用于肺癌早中期快速診斷試劑盒及其檢測方法
【專利摘要】本發明公開了一種用于肺癌早中期快速診斷試劑盒，所述捕獲抗體包括半乳糖凝集素、細胞角質素片段抗原21-1和人類天冬胺酰基β－羥化酶分別制得的單克隆抗體；所述試劑盒還包括檢測抗體，所述檢測抗體包括半乳糖凝集素、細胞角質素片段抗原21-1和人類天冬胺酰基β－羥化酶分別制得的HRP標記后的多克隆抗體。本發明的有益效果如下：具有靈敏度高準確性強的特點，其靈敏度及準確性均達到90%以上，另外可以有效降低檢測成本、減少操作步驟和降低檢測誤差。
【專利說明】用于肺癌早中期快速診斷試劑盒及其檢測方法
【技術領域】:
[0001]本發明涉及癌癥診斷檢測用的試劑盒領域，具體為一種用于肺癌早中期快速診斷試劑盒及其檢測方法。
【背景技術】:
[0002]肺癌是全球范圍內死亡率最高的癌癥。這種癌癥治療困難，轉移的肺癌尤其難治。大約有75%的肺癌患者在確診時已經為轉移性或晚期，其5年生存率僅為6%。過去數十年來，雖然化療、放療和手術等治療措施有了快速的發展，但肺癌的5年生存率仍然較低。主要是因為還沒有一種安全的方法可以對其進行篩選，在疾病的早期——治療的最佳時機，就及時發現患者罹患肺癌的可能性微乎其微。
[0003]目前迫切需要一種有效的篩選策略。當CT掃描不清楚，血液測試能幫助醫生做出更好的判斷。對無癥狀患者采用CT掃描進行篩選，既昂貴又危險。這種篩選有很高的假陽性，其中一些患者將接受不必要的肺部活組織檢查。
[0004]腫瘤標志物(tumor markers,TM)是指在腫瘤發生和增殖過程中，由腫瘤細胞本身合成、釋放，或由機體對腫瘤細胞反應而產生的標志腫瘤存在和生長的一類物質。這些物質在正常成人中不存在或者是在癌癥患者中出現的水平顯著高于正常人。目前腫瘤標志物檢測技術被認為是早期發現無癥狀微灶腫瘤的唯一途徑，這一檢測技術可先于X光片、超聲、CT、MRI或PET-CT等物理檢查發現腫瘤。可用于高危人群惡性腫瘤的篩查，腫瘤診斷與鑒別診斷，評估治療的效果，預測或監視腫瘤復發或轉移。目前，醫院出現的肺癌診斷試劑盒都是檢測一些常見的腫瘤標記物，靈敏性及準確性都偏低。因主要是選定的腫瘤標記物單項檢測往往有很大的局限性，難以滿足早期快速診斷的要求。
[0005]目前，市場上還沒有針對肺癌的快速高效診斷試劑盒問世，嚴重影響到肺癌早期發現及治療。
【發明內容】
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[0006]本發明的目的是針對以上述現有肺癌診斷存在的不足，提供一種靈敏度高、準確性強且使用方便高效的用于肺癌早中期快速診斷試劑盒。
[0007]本發明另一目的是提供一種用于肺癌早中期快速診斷試劑盒的檢測方法。
[0008]為了實現本發明目的，本發明采取的技術方案是:用于肺癌早中期快速診斷試劑盒，包括捕獲抗體，所述捕獲抗體包括半乳糖凝集素和細胞角質素片段抗原21-1(CYFRA21-1)分別制得的單克隆抗體。
[0009]所述捕獲抗體還包括人類天冬胺酰基β —羥化酶(HAAH)制得的單克隆抗體。
[0010]所述試劑盒還包括檢測抗體，所述檢測抗體包括半乳糖凝集素、細胞角質素片段抗原21-1(CYFRA21-1)和人類天冬胺酰基β —羥化酶(HAAH)分別制得的HRP標記后的多克隆抗體。
[0011]所述捕獲抗體為將半乳糖凝集素、細胞角質素片段抗原21-1(CYFRA21-1)和人類天冬胺酰基β —羥化酶(HAAH)克隆到真核表達載體，并在哺乳動物細胞中實現蛋白的表達，純化后得到相應的抗原，將所述抗原免疫哺乳動物得到的相應單克隆抗體。
[0012]所述捕獲抗體的制備方法包括的步驟如下:
[0013](I)抗原的制備:把半乳糖凝集素、細胞角質素片段抗原21-1及人類天冬胺酰基β —羥化酶的基因克隆到真核表達載體，并在哺乳動物細胞中實現蛋白的表達，純化后得到抗原，此抗原也可作為標準品用；
