一種腫瘤標志物的制作方法【專利摘要】本發明一方面提供了一種確定受試者是否患有癌癥或者具有罹患癌癥風險的方法，包括檢測該受試者的血液樣本中Hsp90α的濃度，如果該濃度達到或超過預先設定的閾值，則判定該受試者患有癌癥或者具有罹患癌癥的風險，其中所述閾值選自50ng/ml到120ng/ml的范圍內，例如所述閾值可以為50、53、56、62、63、64、67、72、82、85或117ng/ml，且所述閾值±15％范圍內的數值均被視為具有等同判定意義。【專利說明】一種腫瘤標志物【
技術領域：
】[0001]本發明涉及肺癌、肝癌、結直腸癌、乳腺癌等16種腫瘤的診斷、病情監測和療效評價等。更具體地說，本發明涉及通過熱休克蛋白90α定量檢測輔助診斷肺癌、肝癌、結直腸癌、乳腺癌等腫瘤和進行病情監測和療效評價的方法。【
背景技術：
】[0002]熱休克蛋白90a(HSp90a)是一個含量豐富的細胞內伴侶蛋白。近年來研究顯示，Hsp90a可以被癌細胞特異性的分泌到細胞外，且與癌癥的發生和發展密切相關。本研究組已發現，分泌到胞外的Hsp90a可以在外周血中很方便的被定量檢測，其含量與腫瘤的負荷和惡性程度呈現一定的相關性，但并沒有任何數據能夠指導該項指標在腫瘤臨床中的應用。因此，如何將分泌型Hsp90a應用于腫瘤臨床實踐是亟待解決的問題。【
發明內容】[0003]本發明一方面提供了一種確定受試者是否患有癌癥或者具有罹患癌癥風險的方法，包括檢測該受試者的血液樣本中Hsp90a的濃度，如果該濃度達到或超過預先設定的閾值，則判定該受試者患有癌癥或者具有罹患癌癥的風險，其中所述閾值選自50ng/ml到120ng/ml的范圍內，例如所述閾值可以為50、53、56、62、63、64、67、72、82、85或117ng/ml，且所述閾值±15%范圍內的數值均被視為具有等同判定意義。[0004]本領域技術人員可以理解，由于檢測方法的局限性，要做到濃度測定結果完全準確是相當困難的。根據本領域的慣常做法，上下偏差15%以內可以被認為是合理誤差。例如當所述閾值選定為50ng/ml時，如果受試者的測量值為43ng/ml，也可以判定該受試者患有癌癥，或者具有較商的摧患癌癥的風險。[0005]在本發明中，所述血液樣本可以為血漿或血清樣本。在本發明的優選實施方案中，血漿樣本是優選的，其測量精度更高。[0006]所述Hsp90a的閾值可以為50、53、56、62、63、64、67、72、82、85或117叩/1111。例如，在本發明一個具體實施方案中，針對肺癌的特別優選的閾值是67.47ng/ml(可以四舍五入取67ng/ml)，此時對應的特異度為85%，靈敏度為64%。在上述閾值±15%的范圍內的數值均可視為等同的判定范圍。[0007]在本發明一個具體實施方案中，針對肺癌的一個優選的閾值是82ng/ml，即Hsp90a的濃度為〇-82ng/ml時被認為是正常值范圍；在本發明一個優選實施方案中，針對肺癌的一個特別優選的閾值是53ng/ml，即Hsp90a的濃度為〇-53ng/ml時被認為是正常值范圍。同樣的，在上述閾值±15%的范圍內的數值均可視為具有等同判定意義。所述血液樣本優選為血漿樣本。[0008]本發明另一方面提供了一種用于對正在接受治療的癌癥患者進行病情監測和/或療效評價或者用于對候選治療藥物進行療效評價的方法，包括在治療前及治療后分別檢測受試者的血液樣本中Hsp90a的濃度，如果治療后Hsp90a的濃度相對于治療前Hsp90a濃度增加的百分比達到或超過預先設定的閾值，則判定該受試者病情進展和/或療效較差，或者判定所述候選治療藥物療效較差，其中所述閾值選自10%到50%的范圍內，例如所述閾值可以為34%，且所述閾值±15%范圍內的數值均被視為具有等同判定意義；優選地,所述血液樣本為血漿樣本。[0009]此處所用的術語"治療"應當做廣義的理解。