(shù)據(jù)結(jié)合步驟(1)得到的回歸標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出樣品中CLB抗體濃度的檢測值；檢測值與真實值進行對比，如表1所示。檢測值與真實值的絕對偏差均較小，其相對偏差亦均較小，說明SPR生物芯片檢測系統(tǒng)具有良好的檢測能力，實驗方法可行。
[0096]表1利用表面等離子體共振生物芯片直接法檢測鹽酸克倫特羅抗體結(jié)果分析
[0097]
【權(quán)利要求】
1.一種表面等離子體共振生物芯片的制備方法，其特征在于包含如下步驟: (1)在玻璃基底上沉積厚度為45~55nm的金膜作為表面等離子體共振生物芯片的固相載體； (2)在培養(yǎng)皿中注入含有HS(CH2)ltlCOOH和HS(CH2)6OH的乙醇溶液，對金膜表面進行化學(xué)修飾；然后通入PBS緩沖液清洗，洗掉未結(jié)合物質(zhì)；氮氣吹干； (3)將上述固相載體固定在SPR檢測儀上； (4)流通池中通入PBS緩沖液清洗，待基線穩(wěn)定后加入N-羥基琥珀酰亞胺和N-乙基-N’ - (二甲氨基丙基)碳二亞胺的混合液活化芯片；然后通入PBS緩沖液清洗； (5)在生物芯片表面固定鹽酸克倫特羅-牛血清白蛋白耦聯(lián)物；記錄表面等離子體共振共振角的變化，監(jiān)測生物探針固定的過程，當(dāng)共振角不再升高時，探針固定過程結(jié)束；然后注入PBS緩沖液清洗； (6)加入乙醇胺溶液封閉滅活剩余的酯鍵；然后注入PBS緩沖液清洗；得到表面等離子體共振生物芯片。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表面等離子體共振生物芯片的制備方法，其特征在于: 步驟(1)中所述的玻璃基底為直徑為20mm、厚度為1mm的圓形玻璃片；所述的金膜的厚度為50nm ； 步驟(2)中所述的HS(CH2)iciCOOH的終濃度為ImM ;所述的HS(CH2)6OH的終濃度為9mM ； 步驟(2)中所述的化學(xué)修飾的條件為37°C溫浴，避光反應(yīng)2h ； 步驟(2)所述的氮氣吹干的溫度為50°C ； 步驟(4)中所述的N-羥基琥珀酰亞胺的終濃度為0.05mol/L ;所述的N-乙基-N’-(二甲氨基丙基)碳二亞胺的終濃度為0.05mol/L ； 步驟(4)中所述的活化芯片的時間為15min ； 步驟(5)中所述的鹽酸克倫特羅-牛血清白蛋白耦聯(lián)物的濃度為83mg/L ;所述的固定的時間為30min ； 步驟(6)中所述的乙醇胺溶液的濃度為lmol/L，pH值為8.5 ;所述的封閉滅活的時間為 6min ； 步驟(2)、(4)、(5)和(6)中所述的PBS緩沖液清洗的次數(shù)為3次，每次清洗的時間為3min ； 所述的PBS緩沖液的組成如下:終濃度為2mmol/L的NaH2PO4,終濃度為2mmol/L的Na2HP04、終濃度為 150mmol/L 的 NaCl 和水，pH 值為 7.4。
3.一種表面等離子體共振生物芯片，其特征在于由權(quán)利要求1或2所述方法制備得到。
4.權(quán)利要求3所述的表面等離子體共振生物芯片在生物芯片領(lǐng)域中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的表面等離子體共振生物芯片在生物芯片領(lǐng)域中的應(yīng)用，其特征在于:包括利用表面等離子體共振生物芯片通過直接法檢測鹽酸克倫特羅抗體的應(yīng)用和利用表面等離子體共振生物芯片通過競爭抑制法檢測鹽酸克倫特羅的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的表面等離子體共振生物芯片在生物芯片領(lǐng)域中的應(yīng)用，其特征在于:所述的利用表面等離子體共振生物芯片通過直接法檢測鹽酸克倫特羅抗體包含如下步驟: (一)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線:已知濃度的鹽酸克倫特羅抗體用PBS緩沖液配制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以PBS緩沖液為基準(zhǔn)，各個標(biāo)準(zhǔn)溶液分別注入表面等離子共振儀的微流通池，與表面等離子體共振生物芯片上的探針發(fā)生免疫反應(yīng)，對生物芯片反應(yīng)區(qū)進行表面等離子體共振掃描，記錄SPR共振角的變化，獲得各個標(biāo)準(zhǔn)溶液的表面等離子共振動力學(xué)曲線，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度作為橫坐標(biāo)，共振角作為縱坐標(biāo)，繪制工作曲線，并進行多項式曲線擬合，獲得回歸標(biāo)準(zhǔn)曲線； (二)未知樣品的檢測: 將未知樣品注入微流通池與表面等離子體共振生物芯片上的探針發(fā)生免疫反應(yīng)，對表面等離子體共振生物芯片反應(yīng)區(qū)進行表面等離子體共振掃描，記錄SPR共振角的變化，獲得未知樣品的表面等離子體共振動力學(xué)曲線，結(jié)合步驟(一)得到的回歸標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出未知樣品中鹽酸克倫特羅抗體的濃度； (三)下一樣品檢測: 步驟(二)中的免疫反應(yīng)結(jié)束后，微流通池先通入PBS緩沖液清洗I~5次，每次清洗的時間是I~5min ;再通入SDS-HCl溶液清洗I~3次，每次清洗時間是I~3min，使抗原-抗體結(jié)合物解離；然后通入PBS緩沖液I~5次，每次清洗的時間是I~3min ；SPR響應(yīng)值降回基線，繼續(xù)檢測下一個樣品。