[0014](2)捕獲抗體的制備:將上述抗原免疫哺乳動物，得到相應的單克隆抗體為捕獲抗體。
[0015]所述檢測抗體為將半乳糖凝集素、細胞角質素片段抗原21-1 (CYFRA21-1)和人類天冬胺酰基β —羥化酶(HAAH)克隆到真核表達載體，并在哺乳動物細胞中實現蛋白的表達，純化后得到相應的抗原，將所述抗原免疫哺乳動物得到的相應多克隆抗體，對所述多克隆抗體進行HRP標記。
[0016]所述檢測抗體的制備方法包括的步驟如下:
[0017](I)抗原的制備:把半乳糖凝集素、細胞角質素片段抗原21-1及人類天冬胺酰基β —羥化酶的基因克隆到真核表達載體，并在哺乳動物細胞中實現蛋白的表達，純化后得到抗原，此抗原也可作為標準品用；
[0018](2)檢測抗體的制備:將上述抗原免疫哺乳動物，得到相應的多克隆抗體為檢測抗體；
[0019](3) HRP標記:對所述多克隆抗體進行HRP標記。
[0020]所述半乳糖凝集素優選半乳糖凝集素-3和半乳糖凝集素_8。
[0021]所述捕獲抗體預先包被于微量滴定板的孔內，可以簡化步驟，提高檢測效率。
[0022]用于肺癌早中期快速診斷試劑盒的制備方法，其包括以下步驟:
[0023](I)抗原的制備:將半乳糖凝集素、細胞角質素片段抗原21-1及人類天冬胺酰基β —羥化酶的基因克隆到真核表達載體，并在哺乳動物細胞中實現蛋白的表達，純化后得到所需的抗原，其中，所述抗原也可作為標準品用。
[0024](2)捕獲抗體的制備:將上述抗原免疫哺乳動物得到相應的單克隆抗體，所述單克隆抗體作為本試劑盒的捕獲抗體。
[0025](3)檢測抗體的制備:將上述抗原免疫哺乳動物得到相應的多克隆抗體，對所述多克隆抗體進行HRP標記。本發明檢測抗體具有標記功能，可以省去標記抗體以及添加標記抗體的操作步驟，有效的節約成本，減少操作步驟，降低檢測誤差。
[0026](4)捕獲抗體包被:
[0027]①.用碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液(ρΗ9.6)將濃度為I μ g/ml的捕獲抗體包被微量滴定板的孔；②.封蓋微量滴定板并在4°C下孵育過夜；③.棄去包被液(碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液稀釋的捕獲抗體)，并用洗滌液洗滌微量滴定板兩次，每次在微孔中加入200 μ IPBST (磷酸鹽吐溫緩沖液)，在水槽上方輕輕甩動微量滴定板，除去洗滌液，在紙巾上輕拍微量滴定板，除去剩余的液滴，晾干放于4°C環境中備用。
[0028](5)封閉:每孔添加200 μ I封閉緩沖液(1.2% BSA/PBS)，封閉包被孔中剩余的蛋白質結合位點。
[0029]用于肺癌早中期快速診斷試劑盒的檢測方法，其包括以下步驟:[0030](I)抗原的制備:將Galectin-3，HAAH及CYFRA21-1基因克隆到真核表達載體，并在哺乳動物細胞中實現蛋白的表達，純化后得到所需的抗原；
[0031](2)捕獲抗體的制備:將上述抗原免疫哺乳動物得到相應的單克隆抗體，所述單克隆抗體作為本試劑盒的捕獲抗體；
[0032](3)檢測抗體的制備:將上述抗原免疫哺乳動物得到相應的多克隆抗體，對所述多克隆抗體進行HRP標記；
[0033](4)捕獲抗體包被:
[0034]①.用碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液(pH9.6)將濃度為I μ g/ml的捕獲抗體包被微量滴定板的孔；
[0035]②.封蓋微量滴定板并在4°C下孵育過夜；
