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專利名稱：一種Micro RNA表達檢測方法及其定量檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種Micro RNA表達檢測方法及其定量檢測試劑盒。
背景技術：
Micro RNA是近年來在多種真核細胞及病毒中發現的一類來源內源性染色體上的非編碼單鏈RNA，長度為21 25nt的短序列，在進化上具有高度的保守性，能夠通過與靶mRNA特異性的堿基互補配對，引起靶mRNA降解或者抑制其翻譯，從而對基因進行轉錄后的表達調控(O'Donnell KA, Wentzel EA, Zeller KI, et al.e-Myc-regulated microRNAsmodulate E2F1 expression [J].Nature, 2005, 4 (7043): 839.) 由于 Micro RNA 序列在不同的生物中具有一定的保守性，目前普遍認為Micro RNA的功能是參與生命的一些基本過程，如發育過程中的細胞增殖、細胞死亡、應激反應和脂肪代謝等，越來越多的證據表明Micro RNA在細胞中起著調控基因表達的重要作用。最近的研究發現Micro RNA與細胞的癌變有著極為密切的關系，已經發現Micro RNA與肺癌、結直腸腫瘤、伯基特淋巴瘤和慢性淋巴細胞白血病等腫瘤疾病有關(M eltzer PS.Cancer genemics:Small RNAs with bigimpacts[J].Nature, 2005, 435(7043):745.)。由于Micro RNA分子只有20_25nt左右大小，檢測較為困難。以前主要采用的方法是Northern blot等雜交的方法進行檢測,方法繁瑣,不易成功,且Micro RNA極易降解，對于結果影響也較大。為了克服之前檢測方法的缺陷，Allawi等建立了 Invader Assay的方法(AllawiHT, Deahlberg JE, OlsonS, et al.Quantitation of Micro RNAs using a modifiedInvader assay.RNA, 2004, 10:1153-1161), Liu 等建立了寡核苷酸芯片方法(Liu C, CalmnGA, et al.An oligo nucleotide microchipfor genome-wide micro RNA profiling inhuman and mouse tissues.PNAS, 2004,101 (26):9740-9744),這種方法提高了檢測的敏感性及實用性，但這種方法需要熒光標記和熒光儀或芯片檢測儀，而且由于micro RNA分子太小，應用也受到一定的限制。如今,對Micro RNA前體的檢測主要是采用RT-PCR的方法(Schmittgen TD, JiangJ, Liu Q, et al.A high-throughput method to monitor the expression of Micro RNAprecursors.Nucleic Acids Research.2004,32(4):e43),米用隨機引物或與 Micro RNA前體互補的引物直接進行反轉錄，但是這僅僅只能針對特異的Micro RNA，而且半定量的方法不能準確地表現出Micro RNA的表達量，所以該方法已經漸漸退出了 Micro RNA分子的檢測的行列。上述方法在反轉錄Micro RNA時都顯得過于繁瑣且效率不高，于是出現了一種“加尾法”，即在Micro RNA的3’末端進行延長并采用real-time PCR的方法對Micro RNA進行檢測。常見的加尾法有兩種:一種是通過末端轉移酶在Micro RNA分子的3'末端加上Poly-A尾巴(Shi R, Chiang V L.Facile means for quantifying Micro RNA expressionby real-time PCR[J].BioTechniques, 2005，39 (4): 519-525.)