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一種采用鄰位連接技術檢測降鈣素原的方法
【專利摘要】本發明提出了一種利用高靈敏度的蛋白質檢測技術---鄰位連接技術（proximityligationassay,PLA）檢測臨床系統性感染及炎癥損傷指標降鈣素原（procalcitonin,PCT）含量的新方法。它將復雜的蛋白檢測轉換成對DNA的檢測，并通過實時熒光定量PCR的方法將信號放大，可以檢測在體內低表達的降鈣素原。實驗結果表明,采用鄰位連接技術檢測降鈣素原比傳統的檢測方法靈敏度高，特異性強,操作簡單易行，且成本低，能夠檢測到較低濃度的降鈣素原，對于臨床檢測有重要作用。
【專利說明】一種采用鄰位連接技術檢測降鈣素原的方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物醫學與分子免疫學領域，涉及一種降鈣素原的檢測技術。

【背景技術】
[0002] 近年來，臨床上發現一種對全身性感染及其并發癥的有效監測的新指標，它能夠 有效地反映感染導致的炎癥損傷程度---降鈣素原（PCT)，當病人受到細菌、真菌、寄生蟲 嚴重感染、產生膿毒癥或多臟器功能衰竭時，降鈣素原在血漿中的含量顯著高。PCT是激素 降鈣素，它是由116個氨基酸組成的糖蛋白，是降鈣素（calcitonin，CT)的前體。PCT是由 濾泡旁細胞甲狀腺（C細胞）以及和腸的神經內分泌細胞產生的，正常健康人體內PCT水平 很低（〈0.05 ng/mL),當血清中PCT含量高于2 ng/mL時，出現敗血癥的風險較高。當發 生全身性炎癥或細菌感染2至4小時內，PCT的水平會急驟升高，可提升高達5000倍，且在 幾小時內維持高水平，對全身以及局部的細菌性感染的鑒別十分有利。降鈣素原（PCT)是 一個具高靈敏度、高特異性的新指標，還能在早期鑒別細菌與非細菌感染，現有的數據也顯 示，PCT水平的上調很少受病毒感染的影響，但可以作為血癥的預警和診斷指標，且PCT在 血清中的含量高低與細菌感染的嚴重程度成正相關。監測PCT水平可以對炎癥性疾病、膿 毒血癥、急性胰腺炎等全身或多種局部炎癥進行診斷，是目前最敏感和最特異的診斷指標。 所以PCT的低成本、高靈敏度、快速便捷的檢測方法在臨床上具有十分重要的意義。另外， PCT水平是有關的抗生素治療的起始或終止的重要依據。但是目前市場常見的PCT檢測方 法，有些是板式或管式固定包被抗原或抗體，有一定的局限性，不利于免疫反應的進行；多 數利用熒光物質標記抗體，發光物質穩定性差，發光效率低、時間短；有些會造成環境污染； 有些操作復雜、較難保證結果的重復性；有些檢測靈敏度低，且成本上也不具有優勢。
[0003] 鄰位連接技術（proximity ligation assay, PLA)是一項高靈敏度的蛋白質分析 技術。此方法利用一對帶有化學基團修飾的單鏈DNA與修飾后的蛋白識別因子偶聯，與抗 原共孵育，特異性地進行抗原抗體反應，然后通過連接酶的作用以及連接探針的輔助將核 酸序列連接起來,并加入引物、Taqman探針和Taq酶的反應溶液，進行實時PCR，最后通過檢 測熒光信號便可知道被測蛋白是否存在及含量多少。這種方法能夠將對蛋白的復雜檢測轉 化為對DNA的檢測。憑借其檢測靈敏度高、檢測特異性強、樣品損耗低、操作簡單、檢測設備 常見等優勢，在蛋白質含量檢測、研究蛋白質間相互作用、DNA與蛋白質間相互作用等許多 蛋白質組學相關領域已經取得了很好的研究成果。目前，鄰位連接技術主要有液相、固相及 細胞原位3種反應形式，可用于體外及體內實驗或檢測。


【發明內容】

[0004] 本發明所解決的技術問題是：本發明采用科技前沿的新型蛋白檢測技術檢測臨床 系統性感染及炎癥損傷指標降I丐素原（procalcitonin, PCT)含量，可以用于臨床疾病的診 斷、診斷試劑盒的研發，以及醫學和生物研究等眾多領域。
