一種牛樟芝保健食品中腺甘含量測定的方法
【專利摘要】本發明涉及一種牛樟芝保健食品中腺甘含量測定的方法。所述的測定方法包括以下步驟：稱取腺苷標準品配制腺甘標準溶液，將其稀釋成不同濃度的校準曲線溶液，取樣品適量并加溶劑進行超聲波提取，制得樣品提取液，再將樣品提取液進行超聲混勻并過濾制得待測樣品溶液，最后對不同濃度的校準曲線溶液及待測樣品溶液分別采用HPLC進行測定，并計算腺甘含量。本發明對標準品及待測樣品統一采用一種溶劑進行配制，且將流動相限定為乙腈-磷酸二氫鉀體系，在對待測樣品進行腺甘提取時采用15%-20%的甲醇，均可使樣品中主成分分離效果好，色譜圖可呈現對稱峰形，雜質峰影響小，可明顯提高檢測結果的準確度及靈敏度。
【專利說明】一種牛樟芝保健食品中腺甘含量測定的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物檢測領域，具體涉及一種牛樟芝保健食品中腺甘含量測定的方 法。
【背景技術】
[0002] 牛樟芝（Taiwanofungus camphorates)，又名牛樟燕或樟芝，是一種原產于我 國臺灣省的珍稀藥用菌。牛樟芝主要存在于我國臺灣省的名貴樹木牛樟樹cinnamomum kanehirae hayata的樹干空洞內。現代研究表明樟芝含有多種生理活性物質，如維生素、 固醇類、麥角留醇、多糖、三萜類、超氧化物歧化酶S0D、腺苷、小分子蛋白質等 。其中腺甘是一種嘌呤核苷，是核酸的基本結構單位之一，由糖苷鍵連接腺嘌呤和核糖 而成，它是機體代謝的一種中間產物，具有多種生理功能，如擴張血管、降低竇房結的自 律性、減慢房室傳導、抑制腎素分泌、降低體外循環后肺缺血一再灌注損傷，有效改善右心 功能，對再灌注心臟具有保護作等作用。因此，有許多廠商開始投注大量研究資源開發牛樟 芝相關醫藥品或保健品。為了進一步嚴格控制市售牛樟芝保健品的質量，確保其保健功效， 急需尋找一種可以對牛樟芝保健產品中腺甘進行檢測的方法，以期為牛樟芝保健產品的質 量控制提供保障，也能更好的保障消費者的合法權益。目前，對于保健產品中腺甘的測定主 要依據《保健食品檢驗與評價技術規范》2003年 版中規定的HPLC法，但采用該法測定牛樟芝保健品中的腺甘，靈敏度及準確度較差。 為此，本發明對傳統的HPLC法進行了改進，可明顯提高測定結果的準確度與靈敏度。
【發明內容】
[0003] 針對上述現有技術的不足，本發明提供一種可對牛樟芝保健食品中腺甘含量進行 準確測定的方法。
[0004] 本發明的技術方案如下： 一種牛樟芝保健食品中腺甘含量測定的方法，包括以下步驟： (1) 配制腺甘標準溶液：準確稱取腺苷標準品10_30mg加至25ml試管中，向試管中加 溶劑，配制成濃度為0. 4-1. 2mg/ml的腺甘標準溶液； (2) 腺甘校準曲線溶液配制：將步驟（1)中配制的腺甘標準溶液進一步稀釋成不同濃 度的校準曲線溶液； (3) 樣品提取：取待測樣品50-100mg進行粉碎，準確稱取粉碎后的樣品20-50mg置入 25ml試管中，加入溶劑進行超聲提取，制得待測樣品提取液； (4) 配制待測樣品溶液：將步驟（3)中制得的樣品提取液5-10ml加入25ml的試管中， 加入溶劑定容至刻度，超聲混勻，離心，〇. 45um微孔濾膜過濾，制得待測樣品溶液； (5) HPLC測定：將步驟（2)中配制的不同濃度的校準曲線溶液及步驟（4)中配的待測 樣品溶液分別采用HPLC進行測定，并繪制標準工作曲線，計算腺甘含量。
[0005] 步驟（2)中所述的不同濃度的校準曲線溶液其濃度分別為0. 4yg/ml，2. Oyg/ ml, 4. Ο μ g/ml, 20. 0 μ g/ml, 80. 0 μ g/ml 〇
[0006] 步驟（1)、（2)、（4)中所加入的溶劑選自50%-100%的甲醇或去離子水中的一種 步驟（3)中中所述的樣品提取時加入的溶劑為15%_20%的甲醇。
[0007] 步驟（3)中所述的超聲提取時間為5-10min，步驟（4)中所述的超聲混勻時間為 5-10min〇