，用 30 40 個核苷酸的Oligo-dT作為引物進行反轉錄得到被延長的cDNA，可以使用SYBR Green進行實時定量PCR檢測；另一種是直接使用與Micro RNA末端配對的加長引物反轉錄成cDNA，而后使用LNA修飾的引物通過Real-time PCR法對Micro RNA的表達情況進行檢測(RaymondC K, Roberts B S, Garrett—engele P.et al, Simple quantitative primer—extensionPCR for direct monitoring of Micro RNA and short-1nterfering RNAs[J].RNA, 2005.11(11):1737-1744.)。然而這兩種方法中，隨機加尾法合成出來的cDNA對于PCR而言相對過短，只適合使用探針的taq man法檢測,而加特異性micro RNA末端配對尾部的方法，只能合成Micro RNA特異性的cDNA,無法與內參同時反轉,可能造成較大的誤差。為了更高效地檢測Micro RNA的表達量，并提高準確性，Chen等(Chen C，RidzonD A, Broomer A J, et al.Realtime quantification of micro RNAs by stem-loopRT-PCR[J].Nucleic Acids Res, 2005，33(20): 179.)在特異性 micro RNA 末端配對的加長引物反轉錄的基礎上，將r eal time PCR技術引入到micro RNA的檢測當中，建立了名為莖環的反轉錄定量PCR技術(stem-loop RT-PCR)0他首先設計了一個具有莖環結構的反轉錄的探針，然后采用Taq man的探針技術，對Micro RNA進行檢測，據報道這種結構大大提高了 Micro RNA反轉錄的效率和特異性。但是這樣高特異性的同時也導致了一次反轉只能反轉錄出特異的一條Micro RNA，對于檢測整體的Micro RNA及其他小片段RNA的表達狀況來說是一種極大的制約，同時使用Taqman探針的方法也大大提高了 Micro RNA的檢測成本。

發明內容
因此，本發明要解決的技術問題就是針對Micro RNA分子表達檢測較為困難，現有的檢測方法步驟繁瑣、不易成功，并且所得Micro RNA極易降解，對結果有較大影響的缺陷，提供一種Micro RNA表達檢測方法以及一種Micro RNA定量檢測試劑盒。為解決上述技術問題，本發明采取的技術方案之一是:一種Micro RNA表達檢測方法，其中所述方法包括:(I)提取樣品的Micro RNA,將所得Micro RNA連接PolyA尾巴；(2)將三條具有莖環結構的引物混合后進行退火處理，所述具有莖環結構的引物的序列分別如序列表中SEQ ID NO: 1、SEQ ID N0:2和SEQ IDN0:3所示;(3)將步驟(I)所得連有Poly A尾巴的Micro RNA與步驟(2)所得具有莖環結構的引物退火連接；(4)以步驟(3)所得Micro RNA為模板反轉錄得到cDNA ；(5)以步驟(4)所得cDNA為模板，加入擴增目標Micro RNA的引物，通過熒光定量PCR方法檢測目標Micro RNA的表達。其中步驟(I)所述提取樣品Micro RNA的方法為本領域的常規方法。所述樣品Micro RNA的提取可以利用各種市售試劑盒進行。所述Micro RNA連接PolyA尾巴的方法為本領域常規使用的加尾方法，本發明所述加Poly A尾巴的方法較佳地包括:加入Poly A聚合酶，加入ATP溶液，將該混合液35 37°C反應10 15min即得。其中步驟(2)所述的三條具有莖環結構的引物為本領域常規引物。所述的三條具有莖環結構的引物的序列較佳地分別如序列表中SEQ ID NO: 1、SEQ ID N0:2和SEQ IDNO:3所示。其中所述具有莖環結構的引物的制備方法為本領域常規的制備方法，本發明所述具有莖環結構的弓I物較佳地為通過人工全序列合成即得。其中步驟(2)所述退火處理為本領域常規的退火處理技術。本發明所述退火處理的程序較佳地為:(1)95°C反應2min，(2)每5 10秒下降0.1°C，降至35°C 15°C，(3)4°C保存，更佳地為(1)95°C反應2min，(2)每8秒下降0.1°C，降至25°C，(3)4°C保存。其中步驟(3)所述退火連接的程序較佳地為:60 70°C，反應5 lOmin，即得。其中步驟(4)所述反轉錄為本領域常規反轉錄技術，本發明所述反轉錄的程序較佳地為:(1) 30°C反應10 15分鐘；(2) 42 V反應50 60分鐘；(3) 50°C反應10 15分鐘；