[0005] 為了解決上述技術問題，本發明所采用的技術方案是：采用一種鄰位連接技術來 檢測降鈣素原的方法，其具體步驟為： (1) 合成鄰位連接技術所需要的偶聯DNA--Arml和Arm2,其核苷酸序列分別為：SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3;連接反應所用連接DNA片段，其核苷酸序列為：SEQ ID N0:7;實 時熒光定量反應所需擴增引物及引物探針，其核苷酸序列分別為：SEQ ID N0:4、SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6 ； (2) 取含有降鈣素原多克隆抗體的樣本與DBCO試劑進行反應，使降鈣素原多克隆抗體 的肽鏈N端添加 NHS基團；反應完成后，加入Tris-HCl以終止上述反應； (3) 將修飾有NHS基團的降鈣素原多克隆抗體分成兩份，分別與5'端修飾有疊氮基 團的單鏈DNA片段Arml，即SEQ ID NO :2和3'端修飾有疊氮基團的單鏈DNA片段Arm2即 SEQ ID NO :3進行孵育，使兩份降鈣素原多克隆抗體分別偶聯其中一種單鏈DNA片段，構 成Arml-多抗和Arm2_多抗； (4) 取降鈣素原多克隆抗體加入磁珠中進行偶聯，之后加入降鈣素蛋白作為抗原進行 抗原抗體特異性結合，使抗原-抗體-磁珠偶聯在一起以起到固定抗原的作用； (5) 取步驟（3)中制備好的Arml-多抗和Arm2-多抗加入上述抗原抗體反應溶液中， 旋轉孵育后，使用該反應溶液為模版，加入連接試劑、連接DNA片段，S卩：SEQ ID NO:7以及 實時熒光定量PCR擴增試劑，在連接酶作用下使得Arml-多抗和Arm2-多抗上的D N A尾 部游離的5 '端和3 '端與連接DNA片段的互補序列雜交，形成一個環狀的蛋白質-單鏈 DNA復合物，采用實時熒光定量P C R擴增復合物中的單鏈DNA部分進行檢測，其中 實時熒光定量PCR反應所用上游引物為SEQ ID NO :4,下游引物為：SEQ ID NO 5,引物探針 為 SEQ ID NO : 6。
[0006] 優選的，上述的采用鄰位連接技術檢測降鈣素原的方法中，步驟（4)中加入不同濃 度的降鈣素蛋白抗原進行抗原抗體特異性結合過程中，所加的不同濃度的降鈣素蛋白分別 為 0ng/mL、0. 005ng/mL、0. 05ng/mL、0. 5ng/mL、5ng/mL、20ng/mL、100ng/mL、500ng/mL〇
[0007] 優選的，上述的采用鄰位連接技術檢測降鈣素原的方法，其步驟（4)中加入不同濃 度的降|丐素抗原濃度分別0ng/mL、lng/mL、100ng/mL，且各自加入10%血清混勻，模擬不同 PCT含量的實際樣本，用以驗證血清對該檢測方法的影響。
[0008] 本發明的有益效果是：利用高靈敏度的蛋白質檢測技術一鄰位連接技術 (proximity ligation assay, PLA)檢測臨床系統性感染及炎癥損傷指標降|丐素原 (procalcitonin，PCT)含量，該方法利用一對帶有化學基團修飾的單鏈DNA與修飾有NHS 基團的降鈣素原多克隆抗體偶聯，與抗原共孵育，特異性地進行抗原抗體反應，然后通過連 接酶的作用以及連接DNA片段的輔助將核酸序列連接起來，并加入相應的引物、引物探針， 進行實時熒光定量PCR，最后通過檢測熒光信號便可知被測降鈣素原是否存在及含量多少。 這種方法能夠將對蛋白的復雜檢測轉化為對DNA的檢測，且能夠檢測到較低濃度的PCT，靈 敏度較高。本發明可將科技前沿的新型蛋白檢測技術與一些臨床指標相結合，可以應用于 醫學和生物學等眾多領域。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0009] 圖1是鄰位連接技術檢測降鈣素原流程的模式圖； 圖2是純化獲得的降鈣素原蛋白的SDS-PAGE的電泳圖； 圖3A是針對PCT蛋白的多克隆抗體的SDS-PAGE的電泳圖；圖3B是采用PCT蛋白的多 克隆抗體檢測不同濃度的PCT蛋白（3μ g，2. 25μ g，l. 5μ g，0. 75μ g)的Western Blot的 膠片圖； 圖4是檢測Arml和Arm2是否偶聯到PCT蛋白的多克隆抗體上的銀染圖； 圖5 A是應用PLA方法檢測不同濃度的降鈣素原PCT (0ng/mL、0. 005ng/mL、0. 05ng/ 111]^、0.51^/1]1]^、51^/1]1]^、2〇1^/1]1]^、10〇1^/1]1]^、50〇1^/1]11^)的散點圖；圖513是檢測10%血清中不 同濃度的降鈣素原PCT的散點圖。

