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專利名稱：化學(xué)沉淀法檢測血清小而密低密度脂蛋白的方法
化學(xué)沉淀法檢測血清小而密低密度脂蛋白的方法 技術(shù)領(lǐng)域-
本發(fā)明涉及一種血清小而密低密度脂蛋白檢測方法。
背景技術(shù)：
目前檢測sdLDL的方法主要包括梯度凝膠電泳(Gradient Gel Electrophoresis, GGE);密度梯度超速離心 (Density gradient ultracentrifugation， DGUC) 5核磁共振(Nuclear magnetic resonance, 麗R)光譜法等，這些方法都是針對sdLDL某一方面的特性進(jìn)行檢測， 各自有不同程度的局限性，如操作繁瑣、耗時(需24小時以上)、需特 殊昂貴設(shè)備(有的儀器需100多萬元)、操作要求極高等，因而這些方 法僅限于實驗室研究使用，沒有得到普及。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種檢測sdLDL準(zhǔn)確可靠的化學(xué)沉淀法檢測 血清小而密低密度脂蛋白的方法。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案是 一種化學(xué)沉淀法檢測血清小而密低密度脂蛋白的方法，其特征是 包括下列步驟
1)測試前標(biāo)本處理取肝素一鎂試劑0.2ml加入0.2ml血清置于 1.5ml離心管中，混勻，試管密封置37'C孵育10min，立即轉(zhuǎn)放置4。C冰 箱15min， 12 000rpm離心15min，取上清液作為待測標(biāo)本；所述肝素一鎂試劑是含145U/mL肝素、氯化鎂79mmol/U 0. lg/L硫酸葡聚糖的試劑;
2)檢測經(jīng)過方法處理后待測樣本中僅含sdLDL而無其他低密度 脂蛋白膽固醇，測定待測樣本中LDL-C濃度即得該樣本sdLDL濃度；具 體測試方法如下
采用包括R,、R2試劑的膽固醇試劑盒進(jìn)行雙試劑測定，R3式劑中含有 聚陰離子與sdLDL形成復(fù)合物而遮蔽sdLDL-C，血清中HDL在表面活性 劑作用下與酶試劑產(chǎn)生不完整的Trinder反應(yīng)，反應(yīng)中產(chǎn)生的&02在缺 乏偶聯(lián)劑時被消耗而不顯色；當(dāng)加入R2試劑時，含對sdLDL-C有特異作 用的表面活性劑能水解sdLDL-C，釋放出其膽固醇，參與完整的Trinder 反應(yīng)，測定546nm處的吸光度與sdLDL-C的濃度成正比，測定儀器為全 自動生化分析儀。結(jié)果計算sdLDL-C (mniol/L)=標(biāo)本吸光度/參考品 吸光度X參考品濃度(注各吸光度計算AA二A2—AJ
測定主要參數(shù)為采用二點終點法，定標(biāo)模式采用二點定標(biāo)，反應(yīng) 方向為上升，主波長為546nm，副波長為600nm，反應(yīng)溫度為37。C。
采用包括R,、R2試劑的膽固醇試劑盒對待測樣本進(jìn)行雙試劑測定時， 先將待測樣本與R3式劑反應(yīng)300秒，再與R2試劑反應(yīng)300秒，待測樣本、 R3式劑、R2試劑的體積比為1:75:25。
本發(fā)明
a)反應(yīng)原理肝素與鎂離子，并加入適量添加劑沉淀血清中大 部分含ApoB的脂蛋白[VLDL、 Lp (a)、大而輕低密度脂蛋白(large, buoyant LDL， 1LDL)]，而HDL與sdLDL不被沉淀，直接測定上清液中b) 試劑與儀器血清總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白膽固 醇、低密度脂蛋白膽固醇試劑由上海北海生物技術(shù)工程有限公司提供； 載脂蛋白A1、 B試劑由上海捷門生物技術(shù)有限公司提供；葡萄糖試劑由 溫州東甌生物科技有限公司提供；氯化鎂由上海凌峰化學(xué)試劑有限公司
提供，高密度膽固醇純品、添加劑由Sigma公司提供，濃度為5. 9mg/ml。 全自動生化分析儀日立7600-020;低溫超速離心機Beckman-Coulter公 司AllegraTM 64R;
