一種防治稻紋枯病藥物的藥效測定方法
【專利摘要】本發明公開了一種防治稻紋枯病藥物的藥效測定方法，利用一組簡單便利的器具，在離體水稻葉片上測定藥物對稻紋枯病發病的防治效果，該方法的步驟如下：1）水稻葉片的培育準備；2）器具準備；3）病菌的培養準備；4）防治藥物的配備；5）測定用離體葉片的準備；6）藥物施用；7）接種病菌；8）施藥后或接種后的處置。本發明的優點是：1）接種發病較為穩定一致；藥效結果重現性好，且查錄容易量化；測試耗時短。2）可避免出現有效藥物的漏選。3）離體葉片采樣方便；室內操作；便于跟蹤藥物在發病擴展過程中的作用；測定過程操作簡單易行，且局部條件控制方便；容易實現測定方法的標準化。
【專利說明】一種防治稻紋枯病藥物的藥效測定方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及農業技術和生物技術。具體是一種防治稻紋枯病藥物的藥效測定方法。
【背景技術】
[0002]稻紋枯病是水稻的首要病害，每年可引起我國60億多公斤的稻糧損失，由于與該病害防病控害有關的許多基礎研究滯后，當前及相當一段時期內，該病害的防治仍主要依賴農藥防治；當前的防治藥劑主要是井岡霉素，由于用藥單一，且井岡霉素與人類醫學用抗菌素密切有關，因此生產上需要尋找替代藥物和更多的可用藥物；那么，加快加強防治藥物的篩選鑒定顯得非常必要；而高效便捷的測定方法對篩選鑒定工作無疑很有益。
[0003]根據藥效測定時，藥物作用對象病原菌所處的背景條件，藥效測定方法可有如下3類主要方法:培養基生物測定法、活體植株測定法、和組織測定法。培養基生物測定法在培養基上測定藥物對病原菌的抑制作用，該方法的嚴重不足是會漏選有效藥物；活體植株測定法是在活體植物上測定藥物對病害的作用效果，該方法的突出弊病是，費時耗力、及試驗條件難控等；組織測定法是在離體的植物器官組織上測定藥物對病害的作用效果，該方法可克服前面2類方法的弊病，因而成了近年備受重視的藥效測定方法。
[0004]在稻紋枯病的藥物篩選中，已有2種較為成熟的組織測定法，即離體蠶豆葉測定法和離體水稻葉鞘測定法，前者以離體蠶豆葉片為組織材料，測定藥物對稻紋枯病菌侵染離體蠶豆葉片的防治效果，后者以離體水稻葉鞘為組織材料，測定藥物對稻紋枯病菌侵染離體水稻葉鞘的防治效果。實際應用中，兩者都存在某些弊病。
[0005]蠶豆葉測定法仍有可能漏選那些在蠶豆上無效、而在水稻上有效的藥物，而且蠶豆葉較小，不利于進行藥物的作用過程跟蹤。水稻葉鞘測定法中，由于水稻各葉鞘屬于外葉鞘包內葉鞘并相互環抱式生長，試驗中取材葉鞘不夠方便；接種發病的均勻性和穩定性欠佳等。
【發明內容】
[0006]本發明的目的是提供一種便捷的防治稻紋枯病藥物的藥效測定方法。
[0007]本發明解決上述技術問題的技術方案如下:
[0008]一種防治稻紋枯病藥物的藥效測定方法，依據稻紋枯病菌也能侵染水稻離體葉片，且發病較為均勻和穩定的特性，利用一組簡單便利的器具，進行離體葉片的接種發病和藥物處理，測定藥物對稻紋枯病發病的防治效果，測定方法的步驟如下:
[0009]1.水稻葉片的培育準備:按一般方法種植水稻植株，常規水肥管理，培育至6葉期后使用。
[0010]2.主要器具準備:主要器具包括大方盤、小方盤、玻璃罩、和玻璃板；用潔凈劑將這些器具洗滌干凈后備用。
[0011]3.病菌的培養準備:將測定用的病菌菌株移植到PSA平板培養基上，PSA培養基為:馬鈴薯200g、蔗糖20g、瓊脂20g和水1000ml。在溫度30°C條件下培養至菌落剛長滿平板，取直徑為6mm打孔器在平板菌落外周打取大小一致的菌絲瓊脂圓塊，以此菌絲塊作為接種測定用的接種體。
[0012]4.防治藥物的配備:用清水將防治藥物溶解或稀釋，并將有效成分調配成需要測定的濃度，并以空白清水作無藥處理對照(CK)。