【具體實施方式】
[0010] 下面將結合說明書附圖，對本發明作進一步的說明。
[0011] 本發明首先請生物公司構建PCT蛋白的原核表達載體質粒--pET32PCT，轉化大腸 桿菌構建表達菌株，利用該菌株誘導表達PCT蛋白，多點注射免疫綿羊，制備抗PCT蛋白的 羊多抗。合成鄰位連接技術（PLA)所需要的偶聯DNA、連接DNA、擴增引物及檢測引物探針， 首先將上述制備的抗體偶聯在磁珠（Dynabeads?M_270 Epoxy)上，并孵育抗原，以捕獲抗 體、固定抗原。通過化學鍵將抗體與單鏈DNA偶聯，用于識別抗原、檢測抗原。再加入PCR 擴增所需的反應體系和引物，以及帶熒光標記的檢測引物，將蛋白的信號轉換成DNA的信 號后級聯放大。
[0012] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。
[0013] 實施例1 :構建PCT蛋白原核表達載體及其表達、純化： (1)通過生物公司合成得到PCT基因片段，并將其連接于載體PET32中，得到原核表達 質粒pET32PGT，其中 PCT基因片段的DNA序列為 SEQ ID N01: 5'-GCA CCA TTC CGT TCT GCC CTG GAG AGC TCT CCA GCA GAT CCG GCA ACA CTG AGT GAA GAC GAA GCG CTT CTG CTG GCT GCA CTG GTG CAG GAC TAT GTG CAG ATG AAG GCC AGT GAG CTG GAG CAG GAG CAA GAG CGT GAG GGT TCC AGC CTG GAT AGC CCA CGT TCT AAG CGT TGC GGT MT CTG AGT ACC TGC ATG CTG GGC ACC TAC ACG CAG GAC TTC AAC AAG TTC CAC ACG TTC CCA CAA ACT GCA ATC GGT GTT GGT GCA CCT GGT AAG AAG CGT ATG TCC AGC GAC CTG GAG CGT GAC CAT CGC CCT CAT GTT AGC ATG CCA CAG AAT GCC AAC-3' ；（2)將重組質粒通過化學轉化法轉化到BL21菌 株中，置37°C細菌培養箱培養12小時左右。挑取單克隆接種于5mL的LA培養基中37°C 220rpm振蕩過夜培養；（3)接種lmL過夜菌種至300mL LA培養基中進行擴大培養，待0D_ 值達到0. 6-0. 8 (對數期）時加入IPTG誘導劑，終濃度為0. lmM，30°C，誘導4小時；（5)4°C 8000rpm離心15分鐘，收集菌液，；（6)棄上清，用IDA0完全重懸；（7)用高壓均質機將細 胞破碎，釋放蛋白；（8)將蛋白液轉移到50mL離心管中，4°C 8000rpm離心15min ;(9)將蛋 白液轉移到新的50mL離心管中，用鎳柱親和層析純化蛋白，加 lmL Ni2+-IDA珠子，4°C使蛋 白與珠子結合1小時；（10)為獲得高純度的蛋白，采用咪唑梯度洗脫法，低濃度咪唑洗脫液 (20mM，50mM)用于洗去雜帶，高濃度咪唑洗脫液（100mM，250mM，500mM)將蛋白洗脫下來，最 終得到純度為90%的降鈣素原蛋白。圖2是純化獲得的降鈣素原蛋白的SDS-PAGE的電泳 圖。