c) 標(biāo)本收集研究對象禁止葷食3天，早晨禁止飲食和喝水，取 靜脈血2ml，置有蓋密封試管，37。C靜置30min，3000轉(zhuǎn)/min離心10min， 取上層血清，密封，作為待測樣本，2h內(nèi)完成所有生化指標(biāo)檢測，若不 能完成需密封放置一7(TC保存，保存時間不超過2個月。
本發(fā)明準(zhǔn)確可靠，為sdLDL的檢測提供了一種簡便、快速的方法。 下面結(jié)合實例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
具體實施例方式
a) 反應(yīng)原理肝素與鎂離子，并加入適量添加劑沉淀血清中大部 分含ApoB的脂蛋白[VLDL、Lp(a)、大而輕低密度脂蛋白(large, buoyant LDL， 1LDL)]，而HDL與sdLDL不被沉淀，直接測定上清液中LDL-C濃 度即得sdLDL-C含量；
b) 試劑與儀器血清總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇、
低密度脂蛋白膽固醇試劑由上海北海生物技術(shù)工程有限公司提供；載脂
蛋白A1、 B試劑由上海捷門生物技術(shù)有限公司提供；葡萄糖試劑由溫州 東甌生物科技有限公司提供；氯化鎂由上海凌峰化學(xué)試劑有限公司提供，高密度膽固醇純品、添加劑由Sigma公司提供，濃度為5.9mg/ml。 全自動生化分析儀日立7600-020;低溫超速離心機Beckman-Coulter公 司AllegraTM 64R;
c) 標(biāo)本收集研究對象禁止葷食3天，早晨禁止飲食和喝水，取靜 脈血2ml，置有蓋密封試管，37。C靜置30min， 3000轉(zhuǎn)/min離心10min， 取上層血清，密封，作為待測樣本，2h內(nèi)完成所有生化指標(biāo)檢測，若不 能完成需密封放置一7(TC保存，保存時間不超過2個月；
d) 測試前標(biāo)本處理取肝素一鎂試劑0.2ml加入0.2ml血清置于 1.5ml離心管中，混勻，試管密封置37。C孵育10min，立即轉(zhuǎn)放置4。C冰 箱15min， 12 000rpm離心15min，取上清液作為待測標(biāo)本；所述肝素一 鎂試劑是含145U/mL肝素、氯化鎂79mmol/L、 0. lg/L硫酸葡聚糖的試劑；
e) 檢測經(jīng)過方法處理后待測樣本中僅含sdLDL而無其他低密度 脂蛋白膽固醇，測定待測樣本中LDL-C濃度即得該樣本sdLDL濃度；具 體測試方法如下
采用包括R'、R2試劑的膽固醇試劑盒進(jìn)行雙試劑測定，R3式劑中含有 聚陰離子與sdLDL形成復(fù)合物而遮蔽sdLDL-C，血清中HDL在表面活性 劑作用下與酶試劑產(chǎn)生不完整的Trinder反應(yīng)，反應(yīng)中產(chǎn)生的HA在缺 乏偶聯(lián)劑時被消耗而不顯色；當(dāng)加入R2試劑時，含對sdLDL-C有特異作 用的表面活性劑能水解sdLDL-C，釋放出其膽固醇，參與完整的Trinder 反應(yīng)，測定546醒處的吸光度與sdLDL-C的濃度成正比，測定儀器為全 自動生化分析儀。
測定主要參數(shù)為采用二點終點法，定標(biāo)模式采用二點定標(biāo)，反應(yīng)方向為上升，主波長為546nm，副波長為600nm，反應(yīng)溫度為37'C。
采用包括&、 R2試劑的膽固醇試劑盒對待測樣本進(jìn)行雙試劑測定 時，先將待測樣本與&試劑反應(yīng)300秒，再與R2試劑反應(yīng)300秒，待測樣 本、Rrl式劑、fU式劑的體積用量分別為3 m、 225 "、 75 ul。
統(tǒng)計學(xué)處理:應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計分析軟件包，計量資料采用t檢驗，