例如，在對肺癌患者進行治療時，可能涉及多個治療周期，例如總共8個治療周期。如果將整個治療過程作為一個整體來看，可以在第1個治療周期開始前和第8個治療周期結束后，分別對Hsp90α的濃度進行檢測，并據此判斷整個治療過程的效果。或者，也可以將每個治療周期視為一次"治療"（例如出于獲得更精確評估結果的目的）。例如，可以在每個治療周期開始前和結束后，均對Hsp90α的濃度進行檢測，并據此判斷單個治療周期的效果。或者，還可以進行更精確的評估。例如，在單個治療周期包括總共20天治療的情況下，可以將每一天視為一次"治療"，在當天的治療開始前和當天的治療結束后，分別對Hsp90α的濃度進行檢測，從而判斷當天的治療效果。本領域技術人員可以根據不同的評估要求，具體設定"治療"的時間跨度。[0010]本發明還提供了確定受試者是否患有癌癥或者具有罹患癌癥風險的方法，包括聯合檢測該受試者的血液樣本中Hsp90a的濃度以及至少一種其他腫瘤標志物的濃度，如果Hsp90a的濃度和所述至少一種其他腫瘤標志物的濃度達到或超過預先設定的閾值，則判定該受試者患有癌癥或者具有罹患癌癥的風險，其中Hsp90a的閾值選自50ng/ml到120ng/ml的范圍內，例如所述閾值可以為50、53、56、62、63、64、67、72、82、85或117ng/ml，且所述閾值±15%范圍內的數值均被視為具有等同判定意義。所述血液樣本優選為血漿樣本，所述至少一種其他腫瘤標志物優選選自由癌胚抗原（CEA)、細胞角蛋白19片段抗原21-1(CYFRA21-1)、AFP、CA19-9、CA125、CA15-3、PSA和CA72-4構成的組。[0011]根據本發明的優選實施方案，本發明方法中Hsp90a的濃度優選地采用EDTA-K2作為抗凝劑進行檢測。[0012]本發明的方法適用的癌癥種類包括：肺癌、肝癌、結直腸癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、淋巴瘤、食管癌、黑色素瘤、腎癌、子宮癌、鼻咽癌、骨肉瘤、膀胱癌和前列腺癌。[0013]本發明還提供了用于確定受試者是否患有癌癥或者具有罹患癌癥風險的試劑盒，包括：任選的人分泌型Hsp90a、人分泌型Hsp90a單克隆抗體、檢測試劑以及說明書，其中所述說明書中標明了健康人血液樣本中Hsp90a濃度的閾值，如果受試者的血液樣本中Hsp90a的濃度達到或超過所述閾值，則判定該受試者患有癌癥或者具有罹患癌癥的風險，其中所述閾值選自50叫/1111到1201^/1111的范圍，例如所述閾值可以為50、53、56、62、63、64、67、72、82、85或117叩/1111，且所述閾值±15%范圍內的數值均被視為具有等同判定意義；優選地,所述血液樣本為血漿樣本。[0014]此處所用的術語"任選的"表示可以有，也可以沒有。例如，"任選的人分泌型Hsp90a"，是指本發明的試劑盒可以包括人分泌型Hsp90a，也可以不包括人分泌型Hsp90a。例如，可以將人分泌型Hsp90a單獨包裝，并與試劑盒的主體部分聯合使用。優選地，出于方便使用的目的，本發明的試劑盒中包括人分泌型Hsp90a，用作檢測時的標準品。特別優選的是重組人分泌型Hsp90a。[0015]根據本發明的優選實施方式，所述試劑盒中可以包括用于采集血液樣本的容器，并且該容器中包含EDTA-K2。在本發明的優選實施方案中，所述用于采集血液樣本的容器為包含EDTA-K2的采血管。[0016]根據在本發明的具體實施方案，Hsp90α的濃度采用EDTA-K2作為抗凝劑進行檢測是優選的。[0017]本發明的試劑盒適用的癌癥種類包括：肺癌、肝癌、結直腸癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、淋巴瘤、食管癌、黑色素瘤、腎癌、子宮癌、鼻咽癌、骨肉瘤、膀胱癌和前列腺癌。