[0036]③.棄去包被液(碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液稀釋的捕獲抗體)，并用洗滌液洗滌微量滴定板兩次，每次在微孔中加入200 μ I PBST (磷酸鹽吐溫緩沖液)，在水槽上方輕輕甩動微量滴定板，除去洗滌液，在紙巾上輕拍微量滴定板，除去剩余的液滴，晾干放于4°C環境中備用。
[0037](5)封閉
[0038]①.在微量滴定板的每個孔添加200 μ I封閉緩沖液(1.2% BSA/PBS)，封閉包被孔中剩余的蛋白質結合位點；
[0039]②.封蓋微量滴定板并在37°C孵育I小時；
[0040](6)加樣
[0041]①.將100μ I的樣品添加到微量滴定板的每個孔，在37°C下孵育60分鐘；要得到準確的定量結果，通常做法是比較未知樣品與標準曲線的信號。每個酶標板都必須測定標準品(兩重測定或三重測定)和空白樣，以確保準確性；
[0042]②.棄去樣品，并洗滌微量滴定板三次，每次在微孔中加入200 μ I PBST (磷酸鹽吐溫緩沖液);
[0043]③.將100 μ I濃度為0.5 μ g/ml的檢測抗體添加到每個孔；
[0044]④.封蓋微量滴定板并在37°C下孵育I小時；
[0045]⑤.用PBST洗滌微量滴定板四次；
[0046](7)檢測
[0047]①.將TMB (3，3’，5，5’-四甲基聯苯胺)溶液添加到每個孔，孵育15-30分鐘，添加等體積的終止液，然后在450nm處讀取光密度。
[0048]②.由系列稀釋液得到的數據繪制標準曲線，濃度標在X軸(對數標度)上，而吸光度標在Y軸(線性標度)上。通過內插法在此標準曲線上得出樣品濃度。
[0049]本發明從眾多的腫瘤標記物中，通過各種不同的排列組合，篩選出3個腫瘤標記物(半乳糖凝集素-3，人類天冬胺酰基β-羥化酶(HAAH)，細胞角質素片段抗原21-KCYFRA21-1)組成肺癌快速診斷試劑盒。其中，人類天冬胺酰基β —羥化酶(HumanAsparty 1/AsparaginyI β -hydroxylase, ΗΑΑΗ)是胚胎期即存在于細胞內的一種酶，屬于依賴α-酮戊二酸雙加氧酶家族，可催化特定蛋白中表皮生長因子(EGF)受體樣結構域的天冬氨酸或天冬酰胺殘基上的β —碳原子羥基化。研究表明HAAH在腫瘤細胞表面的高表達，是一種新型惡性腫瘤高特異性的分子標記物。最近的研究也證實HAAH是肺癌的理想標記物。半乳糖凝集素_3(Galectin-3)是一種半乳糖結合蛋白，是Glectin家族中唯一具有嵌合結構的成員。半乳糖凝集素-3 (Galectin-3)廣泛分布于腫瘤組織中，半乳凝素_3的表達同其腫瘤的侵襲和轉移密切相關。Galectin-3可與細胞表面糖基化的CD98結合促使整合素在細胞表面聚集成簇，間接增強整合素與其配體的親和力；也能直接結合整合素α?β?和⑶Ilb / 18，正性或負性調節整合素的活性，影響整合素與細胞外配體的結合。Galectin-3還可以增加整合素在細胞表面的表達，并促進膠原在細胞間隔的分泌。由于半乳糖凝集素-3對多聚糖有親和力，它也可以直接結合糖基化的細胞外基質成分，介導細胞與基質的黏附。研究顯示肺癌患者血清中Galectin-3水平明顯超過健康人群。細胞角質素片段抗原21-1(CYFRA21-1)是細胞角蛋白19 (CYK-19)的可溶性片段，CYK-19廣泛分布在正常組織表面，如層狀或鱗狀上皮中。在惡性上皮細胞中，激活的蛋白酶加速了細胞的降解，使得大量細胞角蛋白片段CYFRA21-1釋放入血，在惡性肺癌組織中，CYFRA21-1含量豐富，尤其是在肺鱗癌中有高表達。
[0050]與現有技術相比，本發明的有益效果如下:具有靈敏度高準確性強的特點，其靈敏度及準確性均達到90%以上，另外可以有效降低檢測成本、減少操作步驟和降低檢測誤差。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0051]圖1是本發明用于肺癌早中期快速診斷試劑盒的原理圖；