[0013]5.測定用離體葉片的準備:用干凈剪刀采集步驟I準備的水稻植株上完全展開的正常葉片，置入盛裝清水的干凈容器中帶回室內。取出步驟2備好的組件，將小方盤置于大方盤內的中間，取2個干凈的普通橡皮筋分別套在玻璃板的上下兩頭，并將玻璃板置于小方盤內架成穩定的傾斜狀態，然后往小方盤內注入清水。將采回的葉片基部朝下，平行插擺于玻璃板與橡皮筋之間，橡皮筋將葉片的兩端夾穩，葉片基端插入小方盤內的清水層內，剪除超出玻璃板上緣的葉片尾部。
[0014]6.藥物施用:用噴霧器將步驟4配備的待測藥液噴到步驟5備好的葉片上，直至葉片上均勻布滿霧滴為止。
[0015]7.接種病菌:用干凈鑷子挑取步驟3準備的菌絲塊貼放于步驟5準備好的離體葉片上。
[0016]8.施藥后或接種后的處置:取玻璃罩將小方盤以及盤內的離體葉片全部罩在大方盤上,并往大方盤內注入清水,使玻璃罩內部封閉并形成罩內穩定的高濕狀態；然后將整套裝置放于具備正常散射光的普通室內培養，培養溫度維持在在26°C ±1°C波動范圍。
[0017]9.變動實施步驟測定藥物防治效果的作用方式:通過改變步驟6與步驟7實施的先后次序，能實現測定藥物對病害的防治作用方式，如下:
[0018]A.先實施步驟6再到步驟7 ;或先操作步驟7，在菌絲生長侵染之前操作步驟6 ;結果能體現藥物防治的保護作用。
[0019]B.先實施步驟7，培養24小時發病后，再實施步驟6，結果能體現藥物防治的治療作用。
[0020]結果觀察調查:一般接種病菌24小時后，無藥物的對照處理出現清晰穩定的發病反應，有防治作用的藥物處理，與對照處理相比發病程度減輕或不發病；發病程度可用病斑高度(或稱病斑長度)的指標來衡量，病斑高度是指從接種點到病斑最前沿的距離；通過量化指標計算藥物的防治效果(藥效)。
[0021]防治效果(％)=(對照處理的病斑高度-藥物處理的病斑高度)X 100/對照處理的病斑高度
[0022]本發明的優點是:
[0023]I)接種發病較為穩定一致；藥效表現直觀清晰，結果重現性好，且查錄容易量化。
[0024]2)可避免出現有效藥物的漏選。
[0025]3)采用較長的葉片，便于跟蹤藥物在發病擴展過程中的作用。
[0026]4)測試耗時短，一般比葉鞘測定法提前I?2天。
[0027]6)離體葉片采樣方便，測定過程操作簡單易行。
[0028]7)室內操作，占空間少，局部條件控制方便，容易實現測定方法的標準化。
【專利附圖】
【附圖說明】[0029]圖1是本發明藥效測定用的配套器具。
[0030]圖中，大方盤a，小方盤b，玻璃板C，玻璃罩d。
[0031]A圖是用小金屬片把玻璃板c臨時架成穩定的傾斜狀態出圖是不用金屬片而直接用玻璃膠和一小塊玻璃將玻璃板c粘接成固定的傾斜狀態；C圖是用玻璃罩d將小方盤b以及盤上的玻璃板c罩在大方盤a上的側面觀；D圖是在C圖的玻璃板c上放置水稻葉片后的正面觀。
[0032]圖2是本發明在配套器具中的玻璃板上放置離體葉片及接種病菌后的正面觀。
[0033]圖3是本發明藥效測定結果示意圖。
[0034]圖中，A圖是無藥物處理的對照發病表現；B圖是無藥物處理和未接種病菌的空白對照；C圖是施藥處理的葉片發病輕的表現；D圖是施藥處理的葉片不發病的表現。
【具體實施方式】
[0035]下面結合附圖與實施例對本發明作進一步描述。
[0036]本發明利用稻紋枯病菌可侵染離體水稻葉片發病的特性，使用一組便利的配套器具，在離體稻葉上測試防治藥物對病菌侵染致病的防治作用。所用的配套器具如圖1所示，主要組件為大方盤、小方盤，傾斜放置的玻璃板、和玻璃罩；2個方盤為貯水用，玻璃板為承載葉片用，玻璃罩起封閉保濕用。使用時，由于葉片在玻璃板上被固定并整齊展開，如圖2所示，對葉片實施接種和施藥操作非常方便；而且玻璃罩的打開與罩回均未觸及罩內的試驗材料，因而可以根據需要反復開閉玻璃罩實施接種或施藥操作。本發明用的離體葉片在溫度為26°C 土1°C條件下，一般可維持7天以上的正常綠葉，試驗無需額外添加保鮮劑處理。