[0018]本發明的實施例中還將Hsp90a定量檢測在癌癥輔助診斷和療效監測中的有效性研究方法應用于多種癌癥，發現Hsp90a濃度在癌癥診斷中的閾值范圍對肺癌、肝癌、結直腸癌和乳腺癌等同樣適用，并提供了腫瘤標志物Hsp90a定量檢測用于肺癌、肝癌、結直腸癌和乳腺癌診斷的具體統計學參數。[0019]本發明的實施例中根據不同人群的數據繪制相應的R0C曲線。根據本領域公知技術，每一條R0C曲線都提供了一系列閾值及與之相對應的靈敏度和特異度。因此，使用這些R0C曲線，本領域技術人員能很容易地查出選取任意閾值（即cut-off值）時該項檢測對疾病的識別能力，即診斷相應癌種的靈敏度、特異度和符合率。例如：[0020]當適應癥為肝癌時，患者相對于健康人的cut-off值是52.79ng/ml時，靈敏度、特異度和符合率分別是93.7%，85%和94.5%，當cut-off值是62.20ng/ml時，靈敏度、特異度和符合率分別是91.4%，90%和92.2%;患者相對于非癌癥肝部相關疾病的cut-off值是63.66ng/ml時，靈敏度、特異度和符合率分別是90.7%，90%和90.3%，當cut-off值是85.24ng/ml時，靈敏度、特異度和符合率分別是80.7%，95%和88.6%。[0021]當適應癥是結直腸癌時，患者相對于健康人及非癌癥結直腸相關疾病組的cut-off值是52.79ng/ml時，靈敏度、特異度和符合率分別是89.9%，85%和87%，當cut-off值是62.20ng/ml時，靈敏度、特異度和符合率分別是83.4%，90%和87%。[0022]當適應癥為乳腺癌時，患者相對于健康人的cut-off值是52.66ng/ml時，靈敏度、特異度和符合率分別是65.6%，85%和73.85%，當cut-off值是61.92ng/ml時，靈敏度、特異度和符合率分別是54.6%，90%和69.68%;患者相對于非癌癥乳腺相關疾病組的cut-off值是63.4lng/ml時，靈敏度、特異度和符合率分別是52.4%，84.9%和68.29%，當cut-off值是72.21ng/ml時，靈敏度、特異度和符合率分別是41.9%，90.1%和65.41%。[0023]本領域技術人員可以理解，由于受試人群和瘤種的不同，cut-off值的選取及其對應的靈敏度、特異度和符合率等參數會有所差別，但均包含在本發明限定的閾值范圍內。本領域技術人員可以根據實際使用需求，如對特定瘤種、靈敏度、特異度等的要求，從本發明公開的R0C曲線或閾值范圍內選取適當的優選閾值。[0024]本發明還驗證了肺癌、肝癌、結直腸癌、乳腺癌患者手術后血漿Hsp90a含量比手術前顯著降低，因此該項檢測指標可以作為手術治療效果評價的手段。同時，臨床獲益的(CR+PR+SD)接受內科治療的患者，在治療后的檢測值顯著低于治療前，說明該項指標可以用于上述癌癥的內科治療療效評價。[0025]本發明的實施例中檢測了胃癌、胰腺癌、卵巢癌、淋巴瘤、食管癌、黑色素瘤、腎癌、子宮癌、鼻咽癌、骨肉瘤、膀胱癌、前列腺癌等多種癌癥患者血漿Hsp90a含量，發現與健康人相比均顯著升高（具有統計顯著性），并分別提供了上述不同癌種患者血漿Hsp90a含量的平均參考值。這說明腫瘤標志物Hsp90a可用于胃癌、胰腺癌、卵巢癌、淋巴瘤、食管癌、黑色素瘤、腎癌、子宮癌、鼻咽癌、骨肉瘤、膀胱癌、前列腺癌等多癌癥的診斷。【專利附圖】【附圖說明】[0026]圖1是Hsp90α檢測結果的ROC曲線（基于所有檢測Hsp90α的受試者）。[0027]圖2是Hsp90α檢測結果的R0C曲線AUC95%CI(0·788,0·829)。[0028]圖3是Hsp90α檢測結果的R0C曲線AUC95%CI(0·811，0·854)。[0029]圖4是Hsp90α檢測結果的R0C曲線AUC95%CI(0·804,0·850)。