[0014] 實施例2 : PCT蛋白多克隆抗體制備及其效價測定： (1)選擇健康沒有免疫過的2. 5kg左右的綿羊，將上述方法制備的lmg PCT抗原與相 同體積的弗氏完全佐劑混勻并研磨后，通過皮下多點注射的方法對綿羊進行免疫；（2)初 次免疫3周后，再次取lmg PCT抗原與相同體積的弗氏不完全佐劑混勻，皮下多點注射；（3) 以后每兩周加強免疫一次，共免疫6次。（4)免疫蛋白總量共9mg ; (4)最后一次免疫后五 天進行動脈取血交由生物公司提取純化獲得PCT蛋白的多克隆抗體，圖3A是針對PCT蛋 白的多克隆抗體的SDS-PAGE的電泳圖。用瓊脂糖雙擴法檢測PCT的多克隆抗體的效價為 1:16-1:32。（ 5)得到公司提供的PCT蛋白的多克隆抗體后，進行SDS-PAGE電泳檢測(如 圖3A)。（6)驗證制備的PCT蛋白的多克隆抗體是否能夠特異性的檢測到PCT蛋白，進行 Western Blot實驗，實驗結果如圖3B所示。
[0015] 實施例3:合成PCT寡核苷酸鏈偶聯抗體： (1)合成鄰位連接技術（PLA)所需要的偶聯DNA (Arml、Arm2)、連接DNA、擴增 引物及引物探針，取10 μ L 2 μ g/ μ L的PCT多克隆抗體，加入1 μ L 4mM的DBC0 (Dibenzylcyclooctyne)室溫反應30分鐘，使其N端添加 NHS基團；（2)加入1 μ L 1M Tris-HCl室溫孵育5分鐘以終止上述反應；（3)將修飾有NHS基團的PCT多克隆抗體分成兩 份，分別與5'端修飾有疊氮基團的單鏈DNA片段Arml，即SEQ ID N0 :2: 5' -CGC ATC GCC CTT GGA CTA CGA CTG ACG AAC CGC TTT GCC TGA CTG ATC GCT AAA TCG TG-3,和 3,端 修飾有疊氮基團的單鏈 DNA 片段 Arm2 即 SEQ ID N03: 5'-TCG TGT CTA AAG TCC GTT ACC TTG ATT CCC CTA ACC CTC TTG AAA AAT TCG GCA TCG GTG A-3'，4°C孵育過夜，使 PCT 多 克隆抗體分別偶聯其中一種單鏈DNA，并將其用PBS各自稀釋至25 nM。（4)進行銀染實驗， 檢測PCT蛋白的多克隆抗體是否偶聯有DNA片段，如果偶聯成功那么表現為在大小上有一 個遷移。
[0016] 實施例4 :應用鄰位連接技術檢測PCT蛋白含量 (1)取lyL 2mg/mL PCT多克隆抗體加入磁珠中，37°C旋轉過夜，使其與磁珠偶聯；（3) 次日，加入不同濃度的 PCT 蛋白（0ng/mL、0. 005ng/mL、0. 05ng/mL、0. 5ng/mL、5ng/mL、20ng/ mL、100ng/mL、500ng/mL)，進行抗原抗體特異性結合，使抗原-抗體-磁珠偶聯在一起以起 到固定抗原的作用；（4)取實施例3中制備的Arml-多抗和Arm2-多抗2 μ L加入上述抗 原抗體反應溶液中，室溫旋轉孵育90min后，取5yL加入45yL PCR mix溶液中（ΙΟμΜ上 游引物 SEQ ID Ν04: 5' -CAT CGC CCT TGG ACT ACG Α-3' ；10μΜ 下游引物 SEQ ID NO 5 : 5' -GGG AAT CAA GGT AAC GGA CTT TAG-3' ； 10 μ M 引物探針 SEQ ID NO 6 :5, -FAM-TGA CGA ACC GCT TTG CCT GA-3,；連接 DNA 片段，即 SEQ ID NO 7 : 5' -TAC TTA GAC ACG ACA CGA TTT AGT TT-3,,0. 08mM ATP, 0. 002U/μ L UNG,0. 01U/yL T4 ligase, 0. 03U/μ L Taq polymerase);在連接酶作用下使得Arml-多抗和Arm2-多抗上的D N A尾部的游離5'端 和3'端與連接DNA片段的互補序列雜交，形成一個環狀的蛋白質-單鏈D N A復合物，（6) 采用ABI PRISM 7700 PCR儀對復合物中的單鏈DNA部分進行實時熒光定量PC R擴增 檢測。（6)分析結果顯示，檢測靈敏度低于0. 5 ng/mL，檢測底線約為0. Ing/mL。