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的表面等離子體共振生物芯片在生物芯片領(lǐng)域中的應(yīng)用，其特征在于: 步驟(一)中所述的鹽酸克倫特羅抗體標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度范圍為0.5mg/L~100mg/L ； 步驟(一)所述的標(biāo)準(zhǔn)溶液的檢測量為IOOii L ;所述的免疫反應(yīng)的反應(yīng)時間為3min ;所述的表面等離子體共振掃描范圍為I~2° ; 步驟(二)中所述的未知樣品的檢測量為IOOii L ;所述的免疫反應(yīng)的反應(yīng)時間為3min ；所述的表面等離子體共振掃描范圍為I~2° ; 步驟(三)中所述的SDS-HCl溶液中SDS的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%，HCl的濃度為0.01mol/L ； 步驟(三)中所述的PBS緩沖液清洗次數(shù)為3次，每次清洗的時間為3min ； 所述的PBS緩沖液的組成如下:終濃度為2mmol/L的NaH2PO4,終濃度為2mmol/L的Na2HP04、終濃度為 150mmol/L 的 NaCl 和水，pH 值為 7.4。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的表面等離子體共振生物芯片在生物芯片領(lǐng)域中的應(yīng)用，其特征在于:所述的利用表面等離子體共振生物芯片通過競爭抑制法檢測鹽酸克倫特羅包含如下步驟: (I )建立標(biāo)準(zhǔn)曲線: 鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品用PBS緩沖液配制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，不同濃度的鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液分別與定量鹽酸克倫特羅抗體溶液混合，靜置，得到各個標(biāo)準(zhǔn)溶液與定量鹽酸克倫特羅抗體的混合溶液；以PBS緩沖液為基準(zhǔn)，各個標(biāo)準(zhǔn)溶液與定量鹽酸克倫特羅抗體的混合溶液分別注入表面等離子共振儀的微流通池，與表面等離子體共振生物芯片上的探針發(fā)生免疫反應(yīng)，對表面等離子體共振生物芯片反應(yīng)區(qū)進行表面等離子體共振掃描，記錄SPR共振角的變化，獲得各個標(biāo)準(zhǔn)溶液的表面等離子共振動力學(xué)曲線，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度作為橫坐標(biāo)，共振角作為縱坐標(biāo)，繪制工作曲線，并進行多項式曲線擬合，獲得回歸標(biāo)準(zhǔn)曲線.(II)未知樣品的檢測:將未知樣品提取液和定量鹽酸克倫特羅抗體的混合溶液注入微流通池進行免疫反應(yīng)，對表面等離子體共振生物芯片反應(yīng)區(qū)進行表面等離子體共振掃描，記錄SPR共振角的變化，獲得待測樣品的表面等離子體共振動力學(xué)曲線，結(jié)合步驟(I )得到的回歸標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出未知樣品中鹽酸克倫特羅小分子的濃度； (III)下一樣品的檢測: 步驟(II)中的免疫反應(yīng)結(jié)束后，微流通池先通入PBS緩沖液清洗I~5次，每次清洗的時間是I~5min ;再通入SDS-HCl溶液清洗I~3次，每次清洗時間是I~3min ；，使抗原-抗體結(jié)合物解離；然后通入PBS緩沖液I~5次，每次清洗的時間是I~3min ；SPR響應(yīng)值降回基線，繼續(xù)檢測下一個樣品。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的表面等離子體共振生物芯片在生物芯片領(lǐng)域中的應(yīng)用，其特征在于步驟(II)中所述未知樣品提取液，包含如下具體步驟: ①稱2g豬肉或豬肝； ②加入0.1M的HC16mL,振蕩IOmin,室溫下4000r/min離心IOmin ； ③取上清液，加入0.1M的NaOH2mL,加入6mL乙酸乙酯，振蕩IOmin,室溫下4000r/min離心IOmin ； ④取步驟③得到的上清液于50°C氮氣吹干； ⑤加入ImL三蒸水復(fù)溶，得到未知樣品提取液。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的表面等離子體共振生物芯片在生物芯片領(lǐng)域中的應(yīng)用，其特征在于: 步驟(I )中所述定量鹽酸克倫特羅抗體在混合溶液中終濃度為20mg/L ； 步驟(I )中所述的鹽酸克倫特羅小分子分子量為313.7 ； 步驟(I )中所述的標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度范圍為0.5~100 μ g/L ； 步驟(I )中所述的靜置時間為5min ； 步驟(I )中所述的鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品與鹽酸克倫特羅抗體的混合溶液的檢測量為100 μ L ;所述的免疫反應(yīng)的反應(yīng)時間為3min ;所述的表面等離子體共振掃描范圍為I~2° ; 步驟(II)中所述定量鹽酸克倫特羅抗體在混合溶液中終濃度為20mg/L ;未知樣品提取液與定量鹽酸克倫特羅抗體的混合溶液檢測量為100 μ L ;所述的免疫反應(yīng)的反應(yīng)時間為3min ;所述的表面等離子體共振掃描范圍為I~2° ； 步驟(III)中所述的SDS-HCl溶液中SDS的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%，HCl的濃度為0.01mol/L ； 步驟(III)中所述的PBS緩沖液清洗次數(shù)為3次，每次清洗的時間為3min ;所述的PBS緩沖液的組成如下:終濃度為2mmol/L的NaH2PO4,終濃度為2mmol/L的Na2HPO4、終濃度為150mmol/L 的 NaCl 和水，pH 值為 7.4。
【文檔編號】G01N33/543GK103792211SQ201410039804
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年1月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月27日
【發(fā)明者】李瑩, 鐘金鋼, 齊攀, 馬驍 申請人:暨南大學(xué)