[0030]圖5是Hsp90α檢測結果的R0C曲線AUC95%CI(0·731，0·777)。[0031]圖6是根據斜率判定腫瘤增大的R0C曲線。[0032]圖7是根據變化百分比判定ro的R0C曲線。[0033]圖8是根據變化值判定ro的R0C曲線。[0034]圖9顯示了EDTA-K2采血管樣本和EDTA-K3采血管樣本的對比。[0035]圖10是肝癌患者相對于健康人的R0C曲線。[0036]圖11是肝癌患者相對于非癌肝部相關疾病人群的R0C曲線。[0037]圖12是結直腸癌患者相對于健康人及非癌結直腸相關疾病的R0C曲線。[0038]圖13是乳腺癌患者相對于健康人的R0C曲線。[0039]圖14是乳腺癌患者相對于非癌乳腺相關疾病人群的R0C曲線。[0040]圖15是多種癌癥患者血漿Hsp9〇a含量檢測結果匯總。[0041]圖中，"ROCCurveforModel"表不針對模型的R0C曲線，"AreaundertheCurve"表示曲線下面積，"Specificity"表示特異度，"Sensitivity"表示靈敏度。【具體實施方式】[0042]本文所用的術語"血液樣本"是指由受試者的血液獲得的樣本。考慮到細胞內Hsp90a對檢測的干擾，血液樣本優選為血漿或血清樣本，也可以是由血漿或血清稀釋后的樣本。本領域技術人員可以理解，由于在成分上的區別，當采用受試者的血漿樣本和血清樣本分別進行檢測時，Hsp90a的濃度可能會略有不同。出于便于定量和比較的目的，在本發明中血漿樣本是優選的。[0043]本文所用的術語"特異度"、"靈敏度"、"符合率"均與相對應的醫學統計學術語具有相同的含義。[0044]"特異度"（specificity)是指診斷為"非癌癥"的病例中經試劑盒檢測為陰性的比例。[0045]"靈敏度"（sensitivity)是指病理學診斷為"癌癥"的病例中，經試劑盒檢測為陽性的比例。[0046]"符合率"(accuracy)是指真陽性樣本量與真陰性樣本量之和占總樣本量的比例，反映試劑盒檢測結果與受試者是否罹患癌癥的真實情況相符合的程度。[0047]本文所用的術語"cut-off值"、"界值""參考值"和"閾值"可以互換使用，指的是用來判斷檢測結果的標準，即臨界值，檢測結果高于cut-off值即視為陽性，低于cut-off值即視為陰性。[0048]本文所用的術語"臨床獲益"，指經過某種治療達到病情穩定或緩解的情況，其中CR、PR和SD具有與實體瘤療效評價標準（RECIST標準）中相應術語完全相同的含義，即CR(Completeresponse)腫瘤完全緩解、PR(Partialresponse)腫瘤部分緩解和SD(Stabledisease)疾病穩定。CR、PR和SD這三項指標作為臨床獲益人群的界定，與此相反的是H)(Progressivedisease)即疾病進展。[0049]本文所用術語"非癌相關疾病"指經病理學診斷確診為不是癌癥但患有良性相關疾病的患者，如在肺癌試驗中指確診為不是肺癌但患有肺炎、肺結核等肺部良性相關疾病的患者，在肝癌試驗中指確診為不是肝癌但患有肝炎、肝硬化等肝部良性相關疾病的患者，在結直腸癌試驗中指確診為不是結直腸癌但患有炎癥、結直腸息肉等結直腸良性相關疾病的患者，在乳腺癌試驗中指確診為不是肺、乳腺癌癌但患有乳腺炎、乳腺增生等乳腺良性相關疾病的患者。[0050]本文中所用的部分縮寫及統計術語含義如下表所示：【權利要求】1.確定受試者是否患有癌癥或者具有罹患癌癥風險的方法，包括檢測該受試者的血液樣本中Hsp90α的濃度，如果該濃度達到或超過預先設定的閾值，則判定該受試者患有癌癥或者具有罹患癌癥的風險，其中所述閾值選自50ng/ml到120ng/ml的范圍內，例如所述閾值可以為50、53、56、62、63、64、67、72、82、85或117叩/1111，且所述閾值±15%范圍內的數值均被視為具有等同判定意義；優選地，所述血液樣本為血漿樣本。