[0037]如圖2所示的葉片經接種稻紋枯病菌后，在26°C ±1°C溫度范圍內培養，無藥處理的對照葉片，一般接種24小時后開始發病，病斑沿著菌絲生長的方向不斷擴展，并形成較為清晰一致的壞死病斑，如圖3的A圖所示；而未接種病菌的葉片保持正常的綠葉，如圖3的B圖所示；經過接種病菌并施藥處理的葉片表現為發病輕或不發病，如圖3的C圖和D圖所示。
[0038]發病程度可用病斑高度(或稱病斑長度)的量化指標來衡量，病斑高度是指從接種點到病斑最前沿的距離；藥物的防治效果(藥效)可按如下公式計算:
[0039]防治效果(％)=(對照處理的病斑高度-藥物處理的病斑高度)X 100/對照處理的病斑高度
[0040]實施例1
[0041]應用本發明一種防治稻紋枯病藥物的藥效測定方法，以水稻品種中優679和稻紋枯病菌菌株Rs-1為材料，測定藥物井R霉素以不同有效濃度防治稻紋枯病的防治效果，按如下步驟實施操作:
[0042]1.水稻葉片的培育準備:按一般方法栽培水稻品種中優679，常規水肥管理，生長至6葉期后使用。
[0043]2.主要器具準備:測試用的主要器具包括:如圖1所示的大方盤a、小方盤b、玻璃板C、玻璃罩d等組件。本實施例器具的用材與大小:大方盤a為長X寬X高=40X30X3cm的普通方盤；小方盤b為長X寬X高=29 X 22 X 3cm的普通方盤；玻璃板c為24 X 24cm的普通玻璃板；玻璃罩d為長X寬X高=31 X 25X 20cm的有機玻璃罩；圖1的A圖中的薄金屬片，折鉤后長度為15cm。用潔凈劑將這些組件洗滌干凈后備用；
[0044]3.病菌的培養準備:將菌株Rs-1移植到PSA平板培養基上，PSA培養基為:馬鈴薯200g、蔗糖20g、瓊脂20g和水1000ml。在溫度30°C條件下培養至菌落剛長滿平板，取直徑為6mm打孔器在平板菌落外周打取大小一致的菌絲瓊脂圓塊，以此菌絲塊作為接種測定用的接種體。
[0045]4.防治藥物的配備:用清水將防治藥物20 %的井R霉素水溶粉劑(浙江錢江生物化學股份有限公司的產品)溶解，并將施用藥液的有效成分濃度調配為3個施用濃度:104.2 μ g/ml,6.1 μ g/ml, 1.2 μ g/ml ;其中104.2 μ g/ml為一般田間應用濃度；而另2個濃度6.1 μ g/ml和1.2 μ g/ml是處于防治效果易變的濃度范圍；以空白清水處理作無藥處理對照(CK)。
[0046]5.測定用離體葉片的準備:用干凈剪刀采集步驟I準備的水稻植株上完全展開的正常葉片，置入盛裝清水的大燒杯中帶回室內。取出步驟2備好的組件，將小方盤置于大方盤內的中間，取2個干凈的普通橡皮筋分別套在玻璃板的上下兩頭，并將玻璃板以傾斜狀態置于小方盤內，如圖1的B圖所示，或者按圖1的A圖方式用金屬片臨時架成穩定的傾斜狀態，然后往小方盤內注入深厚清水(約占小方盤深度的75%)。將采回的葉片基部朝下，平行插擺于玻璃板與橡皮筋之間，橡皮筋將葉片的兩端夾穩，葉片基端插入小方盤內的清水層內，然后將超出玻璃板上緣的尾部葉片剪除，如圖2所示。
[0047]6.藥物施用:用手持噴霧器將步驟4配備的測試藥液噴到步驟5備好的葉片上，直至葉片上均勻布滿霧滴為止。
[0048]7.接種病菌:用干凈鑷子挑取步驟3準備的菌絲塊貼放于步驟6操作完備的離體葉片上，如圖2所示。
[0049]8.施藥后和接種后的處置:取玻璃罩將小方盤以及盤內的離體葉片全部罩在大方盤上,并往大方盤內注入薄層清水,使玻璃罩內部封閉并形成罩內穩定的高濕狀態；然后將整套裝置放于具備正常散射光的普通室內培養，培養溫度維持在26°C ±1°C波動范圍。