(4)95°C反應10 15分鐘；(5)將所得cDNA樣品于4°C保存。其中步驟(5)所述擴增目標Micro RNA的引物為:Micro RNA通用反向引物和Micro RNA檢測正向引物。其中所述Micro RNA通用反向引物為本領域常規的Micro RNA通用反向引物，本發明所述Micro RNA通用反向引物序列較佳地為:5’ -CTGCAGTGGCGGACCA-3’，如序列表中SEQ ID NO:4 所示。其中所述Micro RNA檢測正向引物為本領域常規的Micro RNA檢測正向引物，本發明所述Micro RNA檢測正向引物較佳地為:Has-MiR_365a檢測正向引物:5’-TAATGCCCCTAAAAATCCTTAT-3’，該引物序列如序列表中SEQ ID NO: 5所示。所述擴增目標Micro RNA的引物的制備方法為本領域常規制備方法，較佳地為人工全序列合成即得。其中步驟(5)所述熒光定量PCR為本領域常規使用的熒光定量PCR技術(或稱為real time PCR技術，簡稱為 qPCR或者qRT-PCR)。針對不同的目標Micro RNA可采用不同的熒光定量PCR程序進行檢測。本發明所述熒光定量PCR的程序較佳地為:(I)預變性95。。，I分鐘;(2)變性95°C，5S ;(3)退火延伸60°C,20S ;步驟(2) (3)共進行40個循環，每次在延伸階段讀取吸光值。為解決上述技術問題，本發明采取的技術方案之二是:一種具有莖環結構的引物，所述具有莖環結構的引物的序列如序列表中SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3所
/Jn ο其中所述具有莖環結構的引物為本領域常規的具有莖環結構的引物，本發明所述具有莖環結構的引物較佳地為:Oligol:5’ -GTCGGAGAGACTGCAGTGGCGGACCAATTCGCACTCTCTCCGACTTTTTTTTA-3’(如序列表中 SEQID NO:1 所示)；01igo2:5，-GTCGGAGAGACTGCAGTGGCGGACCAATTCGCACTCTCTCCGACTTTTTTTTC-3’(如序列表中 SEQID NO:2 所示)；01igo3:5’ -GTCGGAGAGACTGCAGTGGCGGACCAATTCGCACTCTCTCCGACTTTTTTTTG-3’(如序列表中 SEQID NO:3 所示)。其中所述具有莖環結構的引物的制備方法為常規制備方法，本發明所述具有莖環結構的引物較佳地為全序列人工合成即得。
為解決上述技術問題，本發明采取的技術方案之三是:一種Micro RNA定量檢測試劑盒，該Micro RNA定量檢測試劑盒包括:SYBR Green I熒光染料、PCR緩沖液、dNTPs溶液、DNA聚合酶、無菌雙蒸水、具有頸環結構的引物、通用反向引物和Micro RNA檢測正向引物，其中所述具有頸環結構的引物的序列分別如序列表中SEQ ID NO: K SEQ ID N0:2和SEQID NO:3 所示。
其中所述SYBR Green I熒光染料、PCR緩沖液、dNTPs溶液、DNA聚合酶、無菌雙蒸水均為本領域常規的市售實驗試劑。其中所述通用反向引物為本領域常規的通用反向引物。本發明所述Micro RNA通用反向引物序列較佳地為:5’ -CTGCAGTGGCGGACCA-3’，如序列表中SEQ ID N0:4所示。其中所述Micro RNA檢測正向引物為本領域常規的Micro RNA檢測正向引物，本發明所述Micro RNA檢測正向引物較佳地為Has_MiR-365a檢測正向引物:5’ -TAATGCCCCTAAAAATCCTTAT-3’，其序列如序列表中 SEQ IDNO:5 所示。其中所述具有頸環結構的引物的序列較佳地分別如序列表中SEQ IDNO: USEQ IDN0:2和SEQ ID N0:3所示。其中所述引物的制備方法為本領域常規制備方法，較佳地為人工合成制備即得。其中所述Micro RNA定量檢測試劑盒，較佳地還包括RNA提取試劑和/或反轉錄試劑。其中所述的RNA提取試劑較佳地為:Trizol試劑、RNA酶抑制劑。其中所述的反轉錄試劑較佳地為:逆轉錄酶(AMV)、AMV緩沖液。其中所述AMV緩沖液較佳地包括:dNTPs、隨機引物、RNA酶抑制劑。所述試劑的制備方法為本領域常規制備方法，較佳地為市售所得。其中所述Micro RNA定量檢測試劑盒較佳地還包括內參引物。