一種基于乳酸脫氫酶測定的電子煙煙液細胞毒性評價方法
【專利摘要】一種基于乳酸脫氫酶測定的電子煙煙液細胞毒性評價方法，包括以下步驟：1）配制實驗試劑，2）細胞接種，3）電子煙煙液染毒，4）LDH測定，5）結果與分析。本發明針對大多數電子煙煙液樣本密度大的特點，確立了采用質量稱重配制電子煙染毒溶液的方法。本發明的評價方法通過細胞接種密度的優化、細胞裂解液的選擇、LDH基質液反應時間的優化提高檢測靈敏度，并通過電子煙煙液染毒濃度的優化，確定了最佳染毒濃度，以獲得最佳劑量效應曲線。通過LDH的測定，可反映電子煙煙液對細胞膜的損傷程度，揭示電子煙的細胞毒性機理。此外，本測定方法還具有操作快速簡便、靈敏性高、結果穩定的優點。
【專利說明】一種基于乳酸脫氫酶測定的電子煙煙液細胞毒性評價方法【技術領域】
[0001]本發明涉及電子煙煙液體外毒理學評價研究領域，具體說是一種基于乳酸脫氫酶測定的電子煙煙液細胞毒性的方法。
【背景技術】
[0002]隨著人們對“吸煙有害健康”的了解，各國政府均在現行法律規定范圍內積極采取和實行有效的立法、行政或其他措施，禁止在公共場所吸煙。2005年，中國簽署了世界衛生組織《煙草控制框架公約》。2012年，中國政府發布《中國煙草控制規劃(2012-2015年)》，提出創造無煙環境，實施公共場所全面禁煙。室內禁煙措施導致電子煙等新型產品在各國市場上得到迅速增長，消費群體不斷擴大。電子煙又名電子尼古丁傳送系統。世界衛生組織對電子尼古丁傳送系統的官方定義為:電子尼古丁傳送系統是一種消費產品，能夠向肺傳輸尼古丁。電子煙一般都由三部分構成:煙桿、霧化器、煙液。近年來，電子煙以“保健”，“戒煙”，“清肺”等為宣傳口號，以網絡為主要營銷途徑，在中國地區銷量大增。某些電子煙產品還宣稱其比傳統卷煙的危害性更小。然而目前對電子煙的毒性評價研究較少，相關研究僅使用3-(4，5- 二甲基噻唑-2)-2，5- 二苯基四氮唑溴鹽法(MTT法)對電子煙煙液或煙霧的細胞毒性進行評價，結果表明不同電子煙煙液的細胞毒性相差很大。
[0003]檢測化合物細胞毒性可通過多種生物學終點進行，例如通過測定酸性磷酸酶或其他蛋白活性來計算細胞數量、測定細胞代謝活性(例如MTT法)以及檢測細胞膜的完整性等生物學終點進行評價。根據不同檢測原理開展細胞毒性評價，可從不同角度揭示化合物細胞毒性的作用機理。
[0004]細胞凋亡或化合 物染毒而造成的細胞膜結構的破壞會導致細胞漿內的酶釋放到培養液里，其中包括酶活性較為穩定的乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)。通過檢測釋放的乳酸脫氫酶的活性，可表征細胞膜的完整性，實現對化合物細胞毒性的定量分析。
[0005]目前，電子煙煙液染毒對細胞膜的完整性影響還未見文獻報道，亟需建立基于LDH測定的電子煙煙液細胞毒性評價方法，考察電子煙煙液細胞毒性的作用機理，定量準確評價市售電子煙產品煙液的細胞毒性。
【發明內容】
[0006]本發明的目的是建立的一種LDH測定的電子煙煙液細胞毒性評價方法，為電子煙產品的細胞毒性評價提供方法學支持。LDH法的測定原理是基于在乳酸脫氫酶的作用下，氧化型輔酶I (NAD+)被反應生成的還原型輔酶I (NADH)，再與氧化型2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-苯四唑(INT)在硫辛酰胺脫氫酶(diaphorase)的催化下反應生成強生色物甲臜(formazan )，在490nm波長下產生吸收峰，從而確定釋放的乳酸脫氫酶的活性，作為細胞膜完整性的標志，實現對細胞毒性的定量分析。