[0017] 實施例5 :添加10%的人血清模擬體內檢測環境驗證10%人血清是否會干擾PCT 蛋白的PLA檢測 (1)于不同濃度的PCT抗原（0ng/mL、lng/mL、100ng/mL)中加入10%血清混勻，模擬不 同PCT含量的實際樣本；（2)具體檢測過程與實施例4 一致；（3)人為加入10%血清，模擬 體內檢測環境，結果發現，這并不影響PLA方法對于降鈣素原的檢測，能夠檢測到不同濃度 的PCT，靈敏度和特異性與實驗一致。
[0018] 以上顯示和描述了本發明的基本原理和主要特征和本發明的優點。本行業的技術 人員應該了解，本發明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本 發明的原理，在不脫離本發明精神和范圍的前提下，本發明還會有各種變化和改進，這些變 化和改進都落入要求保護的本發明范圍內。本發明要求保護范圍由所附的權利要求書及其 等效物界定。
【權利要求】
1. 一種采用鄰位連接技術檢測降鈣素原的方法，其特征在于：該方法包括以下步驟： (1) 合成鄰位連接技術所需要的偶聯DNA--Arml和Arm2,其核苷酸序列分別為：SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3;連接反應所用連接DNA片段，其核苷酸序列為：SEQ ID N0:7;實 時熒光定量反應所需擴增引物及引物探針，其核苷酸序列分別為：SEQ ID N0:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6 ; (2) 取含有降鈣素原多克隆抗體的樣本與DBCO試劑進行反應，使降鈣素原多克隆抗體 的肽鏈N端添加 NHS基團；反應完成后，加入Tris-HCl以終止上述反應； (3) 將修飾有NHS基團的降鈣素原多克隆抗體分成兩份，分別與5'端修飾有疊氮基 團的單鏈DNA片段Arml，即SEQ ID NO :2和3'端修飾有疊氮基團的單鏈DNA片段Arm2即 SEQ ID NO :3進行孵育，使兩份降鈣素原多克隆抗體分別偶聯其中一種單鏈DNA片段，構 成Arml-多抗和Arm2_多抗； (4) 取降鈣素原多克隆抗體加入磁珠中進行偶聯，之后加入降鈣素原作為抗原進行抗 原抗體特異性結合，使抗原-抗體-磁珠偶聯在一起以起到固定抗原的作用； (5) 取步驟（3)中制備好的Arml-多抗和Arm2-多抗加入上述抗原抗體反應溶液中， 旋轉孵育后，以此反應溶液為模版，加入連接試劑、連接DNA片段，S卩：SEQ ID N0:7以及實 時熒光定量PCR擴增試劑，在連接酶作用下使得Arml-多抗和Arm2-多抗上的D N A尾部 游離的5'端和3'端與連接DNA片段的互補序列雜交，形成一個環狀的蛋白質-單鏈D N A 復合物，采用實時熒光定量P C R擴增復合物中的單鏈DNA部分進行檢測，其中實時熒 光定量PCR反應所用上游引物為SEQ ID N0:4,下游引物為：SEQ ID NO 5,引物探針為SEQ ID NO : 6。
2. 根據權利要求1所述的一種采用鄰位連接技術檢測降鈣素原的方法，其特征在 于：步驟（4)中取降鈣素原多克隆抗體加入磁珠中進行偶聯，之后加入不同濃度的降鈣素 蛋白抗原進行抗原抗體特異性結合，其中所加的不同濃度的降鈣素蛋白分別為Ong/mL、 0· 005ng/mL、0. 05ng/mL、0. 5ng/mL、5ng/mL、20ng/mL、100ng/mL、500ng/mL〇
3. 根據權利要求1所述的一種采用鄰位連接技術檢測降鈣素原的方法，其特征在于： 步驟（4)中加入不同濃度的降|丐素抗原濃度分別0ng/mL、lng/mL、100ng/mL，且各自加入 10%血清混勻，模擬不同PCT含量的實際樣本，用以驗證血清對該檢測方法的影響。
【文檔編號】G01N33/68GK104267196SQ201410550348
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年10月16日 優先權日:2014年10月16日
【發明者】萬亞坤, 母亞雯, 謝浩 申請人:東南大學