本發明所述內參引物為本領域常規的內參引物，本發明所述內參引物較佳地為U6-F和U6-R引物，所述內參引物的序列如下所示:U6-F:5’ -CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，如序列表中 SEQ ID NO: 6 所示；U6-R:5’ -AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’，如序列表中 SEQ ID N0:7 所示。所述內參引物制備方法為本領域常規制備方法，較佳地為人工合成序列。本發明所用的原料或試劑除特別說明之外，均市售可得。相比于現有技術，本發明的有益效果如下:1、本發明提供的Micro RNA表達檢測方法利用所述具有莖環結構的引物，通過一次反轉錄幾乎可以得到待測樣品中所有的Micro RNA樣本，以及內參基因(U6基因，該基因為IOObp左右的mRNA)，大大提高了 Micro RNA的檢測效率。2、本發明提供的具有莖環結構的引物，經過退火處理后，能夠大幅降低引物二聚體及復雜發卡結構的生成，從而最大幅度地提高了該引物對于Micro RNA的反轉效率。本發明所述Micro RNA定量檢測試劑盒利用所述具有頸環結構的引物，可以通過一次反轉錄反應，完成包括內參以及待檢Micro RNA在內的反轉錄,大大降低了分步反轉Micro RNA及內參的小片段mRNA所產生的系統誤差，該方法簡單高效，從而大幅節省了時間和成本。


圖1 (A)為Cal-27細胞qPCR內參基因(U6)擴增曲線；圖1 (B)為Cal_27細胞qPCR內參基因(U6)熔解曲線圖；圖1 (C)為Cal-27細胞qPCR待檢基因(MiR_365a)擴增曲線；圖1 (D)為Cal-27細胞qPCR待檢基因(MiR_365a)熔解曲線圖。其中a為Cal_27細胞樣本重復1，b為Cal-27細胞樣本重復2，c為Cal-27細胞樣本重復3。圖2 (A)為H印-2細胞qPCR內參基因(U6)擴增曲線；圖2 (B)為H印_2細胞qPCR內參基因(U6)熔解曲線圖；圖2 (C)為H印-2細胞qPCR待檢基因(MiR_365a)擴增曲線；圖2 (D)為H印-2細胞qPCR待檢基因(MiR_365a)熔解曲線圖。其中d為!fep-2細胞樣本重復1，e為!fep-2細胞樣本重復2，f為!fep-2細胞樣本重復3。圖3 (A)為LOVO細胞qPCR內參基因(U6)擴增曲線；圖3 (B)為LOVO細胞qPCR內參基因(U6)熔解曲線圖；圖3 (C)為LOVO細胞qPCR待檢基因(MiR_365a)擴增曲線；圖3 (D)為LOVO細胞qPCR待檢基因(MiR_365a)熔解曲線圖。其中g為LOVO細胞樣本重復1，h為LOVO細胞樣本重復2，i為LOVO細胞樣本重復3。圖4 (A)為MCF-7細胞qPCR內參基因(U6)擴增曲線；圖4 (B)為MCF-7細胞qPCR內參基因(U6)熔解曲線圖；圖4 (C)為MCF-7細胞qPCR待檢基因(MiR_365a)擴增曲線；圖4 (D)為MCF-7細胞qPCR待檢基因(MiR-365a)熔解曲線圖。其中j為MCF-7細胞樣本重復1，k為MCF-7細胞樣本重復2，I為MCF-7細胞樣本重復3。圖5為Cal-27、Hep-2, LOVO, MCF-7細胞系中Micro RNA365a基礎表達檢測結果圖。圖6為對比實施例1中四種細胞系(Cal-27、H印-2、L0V0、MCF-7)的Micro RNA365a表達量檢測結果圖。
具體實施例方式主要儀器為:5417R臺式冷凍高速離心機，thermo公司，商品號cat#5417R ；PCR 儀，cat#2500 ;`ThermoForma310 系列直熱式 CO2 培養箱，thermo 公司，cat#3111 ；酶標儀Biotek 公司，VE-186 ；主要試劑為:PrimerScript反轉錄酶，Takara公司，商品號:cat#U1240 ；E.coli Poly(A)聚合酶，NEB 公司，商品號:#M0276S ；5 X退火緩沖液,碧云天公司，商品號:D0251 ；GXD kit iqSYBR Green, Bio-Rad 公司，商品號:1708882AP ；Cal-27 細胞株，購自 ATCC，商品號:CRL_2095 ；H印2細胞株，購自中科院細胞庫，商品號:TCHu21 ；L0V0細胞株，購自中科院細胞庫，商品號:TCHu82 ；MCF-7細胞株，購自中科院細胞庫，目錄號:TCHu74 ；改良RPM1-1640 培養基，購自 Hyclone，貨號:SH30809.0lB ；FBS，胎牛血清，購自普飛生物，貨號:1101-500 ；Penicillin-Streptomycin solution SP 雙抗，購自 Hyclone,貨號:J121071 ;Micro RNA抽提試劑盒:Micro RNApure Mini kit,購自康為世紀公司，貨號:CW0627。實施例1Micro RNA反轉錄檢測引物