[0007]本發明的目的是通過以下技術方案來實現的: 一種基于乳酸脫氫酶測定的電子煙煙液細胞毒性評價方法，包括以下步驟:
I)配制實驗試劑:有以下幾種:
(1)LDH基質液的配制:用0.2 mol/L的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽-鹽酸(TriS-HCl)緩沖液(PH8.2)配制LDH基質液，其中各成分及其終濃度分別為:乳酸鋰5X IO-2 mol/L、硝基氯化四氮唑(INT) 6.6X10—4 mol/L、吩嗪二甲酯硫酸鹽(PMS) 2.8X10—4 mol/L、氧化型輔酶I (NAD) 1.3X 10_3 mol/L, LDH基質液應在臨用前配制；
(2)細胞裂解液:20%的曲拉通100(Triton-100)；
(3)終止液:4M的鹽酸(HCl)溶液；
(4)細胞培養基:溶劑為RPM1-1640培養基，其中胎牛血清的體積百分比為10%，L-谷氨酰胺的濃度為2 mM,青霉素的濃度為100 IU/ml，鏈霉素的濃度為100 μ g/ml ；
(5)電子煙煙液染毒溶液:由于電子煙煙液的主要組成成分包括丙二醇、丙三醇等保潤齊U，導致電子煙煙液溶液密度較大，無法準確移取體積進行染毒溶液的配制。因此，本發明中使用精度不小于萬分之一的分析天平對電子煙煙彈液進行準確稱量，然后使用細胞培養基溶液配制。電子煙煙液染毒濃度范圍應覆蓋為10mg/ml-120 mg/ml,應設置不少于7個非零染毒濃度。
[0008]2)細胞接種:本方法所用細胞系為中國倉鼠卵巢細胞CHO細胞。在考察電子煙煙液對CHO細胞系的細胞毒性時，需開展預實驗，對細胞接種密度進行優化。向96孔板的每孔中加入100 μ L細胞懸液，按照優化好的細胞接種密度進行細胞接種，96孔板的最外周36個孔中每孔加入100 μ I生長培養液作為空白對照，其余每孔加入100 μ I細胞懸液，于37 0C >5% C02條件下培養24 h ；
3)電子煙煙液染毒:細胞培養至指數增長期后，吸去培養液，96孔板(除最外周36孔)每6孔為一組，分別設置正常對照組、7個不同劑量的電子煙煙液染毒組和LDH最大釋放組(細胞中能釋放出來的LDH最大量)，正常對照組和LDH最大釋放組均每孔加入100 μ I的細胞培養基，電子煙煙液染毒組每孔加入100 μ I不同濃度的電子煙煙液染毒溶液，96孔板的最外周36個孔中選擇其中6個孔作為培養基背景對照，再選擇6個孔加入最高電子煙煙液染毒溶液作為染毒溶液背景對照，于37 °C、5% C02條件下培養24 h。
[0009]4)LDH測定:電子煙煙液對細胞染毒24h，染毒結束前15分鐘，在最大釋放量孔中加入5 μ I裂解液。染毒結束后使用250g離心力對細胞培養板離心5分鐘，每孔移取50 μ I上清至透明96孔板，加入100 μ ILDH基質液，反應一段時間后，加入50 μ I終止液，使用酶標儀檢測每孔在490 nm波長處的吸光值。
[0010]6)結果與分析
原始吸光值A:A = A490 nm A (染毒孔吸光度值)=6個平行孔的吸光度平均值 A (染毒溶液背景)=6個平行孔的吸光度平均值 A (培養基背景)=6個平行孔的吸光度平均值 A(空白對照組)=6個平行孔的吸光度平均值 A (最大釋放組)=6個平行孔的吸光度平均值
【權利要求】