[0050]結果:接種培養3天后，無藥處理對照葉片發病病斑高度達11.13cm,而施用井岡霉素藥液處理的葉片發病減輕，表現出有防治效果，在生產使用濃度下(104.2 μ g/ml),顯示出高效的防治作用(93.80%);當藥液有效濃度減少，防治效果跟著下降(見表1)。本實施例的防治藥物井網霉素是在病菌侵染之前施用，因而結果體現的是井網霉素的保護作用。
[0051]表1用本發明的方法測定藥物井R霉素在不同濃度下的防治效果
【權利要求】
1.一種防治稻紋枯病藥物的藥效測定方法，其特征在于，利用一組簡單便利的器具，在離體水稻葉片上進行接種發病和藥物處理，測定藥物對稻紋枯病的防治效果，方法的步驟如下: 1)水稻葉片的培育準備:按一般方法種植水稻植株，常規水肥管理，培育至6葉期后使用； 2)器具準備:器具包括大方盤、小方盤、玻璃罩、和玻璃板；用潔凈劑將這些器具洗滌干凈后備用； 3)病菌的培養準備:將測定用的病菌菌株移植到PSA平板培養基上，PSA培養基為:馬鈴薯200g、蔗糖20g、瓊脂20g和水1000ml，在溫度30°C條件下培養至菌落剛長滿平板，取直徑為6mm打孔器在平板菌落外周打取大小一致的菌絲瓊脂圓塊，以此菌絲塊作為接種測定用的接種體； 4)防治藥物的配備:用清水將防治藥物溶解或稀釋，并將有效成分調配成需要測定的濃度，并以空白清水作無藥處理對照(CK); 5)測定用離體葉片的準備:用干凈剪刀采集步驟I)準備的水稻植株上完全展開的正常葉片，置入盛裝清水的干凈容器中帶回室內；取出步驟2)備好的組件，將小方盤置于大方盤內的中間，取2個干凈的普通橡皮筋分別套在玻璃板的上下兩頭，并將玻璃板置于小方盤內架成穩定的傾斜狀態，然后往小方盤內注入清水；將采回的葉片基部朝下，平行插擺于玻璃板與橡皮筋之間，橡皮筋將葉片的兩端夾穩，葉片基端插入小方盤內的清水層內，剪除超出玻璃板上緣的葉片尾部； 6)藥物施用:用噴霧器將步驟4)配備的待測藥液噴到步驟5)備好的葉片上，直至葉片上均勻布滿霧滴為止； 7)接種病菌:用干凈鑷子挑取步驟3)準備的菌絲塊貼放于步驟5)準備好的離體葉片上； 8)施藥后或接種后的處置:取玻璃罩將小方盤以及盤內的離體葉片全部罩在大方盤上,并往大方盤內注入清水,使玻璃罩內部封閉并形成罩內穩定的高濕狀態；然后將整套裝置放于具備正常散射光的普通室內培養，培養溫度維持在26°C ±1°C波動范圍； 9)變動實施步驟測定藥物防治效果的作用方式:通過改變步驟6)與步驟7)實施的先后次序，能實現測定藥物對病害的防治作用方式，如下: A.先實施步驟6)再到步驟7);或先操作步驟7)，在菌絲生長侵染之前操作步驟6);結果能體現藥物防治的保護作用； B.先實施步驟7)，培養24小時發病后，再實施步驟6)，結果能體現藥物防治的治療作用； 結果觀察調查:一般接種病菌24小時后，無藥物的對照處理出現清晰穩定的發病反應，有防治作用的藥物處理，與對照處理相比發病程度減輕或不發病；發病程度可用病斑高度(或稱病斑長度)的量化指標來衡量，病斑高度是指從接種點到病斑最前沿的距離；通過量化指標計算藥物的防治效果(藥效); 防治效果(％)=(對照處理的病斑高度-藥物處理的病斑高度)X 100/對照處理的病斑高度。
【文檔編號】G01N33/15GK103884825SQ201410133494
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年3月29日 優先權日:2014年3月29日
【發明者】張君成, 郭地, 時婷婷 申請人:廣西大學
專業數控銑床產品供應商
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