并分別計算均數(shù)(；)、標(biāo)準(zhǔn)差")和變異系數(shù)，所得結(jié)果表示為均數(shù)士標(biāo) 準(zhǔn)差(；士s);計數(shù)資料采用xs檢驗，顯著性差異的概率均設(shè)為P〈0.05。 還取健康體檢者138例為對照組，年齡22 52歲，平均年齡(31.8 ± 8)歲，其中男性71例，女性67例，所有健康體檢者無心腦血管疾病， 無糖尿病，以及其他影響脂質(zhì)代謝的疾病，且近2個月未服用影響血脂 的藥物如他汀類藥物等；經(jīng)冠狀動脈血管造影證實初診冠心病人30例， 均未使用如他汀類藥物，男性16例，女性14例，年齡35 72歲，平均年 齡(51.8 ± 6.7)歲。采用上述方法進(jìn)行sdLDL濃度檢測，結(jié)果健康 體檢者sdLDL濃度為O. 5±0. 28mmol/L，中位數(shù)為O. 48腿ol/L，最大濃 度l. 12腿ol/L。 sdLDL濃度與TG、 ApoB、 LDL、 HDL相關(guān)性分別為O. 642、 0.723、 0.812、 -0.256。 6名健康體檢者sdLDL濃度為"0"，占總健康體 檢者4.3% (6/138)。其中男性sdLDL濃度明顯高于女性sdLDL濃度
(0. 57±0. 27， 0. 40±0, 32， P〈0.05)。 30例冠心病患者sdLDL濃度為 1.3士0.41鵬ol/L，中位數(shù)為1.28腿ol/L，在30例冠心病患者中占27%
(8/30)的患者LDL—C濃度超過正常范圍，sdLDL濃度與與TG、 ApoB、 LDL、 HDL相關(guān)性分別為O. 742、 0.78、 0.672、 -0.231。見表l:表l對照組與病例組血脂檢測結(jié)果
nCHOL (mmol/UTG (mm亂)LDL-C (nmiol/L〉HDL-C (訓(xùn)ol/L)ApoB (mg/dl)sdLDL-C(mmol/L)
對照組1384- 13土0. 560, 96 ±0. 482, 47 ±0. 181. 17±0.2178±170.5±0. 28
冠心病組304. 24 ±0. 781. 64±0. 52*2. 75 ±0. 23"1. 26±0.,89±19w1. 3土0.41*
f) 方法特異性將HDL純品配制成低值2.0ramol/L和高值 5. Ommol/L，超速離心制備得到的sdLDL純品配制成低值0. 5腿ol/L和 高值2.0mmol/L以及超速離心制得不含sdLDL血清(LDL-C濃度為
4. l咖ol/L， HDL-C濃度為2. 2ramol/L)按照方法中所描述進(jìn)行樣本處理， 各樣本重復(fù)測定5次，測得HDL低值2.0士0.05腿ol/L，高值
5. 0±0. l腿ol/L; sdLDL低值O. 5±0. 03mmol/L，高值2. 0±0. 09mmol/L， 不含sdLDL血清LDL-C濃度為0. 0隨ol/L， HDL-C濃度為2. 2 mmol/L ± 0. 09ramol/L，說明該法僅沉淀除sdLDL以外的其他含ApoB的膽固醇， 不能沉淀HDL與sdLDL;
g) 添加劑的影響將sdLDL純品低值O. 5ramol/L和高值2. 0mmol/L 用不含0. 1%添加劑的沉淀劑處理后測得其濃度為低值0.41 ± 0.04 咖ol/L和高值1. 53±0. 11咖ol/L (f5);用含0. lg/LM硫酸葡聚糖的 沉淀劑處理后測得其濃度為低值0.5土0.03mmol/L，高值2.0 ± 0.09 mmol/L (n二5)。不含0. lg/L硫酸葡聚糖的沉淀劑處理標(biāo)本時，約使 209&sdLDL被沉淀(處理后/處理前)，從而導(dǎo)致sdLDL檢測結(jié)果偏低；
h〉精密度實驗將方法中所制備的sdLDL純品用生理鹽水分別稀 釋成高值1.6 mmol/L和低值0. 6咖ol/L，分別測定批內(nèi)和日間標(biāo)準(zhǔn)差 (s〉、 CV。其中高值批內(nèi)s、 CV分別為0.01、 2.0%，批間s、 CV分別
9為0.023、 2.7%;低值批內(nèi)s、 CV分別為0.026、 6.7%，批間s、 CV 分別為0.031、 4.5%;