1.一種基于乳酸脫氫酶測定的電子煙煙液細胞毒性評價方法，其特征在于:包括以下步驟: 1)配制實驗試劑: (1)LDH基質液的配制:用0.2mol/L的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽-鹽酸(Tris-HCl)緩沖液(PH8.2)配制LDH基質液，其中各成分及其終濃度分別為:乳酸鋰5 X IO-2 mol/L、硝基氯化四氮唑(INT) 6.6X10—4 mol/L、吩嗪二甲酯硫酸鹽(PMS) 2.8X10—4 mol/L、氧化型輔酶I (NAD) 1.3X 10_3 mol/L, LDH基質液應在臨用前配制； (2)細胞裂解液:20%的曲拉通100(Triton-100)； (3)終止液:4M的鹽酸(HCl)溶液； (4)細胞培養基:溶劑為RPM1-1640培養基，其中胎牛血清的體積百分比為10%，L-谷氨酰胺的濃度為2 mM,青霉素的濃度為100 IU/ml，鏈霉素的濃度為100 μ g/ml ； (5)電子煙煙液染毒溶液:用分析天平對電子煙煙液進行準確稱量，然后使用細胞培養基溶液配制，電子煙煙液染毒濃度范圍10mg/mfl20 mg/ml，設置不少于7個非零染毒濃度； 2)細胞接種:所用細胞系為中國倉鼠卵巢細胞CHO細胞，向96孔板的每孔中加入100μ L細胞懸液，按照優化好的細胞接種密度進行細胞接種，96孔板的最外周36個孔中每孔加入100 μ I生長培養液作為空白對照，其余每孔加入100 μ I細胞懸液，于37 °C、5%C02條件下培養24 h ； 3)電子煙煙液染毒:細胞培養至指數增長期后，吸去培養液，96孔板(除最外周36孔)每6孔為一組，分別設置正常對照組、7個不同劑量的電子煙煙液染毒組和LDH最大釋放組，正常對照組和LDH最大釋放組均每孔加入100 μ I的細胞培養基，電子煙煙液染毒組每孔加入100 μ I不同濃度的電子煙煙液染毒溶液，96孔板的最外周36個孔中選擇其中6個孔作為培養基背景對照，再選擇6個孔加入7個劑量中的最高劑量電子煙煙液染毒溶液作為染毒溶液背景對照，于37 °C、5% CO2條件下培養24 h； 4)LDH測定:染毒結束前15分鐘，在LDH最大釋放量孔中加入5 μ I裂解液，染毒結束后使用250g離心力對細胞培養板離心5分鐘，每孔移取50 μ I上清至透明96孔板，加入100 μ ILDH基質液，反應一段時間后，加入50 μ I終止液，使用酶標儀檢測每孔在490 nm波長處的吸光值； 5)結果與分析 原始吸光值A:A = A490 nm A (染毒孔吸光度值)=6個平行孔的吸光度平均值 A (染毒溶液背景)=6個平行孔的吸光度平均值 A (培養基背景)=6個平行孔的吸光度平均值 A(空白對照組)=6個平行孔的吸光度平均值 A (最大釋放組)=6個平行孔的吸光度平均值
2.根據權利要求1所述的基于乳酸脫氫酶測定的電子煙煙液細胞毒性評價方法，其特征在于:在開展細胞毒性評價前，需對染毒所用細胞株的細胞接種密度進行優化，選擇LDH最大釋放量與空白對照組吸光度值相差最大，且細胞處于指數增長期的細胞個數作為最優細胞接種密度，本發明中CHO細胞的最佳接種密度為10000個/孔。
3.根據權利要求1所述的基于乳酸脫氫酶測定的電子煙煙液細胞毒性評價方法，其特征在于:細胞裂解液使用時其終濃度為1%。
4.根據權利要求1所述的基于乳酸脫氫酶測定的電子煙煙液細胞毒性評價方法，其特征在于:LDH基質液的反 應時間為15min。
【文檔編號】G01N33/00GK103808906SQ201410094851
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2014年3月16日 優先權日:2014年3月16日
【發明者】陳歡, 楊進, 劉洋, 劉彤, 韓書磊, 吳帥賓, 付立偉, 侯宏衛, 胡清源 申請人:國家煙草質量監督檢驗中心
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