2.用于對正在接受治療的癌癥患者進行病情監測和/或療效評價或者用于對候選治療藥物進行療效評價的方法，包括在治療前及治療后分別檢測受試者的血液樣本中Hsp90a的濃度，如果治療后Hsp90a的濃度相對于治療前Hsp90a濃度增加的百分比達到或超過預先設定的閾值，則判定該受試者病情進展和/或療效較差，或者判定所述候選治療藥物療效較差，其中所述閾值選自10%到50%的范圍內，例如所述閾值可以為34%，且所述閾值±15%范圍內的數值均被視為具有等同判定意義；優選地，所述血液樣本為血漿樣本。3.確定受試者是否患有癌癥或者具有罹患癌癥風險的方法，包括聯合檢測該受試者的血液樣本中Hsp90a的濃度以及至少一種其他腫瘤標志物的濃度，如果Hsp90a的濃度和所述至少一種其他腫瘤標志物的濃度達到或超過預先設定的閾值，則判定該受試者患有癌癥或者具有罹患癌癥的風險，其中Hsp90a的閾值選自50ng/ml到120ng/ml的范圍內，例如所述閾值可以為50、53、56、62、63、64、67、72、82、85或117叩/1111，且所述閾值±15%范圍內的數值均被視為具有等同判定意義；優選地，所述血液樣本為血漿樣本。4.權利要求1-3之任一項的方法，其中所述癌癥選自由肺癌、肝癌、結直腸癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、淋巴瘤、食管癌、黑色素瘤、腎癌、子宮癌、鼻咽癌、骨肉瘤、膀胱癌和前列腺癌構成的組。5.權利要求3-4之任一項的方法，其中所述至少一種其他腫瘤標志物選自由CEA、CYFRA21-1、AFP、CA19-9、CA125、CA15-3、PSA和CA72-4構成的組。6.權利要求1-5之任一項的方法，其中所述Hsp90a的濃度采用EDTA-K2作為抗凝劑進行檢測。7.用于確定受試者是否患有癌癥或者具有罹患癌癥風險的試劑盒，包括：任選的人分泌型Hsp90a、人分泌型Hsp90a單克隆抗體、檢測試劑以及說明書，其中所述說明書中標明了健康人血液樣本中Hsp90a濃度的閾值，如果受試者的血液樣本中Hsp90a的濃度達到或超過所述閾值，則判定該受試者患有癌癥或者具有罹患癌癥的風險，其中所述閾值選自50叩/1111到1201^/1111的范圍，例如所述閾值可以為50、53、56、62、63、64、67、72、82、85或117ng/ml，且所述閾值±15%范圍內的數值均被視為具有等同判定意義；優選地，所述血液樣本為血漿樣本。8.權利要求7的試劑盒，其中所述癌癥選自由肺癌、肝癌、結直腸癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、淋巴瘤、食管癌、黑色素瘤、腎癌、子宮癌、鼻咽癌、骨肉瘤、膀胱癌和前列腺癌構成的組。9.權利要求7-8之任一項的試劑盒，其中所述試劑盒中包括用于采集血液樣本的容器，并且該容器中包含EDTA-K2、EDTA-K3或肝素；優選地，所述容器為包含EDTA-K2的采血管。10.權利要求7-9之任一項的試劑盒，其中所述Hsp90a的濃度采用EDTA-K2作為抗凝劑進行檢測。11.EDTA-K2作為抗凝劑在收集用于Hsp90α腫瘤標志物檢測的血液樣本中的用途。【文檔編號】G01N33/574GK104251906SQ201410302717【公開日】2014年12月31日申請日期:2014年6月27日優先權日:2013年6月27日【發明者】羅永章,崔大偉,付彥,吳非,宋曉敏,李米川,常國棟,路春桃申請人:清華大學,煙臺普羅吉生物科技發展有限公司,北京普羅吉生物科技發展有限公司
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