i)檢測范圍取sdLDL純品，用生理鹽水作稀釋，使sdLDL的含 量分別為原來純品的1/20、 1/10、 2/10、 4/10、 6/10、 8/10、 10/10， 各稀釋液平行測定2次，以預(yù)測值為X，實測值為Y，進(jìn)行線性相關(guān)分 析，方程為Y=0.987X + 0. 006， r=0.997。說明本法的sdLDL檢測濃度 可報告范圍達(dá)到2. 2mmol/L;
j)干擾實驗主要觀察整個樣本處理和檢測過程中、血紅蛋白和
膽紅素對sdLDL結(jié)果的影響。將HDL-C、 VLDL—C、血紅蛋白和膽紅素分 別加入只含sdLDL，使其終濃度分別為HDL-C (lmmol/L) 、 VLDL—C (lmmol /L)、血紅蛋白(500mg/dl)、膽紅素(40mg/dl)，按照上述方法進(jìn)行樣 本處理，檢測加入干擾物前后sdLDL濃度(平行處理測定2次)，結(jié)果分 別為99. 2%、 99. 7%、 97.1%、 97.6%。結(jié)果顯示HDL-C、 VLDL—C對該 法測定sdLDL無干擾，血紅蛋白《500mg/L、膽紅素《40mg/L不影響測定 結(jié)果。
k)回收實驗在900 u LsdLDL濃度為l. lmmol/L血清中加入100p LsdLDL純品液系列。sdLDL純品液濃度高值二 3 mmol/L，中值=1. 2mmol/L, 低值=0. 5mmol/L,測定樣本中的sdLDL濃度，結(jié)果該方法的平均回收率在 97. 9 %。
10
權(quán)利要求
1、化學(xué)沉淀法檢測血清小而密低密度脂蛋白的方法，其特征是包括下列步驟1)測試前標(biāo)本處理取肝素—鎂試劑0.2ml加入0.2ml血清置于1.5ml離心管中，混勻，試管密封置37℃孵育10min，立即轉(zhuǎn)放置4℃冰箱15min，12000rpm離心15min，取上清液作為待測標(biāo)本；所述肝素—鎂試劑是含145U/mL肝素、氯化鎂79mmol/L、0.1g/L硫酸葡聚糖的試劑；2)檢測經(jīng)過方法處理后待測樣本中僅含sdLDL而無其他低密度脂蛋白膽固醇，測定待測樣本中LDL-C濃度即得該樣本sdLDL濃度；具體測試方法如下采用包括R1、R2試劑的膽固醇試劑盒進(jìn)行雙試劑測定，R1試劑中含有聚陰離子與sdLDL形成復(fù)合物而遮蔽sdLDL-C，血清中HDL在表面活性劑作用下與酶試劑產(chǎn)生不完整的Trinder反應(yīng)，反應(yīng)中產(chǎn)生的H2O2在缺乏偶聯(lián)劑時被消耗而不顯色；當(dāng)加入R2試劑時，含對sdLDL-C有特異作用的表面活性劑能水解sdLDL-C，釋放出其膽固醇，參與完整的Trinder反應(yīng)，測定546nm處的吸光度與sdLDL-C的濃度成正比，測定儀器為全自動生化分析儀。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的化學(xué)沉淀法檢測血清小而密低密度脂蛋白的方法，其特征是測定主要參數(shù)為采用二點終點法，定標(biāo)模式采用二點定標(biāo)，反應(yīng)方向為上升，主波長為546nm，副波長為600nm,反應(yīng)溫度為37°C。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的化學(xué)沉淀法檢測血清小而密低密度脂蛋白的方法，其特征是采用包括Rb R2試劑的膽固醇試劑盒對待測樣本進(jìn)行雙試劑測定時，先將待測樣本與R3式劑反應(yīng)300秒，再與R2試劑反應(yīng)300秒，待測樣本、R3式劑、R2試劑的體積比為1:75:25。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種化學(xué)沉淀法檢測血清小而密低密度脂蛋白的方法，包括樣本的預(yù)處理、血清測定等步驟。本發(fā)明準(zhǔn)確可靠，可作為一種準(zhǔn)確可靠sdLDL檢測方法。
文檔編號G01N33/92GK101482570SQ20091002898
公開日2009年7月15日 申請日期2009年2月8日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月8日
發(fā)明者輝 叢, 王惠民, 鞠少卿 申請人:南通大學(xué)附屬醫(yī)院