本發明針對Micro RNA提供3條具有莖環結構的引物，所述莖環引物名稱和序列分別如下所示:Oligol:5’ -GTCGGAGAGACTGCAGTGGCGGACCAATTCGCACTCTCTCCGACTITITITTA-3’(如序列表中 SEQ ID NO:1 所示)；01igo2:5’ -GTCGGAGAGACTGCAGTGGCGGACCAATTCGCACTCTCTCCGACTTTTTTTTC-3’(如序列表中 SEQ ID NO:2 所示)；01igo3:
5’ -GTCGGAGAGACTGCAGTGGCGGACCAATTCGCACTCTCTCCGACTTTTTTTTG-3’(如序列表中 SEQ ID NO:3 所示)。上述引物由捷瑞生物合成制備。本發明還利用了 Micro RNA通用反向引物和Has_MiR-365a檢測正向引物，所述引物分別如下所示:Micro RNA 通用反向引物序列:5’-CTGCAGTGGCGGACCA-3’(如序列表中 SEQ IDN0:4所示)；Has-MiR-365a 檢測正向引物:5’ -TAATGCCCCTAAAAATCCTTAT-3’(如序列表中 SEQID NO:5 所示)。本發明使用的內參引物為U6-F和U6-R引物，所述引物如下所示:U6-F:5’ -CTCGCTTCGGCAGCACA-3’(如序列表中 SEQ ID NO:6 所示)；U6-R:5’ -AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’(如序列表中 SEQ ID NO:7 所示)。上述引物均由捷瑞生物合成制備，所述引物的濃度均為lOOnmol/μ I。實施例2實驗用各細胞系的制備無菌37°C，5%C02條件下，使用1640+10%FBS+1%SP培養基進行細胞貼壁培養，分別培養Cal-27、Hep2, LOVO, MCF-7細胞，于6cm培養皿中，待細胞生長至80%左右后，即可進行抽提Micro RNA實驗。實施例3Micro RNA樣品的制備1.單層培養細胞:吸去培養液，加入Buffer RLM (Micro RNA抽提緩沖液，Lot:04911C ;購自康為世紀，包含于Micro RNA提取試劑盒內，Cat:CW0627)，每IOcm2加入Iml Buffer RLM02.樣品中加入Buffer RLM后反復吹打幾次，使其充分裂解。室溫放置5分鐘，使蛋白核酸復合物完全分離。3.以每Iml Buffer RLM加入200 μ I氯仿的比例加入氯仿，蓋好管蓋，劇烈振蕩15秒，室溫放置5分鐘。4.40C 12，OOOrpm離心15分鐘，樣品分為三層:紅色有機相，中間層和無色水相，將上層無色水相移到一個新的離心管中。5.向步驟4得到的溶液中加入1/3倍體積的無水乙醇，混勻，將得到的溶液和沉淀一起轉入已裝入收集管(Collection Tube2ml)的吸附柱RM (Spin Column RM)中。若一次不能將全部溶液加入吸附柱，請分多次轉入。12，OOOrpm離心30秒，離心后棄掉吸附柱RM，保留流出液。6.向步驟5得到的溶液中加入2/3倍體積的無水乙醇，混勻。7.將上步所得溶液和沉淀一起轉入已裝入收集管(Collection Tube2ml)的吸附柱RS(Spin Column RS)中。若一次不能將全部溶液加入吸附柱，請分多次轉入。12，OOOrpm離心30秒，倒掉收集管中廢液，將吸附柱RS重新放回收集管中。8.向吸附柱RS中加入700 μ I Buffer RffT (使用前檢查是否加入無水乙醇)，室溫12，OOOrpm離心30秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱RS重新放回收集管中。9.向吸附柱RS中加入500 μ I Buffer RW2 (使用前檢查是否加入無水乙醇)，室溫12，OOOrpm離心30秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱RS重新放回收集管中。10.重復步驟9。11.12，OOOrpm離心I分鐘，倒掉收集管中的廢液。將吸附柱RS置于室溫數分鐘，以徹底晾干。注意:此步驟的目的是將吸附柱RS中殘留的乙醇去除，乙醇的殘留會影響后續的酶促反應(酶切、PCR等)。12.將吸附柱RS置于一個新的無RNA酶(RNase-free)離心管(CollectionTubel.5ml)中，向吸附柱中間部位加入30 μ I的不含RNA酶的水(RNase-Free Water)，室溫放置I分鐘，12，OOOrpm離心I分鐘，收集RNA溶液，得到的RNA溶液保存在_70°C，防止降解。13.使用酶標儀檢測所得RNA濃度，檢測所得Micro RNA濃度如表I所示:表IMicro RNA 濃度