[0052]圖2是本發明用于肺癌早中期快速診斷試劑盒的檢測抗體最佳工作濃度的選擇對比圖；
[0053]圖3是本發明用于肺癌早中期快速診斷試劑盒在肺癌治療前后血中檢測到Galectin-3的變化對 比圖；
[0054]圖4是本發明用于肺癌早中期快速診斷試劑盒在肺癌治療前后血中檢測到CYFRA21-1的變化對比圖；
[0055]圖5是本發明用于肺癌早中期快速診斷試劑盒在肺癌治療前后血中檢測到HAAH的變化對比圖。
【具體實施方式】
[0056]以下結合附圖和具體實施例對本發明用于肺癌早中期快速診斷試劑盒進行詳細的描述說明。
[0057]用于肺癌早中期快速診斷試劑盒，包括捕獲抗體，捕獲抗體封閉緩沖液，標準品，標記HRP的檢測抗體，洗滌液及顯色液等。所述捕獲抗體包括半乳糖凝集素和細胞角質素片段抗原21-1(CYFRA21-1)分別制得的單克隆抗體；通過對半乳糖凝集素和細胞角質素片段抗原21-1(CYFRA21-1)的共同快速檢測，可以有效的提高檢測準確率和靈敏度，有效的克服單憑檢測CYFRA21-1導致的不足。
[0058]所述捕獲抗體還包括人類天冬胺酰基β —羥化酶(HAAH)制得的單克隆抗體，通過檢測半乳糖凝集素、細胞角質素片段抗原21-1(CYFRA21-1)以及人類天冬胺酰基β —羥化酶(HAAH)，使其靈敏度及準確性均達到90%以上。
[0059]所述捕獲抗體為將半乳糖凝集素、細胞角質素片段抗原21-1 (CYFRA21-1)和人類天冬胺酰基β —羥化酶(HAAH)克隆到真核表達載體，并在哺乳動物細胞中實現蛋白的表達，純化后得到相應的抗原，將所述抗原免疫哺乳動物得到的相應單克隆抗體。
[0060]所述捕獲抗體的制備方法包括的步驟如下:
[0061](I)抗原的制備:通過分子克隆的方法把Galectin-3，HAAH及CYFRA21-1基因克隆到真核表達載體，并在哺乳動物細胞中實現蛋白的表達，純化后得到抗原，此抗原也可作為標準品用；所述抗原的制備也可以使用現有常規方法制備，在此不再累贅。
[0062](2)捕獲抗體的制備:將上述抗原免疫哺乳動物，得到相應的單克隆抗體為捕獲抗體。所述哺乳動物是小鼠及兔子，優選小鼠。所述捕獲抗體的制備也可以使用現有常規方法制備，在此不再累贅。
[0063]所述檢測抗體包括半乳糖凝集素、細胞角質素片段抗原21-1 (CYFRA21-1)和人類天冬胺酰基β —羥化酶(HAAH)分別制得的HRP標記后的多克隆抗體。
[0064]所述檢測抗體為將半乳糖凝集素、細胞角質素片段抗原21-1 (CYFRA21-1)和人類天冬胺酰基β —羥化酶(HAAH)克隆到真核表達載體，并在哺乳動物細胞中實現蛋白的表達，純化后得到相應的抗原，將所述抗原免疫哺乳動物得到的進行HRP標記后的多克隆抗體。所述檢測抗體的制備方法包括的步驟如下:
[0065](I)抗原的制備:通過分子克隆的方法把半乳糖凝集素、細胞角質素片段抗原21-1及人類天冬胺酰基β —羥化酶的基因克隆到真核表達載體，并在哺乳動物細胞中實現蛋白的表達，純化后得到抗原，此抗原也可作為標準品用；
[0066](2)檢測抗體的制備:將上述抗原免疫哺乳動物，得到相應多克隆抗體；
[0067](3) HRP標記:對所述多克隆抗體進行HRP標記。
[0068]所述哺乳動物是小鼠及兔子，優選兔子。對所述多克隆抗體進行HRP標記可以使用目前常規的現有方法。
[0069]其中，所述半乳糖凝集素優選半乳糖凝集素-3或者半乳糖凝集素-8 ;所述細胞角質素片段抗原21_1優選血清細胞角質素片段抗原21_1。
[0070]其中，所述捕獲抗體可以預先包被于PVC材質的微量滴定板的孔內，可以簡化步驟，提高檢測效率。
[0071]用于肺癌早中期快速診斷試劑盒的制備方法，其包括以下步驟:
[0072](I)抗原的制備:通過分子克隆的方法將Galectin-3，HAAH及CYFRA21-1基因克隆到真核表達載體，并在哺乳動物細胞中實現蛋白的表達，純化后得到所需的抗原，其中，所述抗原也可作為標準品用；
[0073](2)捕獲抗體的制備:將上述抗原免疫哺乳動物得到相應的單克隆抗體，所述單克隆抗體作為本試劑盒的捕獲抗體；
[0074](3)檢測抗體的制備:將上述抗原免疫哺乳動物得到相應的多克隆抗體，對所述多克隆抗體進行HRP標記；所述檢測抗體具有標記功能,可以省去標記抗體以及添加標記抗體的操作步驟，有效的節約成本，減少操作步驟，降低檢測誤差。
[0075](4)捕獲抗體包被:
[0076]①.用碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液(pH9.6)將濃度為I μ g/ml的捕獲抗體包被于微量滴定板的孔；
[0077]②.用粘合塑料制品封蓋微量滴定板并在4°C下孵育過夜；
[0078]③.棄去包被液(碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液稀釋的捕獲抗體)，并用洗滌液洗滌微量滴定板兩次，每次在微孔中加入200 μ I PBST (磷酸鹽吐溫緩沖液)，在水槽上方輕輕甩動微量滴定板，除去洗滌液，在紙巾上輕拍微量滴定板，除去剩余的液滴，晾干放于4°C環境中備用；所述洗滌液為PBS (磷酸鹽緩沖液)中加入一定量的TWeen20，所述Tween20的質量百分比濃度為0.05% ；
[0079](5)封閉
[0080]①.在微量滴定板的每孔添加200 μ I封閉緩沖液(為含1.2% BSA (牛血清白蛋白)的PBS (磷酸鹽緩沖液))，用于封閉包被孔中剩余的蛋白質結合位點；
[0081]②.封蓋微量滴定板并在37°C孵育I小時。
[0082]用于肺癌早中期快速診斷試劑盒的檢測方法，其包括以下步驟:
[0083](I)抗原的制備:通過分子克隆的方法將Galectin-3，HAAH及CYFRA21-1基因克隆到真核表達載體，并在哺乳動物細胞中實現蛋白的表達，純化后得到所需的抗原，其中，所述抗原也可作為標準品用；
[0084](2)捕獲抗體的制備:將上述抗原免疫哺乳動物得到相應的單克隆抗體，所述單克隆抗體作為本試劑盒的捕獲抗體；
[0085](3)檢測抗體的制備:將上述抗原免疫哺乳動物得到相應的多克隆抗體，對所述多克隆抗體進行HRP標記；
[0086](4)捕獲抗體包被:
[0087]①.用碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液(pH9.6)將濃度為I μ g/ml的捕獲抗體包被微量滴定板的孔；
[0088]②.用粘合塑料制品封蓋微量滴定板并在4°C下孵育過夜；
[0089]③.棄去包被液(碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液稀釋的捕獲抗體)，并用洗滌液洗滌微量滴定板兩次，每次在微孔中加入200 μ I PBST (磷酸鹽吐溫緩沖液，可以是含0.05%吐溫-20的ρΗ7.4的磷酸鹽緩沖液)，在水槽上方輕輕甩動微量滴定板，除去洗滌液，在紙巾上輕拍微量滴定板，除去剩余的液滴，晾干放于4°C環境中備用；所述洗滌液為PBS (磷酸鹽緩沖液)中加入一定量的Tween20，所述Tween20的質量百分比濃度為0.05% ；
[0090](5)封閉
[0091]①.在微量滴定板的每個孔添加200μ I封閉緩沖液(1.2% BSA/PBS)，封閉包被孔中剩余的蛋白質結合位點；
[0092]②.用粘合塑料制品封蓋微量滴定板并在37°C孵育I小時；
[0093](6)加樣