權利要求
1.一種Micro RNA表達檢測方法,其特征在于,所述Micro RNA表達檢測方法包括以下步驟: (1)提取樣品的MicroRNA，將所得Micro RNA連接PolyA尾巴； (2)將三條具有莖環結構的引物混合后進行退火處理，所述具有莖環結構的引物的序列分別如序列表中SEQ ID NO: 1、SEQ ID N0:2和SEQ IDN0:3所示; (3)將步驟(I)所得連有PolyA尾巴的Micro RNA與步驟(2)所得具有莖環結構的引物退火連接； (4)以步驟(3)所得MicroRNA為模板反轉錄得到cDNA ； (5)以步驟(4)所得cDNA為模板，加入擴增目標MicroRNA的引物，通過熒光定量PCR方法檢測目標Micro RNA的表達。
2.如權利要求1所述的MicroRNA表達檢測方法，其特征在于，步驟(2)所述退火處理的程序為:(1)95°C反應2min，(2)每5 10秒下降0.1°C，降至35°C 15°C，(3) 4°C保存。
3.如權利要求1所述的MicroRNA表達檢測方法,其特征在于,步驟(3)所述退火連接的程序為:60 70°C，反應5 lOmin。
4.如權利要求1所述的MicroRNA表達檢測方法,其特征在于,步驟(4)所述反轉錄的程序為:(1) 30°C反應10 15分鐘；(2) 42°C反應50 60分鐘；(3) 50°C反應10 15分鐘；(4) 95°C反應10 15分鐘；(5)將所得cDNA樣品于4°C保存。
5.如權利要求1所述的MicroRNA表達檢測方法，其特征在于，步驟(5)所述擴增目標Micro RNA的引物為:Micro RNA通用反向引物和MicroRNA檢測正向引物，所述Micro RNA檢測正向引物的序列如序列表中SEQID N0:5所示。
6.一種具有莖環結構的引物，其特征在于，所述具有莖環結構的引物的序列如序列表中 SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2 或 SEQ ID NO:3 所示。
7.一種Micro RNA定量檢測試劑盒，其特征在于，該Micro RNA定量檢測試劑盒包括:SYBR Green I熒光染料、PCR緩沖液、dNTPs溶液、DNA聚合酶、無菌雙蒸水、具有頸環結構的引物、通用反向引物和Micro RNA檢測正向引物，其中所述具有頸環結構的引物的序列分別如序列表中 SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2 和 SEQ ID NO:3 所示。
8.如權利要求7所述的MicroRNA定量檢測試劑盒，其特征在于，所述Micro RNA檢測正向引物的序列如序列表中SEQ ID N0:5所示。
9.權利要求7 8任一項所述MicroRNA定量檢測試劑盒在檢測Micro RNA表達中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種MicroRNA表達檢測方法及其定量檢測試劑盒。該方法包括(1)提取樣品的MicroRNA，將該MicroRNA連接PolyA尾巴；(2)將三條具有莖環結構的引物混合后退火處理，(3)將連有PolyA尾巴的MicroRNA與具有莖環結構的引物退火連接，(4)以該MicroRNA為模板反轉錄得到cDNA，(5)以該cDNA為模板，加入擴增目標MicroRNA的引物，通過熒光定量PCR方法檢測目標MicroRNA表達。所述方法通過一次反轉錄可得到待測對象所有的MicroRNA及內參基因，大大降低了引物二聚體以及復雜發卡結構的生成，大幅度提高了對MicroRNA的檢測效率。
文檔編號G01N21/64GK103205489SQ201310036690
公開日2013年7月17日 申請日期2013年1月30日 優先權日2013年1月30日
發明者姚遠颋, 王海峰, 費倩嵐, 談竹君, 勞昕元 申請人:上海黃離生物科技有限公司