[0094]①.將100 μ I適當稀釋(稀釋20倍)的樣品添加到微量滴定板的每個孔，在37°C下孵育60分鐘；要得到準確的定量結果，通常做法是比較未知樣品與標準曲線的信號。每個酶標板都必須測定標準品(兩重測定或三重測定)和空白樣，以確保準確性；
[0095]②.棄去樣品，并洗滌微量滴定板三次，每次在微孔中加入200 μ I PBST (磷酸鹽吐溫緩沖液);
[0096]③.將100 μ I濃度為0.5 μ g/ml的檢測抗體添加到每個孔；
[0097]④.用粘合塑料制品封蓋微量滴定板并在37°C下孵育I小時；
[0098]⑤.用PBST洗滌微量滴定板四次；
[0099](7)檢測[0100]①.將TMB(3，3'，5，5'-四甲基聯苯胺)溶液添加到每個孔，孵育15_30分鐘，添加等體積的終止液(2M H2SO4),然后用酶聯免疫檢測儀在450nm處讀取光密度。
[0101]②.由系列稀釋液得到的數據繪制標準曲線，濃度標在X軸(對數標度)上，而吸光度標在Y軸(線性標度)上。通過內插法在此標準曲線上得出樣品濃度。
[0102]本發明用于肺癌早中期快速診斷試劑盒包括半乳糖凝集素-3(Galectin-3)，人類天冬胺酰基羥化酶(HAAH)，CYFRA21-1三項指標中的兩項同時升高作為診斷早中期乳腺癌的標準，檢測原理如圖1所示；半乳糖凝集素-3(Galectin-3)，人類天冬胺酰基β-羥化酶(HAAH)，CYFRA21-1三項指標中的兩項同時下降作為肺癌治療效果評估的標準。可以用于臨床上通過檢測血中3個腫瘤標記物水平的高低對肺癌的治療效果進行動態評估；另外還可以用于臨床上對肺癌的復發轉移及預后判斷的應用。
[0103]試驗效果說明
[0104]雙抗體夾心ELISA最佳實驗條件的選擇
[0105]包被鼠抗人Galectin-3，HAAH及CYFRA21-1單抗最佳工作濃度的選擇:根據方陣法確定包被濃度為lug/mL時,單克隆抗體的OD值為1.03,所以其最佳包被濃度為lug/mL。如圖2所示，兔抗人Galectin-3，HAAH及CYFRA21-1多抗最佳工作濃度的選擇:隨著檢測抗體稀釋倍數的增加，待測肺癌病例血清和正常人血清OD值有遞減的趨勢，當抗體濃度為1:200時，陽性對照(陽性對照OD值減去空白對照OD值)與正常對照(正常對照OD值減去空白對照OD值)A450nm之比(簡稱P / N值)較高，故選擇兔抗人抗體最佳工作濃度為1:200。血清摸索的最佳工作濃度為1:25。封閉液摸索最佳工作溶度為1.2% BSA。
[0106]臨床血清標本檢測
[0107]共檢測了 400份血`清標本，以醫院經確診為肺癌1-1I期患者血清為陽性對照組(110例)，其他良性病患者和正常人群血清為陰性對照組(290例(正常170例，良性病120例))，PBST為空白對照，通過上述雙抗夾心ELISA法進行定性及定量檢測臨床血清標本。如下表所示:
【權利要求】
1.用于肺癌早中期快速診斷試劑盒，包括捕獲抗體，其特征在于，所述捕獲抗體包括半乳糖凝集素和細胞角質素片段抗原21-1分別制得的單克隆抗體。
2.根據權利要求1所述的用于肺癌早中期快速診斷試劑盒，其特征在于，所述捕獲抗體還包括人類天冬胺酰基β —羥化酶制得的單克隆抗體。
3.根據權利要求2所述的用于肺癌早中期快速診斷試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括檢測抗體，所述檢測抗體包括半乳糖凝集素、細胞角質素片段抗原21-1和人類天冬胺酰基β —羥化酶分別制得的HRP標記后的多克隆抗體。
4.根據權利要求3所述的用于肺癌早中期快速診斷試劑盒，其特征在于，所述捕獲抗體的制備方法包括的步驟如下: (1)抗原的制備:把半乳糖凝集素、細胞角質素片段抗原21-1及人類天冬胺酰基β-羥化酶的基因克隆到真核表達載體，并在哺乳動物細胞中實現蛋白的表達，純化后得到抗原； (2)捕獲抗體的制備:將上述抗原免疫哺乳動物，得到相應的單克隆抗體為捕獲抗體。
5.根據權利要求3所述的用于肺癌早中期快速診斷試劑盒，其特征在于，所述檢測抗體的制備方法包括的步驟如下: (1)抗原的制備:把半乳糖凝集素、細胞角質素片段抗原21-1及人類天冬胺酰基β-羥化酶的基因克隆到真核表達載體，并在哺乳動物細胞中實現蛋白的表達，純化后得到抗原； (2)檢測抗體的制備:將上述抗原免疫哺乳動物，得到相應的多克隆抗體為檢測抗體；` (3)HRP標記:對所述多克隆抗體進行HRP標記。
6.根據權利要求1-5任一所述的用于肺癌早中期快速診斷試劑盒，其特征在于，所述半乳糖凝集素是半乳糖凝集素_3。
7.根據權利要求6所述的用于肺癌早中期快速診斷試劑盒，其特征在于，所述捕獲抗體預先包被于微量滴定板的孔內。
8.根據權利要求6所述的用于肺癌早中期快速診斷試劑盒的制備方法，其特征于，其包括以下步驟: (1)抗原的制備:將半乳糖凝集素、細胞角質素片段抗原21-1及人類天冬胺酰基β-羥化酶的基因克隆到真核表達載體，并在哺乳動物細胞中實現蛋白的表達，純化后得到所需的抗原； (2)捕獲抗體的制備:將上述抗原免疫哺乳動物得到相應的單克隆抗體； (3)檢測抗體的制備:將上述抗原免疫哺乳動物得到相應的多克隆抗體，對所述多克隆抗體進行HRP標記； (4)捕獲抗體包被: ①.用碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液將濃度為I μ g/ml的捕獲抗體包被微量滴定板的孔；②.封蓋微量滴定板并在4°C下孵育過夜；③.棄去包被液，并用洗滌液洗滌微量滴定板兩次，每次在微孔中加入200 μ I PBST，除去洗滌液和剩余的液滴，晾干放于4°C環境中； (5)封閉:每孔添加200μ I封閉緩沖液，封閉包被孔中剩余的蛋白質結合位點。
9.根據權利要求6所述的用于肺癌早中期快速診斷試劑盒的檢測方法，其特征于，包括以下步驟:(1)抗原的制備:將半乳糖凝集素、細胞角質素片段抗原21-1及人類天冬胺酰基β-羥化酶的基因克隆到真核表達載體，并在哺乳動物細胞中實現蛋白的表達，純化后得到所需的抗原； (2)捕獲抗體的制備:將上述抗原免疫哺乳動物得到相應的單克隆抗體； (3)檢測抗體的制備:將上述抗原免疫哺乳動物得到相應的多克隆抗體，對所述多克隆抗體進行HRP標記； (4)捕獲抗體包被: ①.用碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液將濃度為Iμ g/ml的捕獲抗體包被微量滴定板的孔； ②.封蓋微量滴定板并在4°C下孵育過夜； ③.棄去包被液，并用洗滌液洗滌微量滴定板兩次，每次在微孔中加入200μ I PBST,除去洗滌液和剩余的液滴，晾干放于4°C環境中； (5 )封閉 ①.在微量滴定板的每個孔添加200μI封閉緩沖液，封閉包被孔中剩余的蛋白質結合位點； ②.封蓋微量滴定板并在37°C孵育I小時； (6)加樣 ①.將100μ I的樣品添加到微量滴定板的每個孔，在37°C下孵育60分鐘； ②.棄去樣品，并洗滌微量滴定板`三次，每次在微孔中加入200μ I PBST ； ③.將100μ I濃度為0.5 μ g/ml的檢測抗體添加到每個孔； ④.封蓋微量滴定板并在37°C下孵育I小時； ⑤.用PBST洗滌微量滴定板四次； (7)檢測 ①.將TMB溶液添加到每個孔，孵育15-30分鐘，添加等體積的終止液，然后在450nm處讀取光密度。
【文檔編號】G01N33/577GK103823066SQ201410093875
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年3月13日 優先權日:2014年3月13日
【發明者】余躍飛 申請人:廣州恒泰生物科技有限公司
專業數控銑床產品供應商
20年生產經驗，實力工廠，精工品質，質量有保障