[0008] 步驟（4)中所述的離心時間為20_30min，離心速度為3000-5000r/min。
[0009] 步驟（5)中所述的HPLC的參數為：Diamonsil C18色譜柱，4· 6X 150) mm, 5um;柱 溫：25°C ;流速：l.Oml/min;進樣量：10μ 1紫外檢測器：波長254nm;流動相：10% 乙腈，90%磷酸二氫鉀水溶液。
[0010] 所述的磷酸二氫鉀水溶液的濃度為0. 005-0. 02 mol/L。
[0011] 步驟（5)中所述的腺甘含量計算具體公式為：X=(CXV)/mX1000; X:待測樣品中 腺甘含量（mg/g) ;C :從標準工作曲線得到的待測樣品溶液中腺甘濃度（ug/ml) ;V :待測樣 品定容體積；m :待測樣品的質量。
[0012] 本發明與現有技術相比，有益效果體現在以下幾點： 1.對于保健產品中腺甘的測定主要依據《保健食品檢驗與評價技術規范》2003年版中 規定的HPLC法，但在《保健食品檢驗與評價技術規范》中，規定標準溶液以純水配制，樣品 提取溶劑為60%乙醇，二者進樣溶劑不一致，導致檢測結果準確度低。研究表明，50%以上的 甲醇做為溶劑，對腺甘的提取效果好，且在HPLC測定含量時，其色譜峰為有尖峰的對稱波 形，因此，可提高方法靈敏度，有利于腺甘與樣品中其他成分的分離。
[0013] 2.本發明中將校準曲線溶液濃度分別配制為0.4 μ g/ml，2.0 μ g/ml，4.0 μ g/ ml，20. 0 μ g/ml，80. 0 μ g/ml，適合牛樟芝保健品中腺甘的定量檢測，多次測定結果線性相 關系數達0.999。
[0014] 3. HPLC法測定腺甘含量多以甲醇-磷酸二氫鉀體系為流動相，但分析時間較少， 本發明將流動相限定為乙腈-磷酸二氫鉀體系，且將磷酸二氫鉀濃度限定為〇. 005-0. 02 mol/L，分離效果最好，分析時間也最短。
[0015] 4.本發明中在定容時選擇的溶劑為50%以上的甲醇，這樣使得形成的色譜峰有尖 峰且對稱，而在樣品提取時，溶劑選擇的為15%-20%的甲醇，樣品中腺甘提取效果最好，色 譜圖中雜質峰影響最小。
【具體實施方式】
[0016] 下面結合實施例對本發明做進一步說明。
[0017] 實施例1 一種牛樟芝保健食品中腺甘含量測定的方法，包括以下步驟： (1)配制腺甘標準溶液：準確稱取腺苷標準品10_30mg加至25ml試管中，向試管中加 入50%的甲醇，配制成濃度為0. 4mg/ml的腺甘標準溶液； (2 )腺甘校準曲線溶液配制：將步驟（1)中配制的腺甘標準溶液進一步稀釋成0. 4 μ g/ ml, 2· 0 μ g/ml, 4· 0 μ g/ml, 20. 0 μ g/ml, 80. 0 μ g/ml 不同濃度的校準曲線溶液； (3)樣品提取：取待測樣品50mg進行粉碎，準確稱取粉碎后的樣品20mg置入25ml試 管中，加入15%的甲醇進行超聲提取5min，制得待測樣品提取液； (4) 配制待測樣品溶液：將步驟（3)中制得的樣品提取液5-10ml加入25ml的試管中， 加入50%的甲醇定容至刻度，超聲混勻5min，以3000r/min的離心速度離心20min，，0. 45um 微孔濾膜過濾，制得待測樣品溶液； (5) 冊1^：測定：冊^：的參數為：0丨3111〇118丨1(：18色譜柱，4.6\150)_，511111 ;柱 溫：25°C ;流速：l.Oml/min;進樣量：10μ 1紫外檢測器：波長254nm;流動相：10% 乙腈，90%濃度為0. 005mol/L的磷酸二氫鉀水溶液；將步驟（2)中配制的不同濃度的校準曲 線溶液及步驟（4)中配的待測樣品溶液分別采用HPLC進行測定，并繪制標準工作曲線，計 算腺甘含量。
[0018] 實施例1 一種牛樟芝保健食品中腺甘含量測定的方法，包括以下步驟： (1) 配制腺甘標準溶液：準確稱取腺苷標準品30mg加至25ml試管中，向試管中加入 100%的甲醇，配制成濃度為1. 2mg/ml的腺甘標準溶液； (2) 腺甘校準曲線溶液配制：將步驟（1)中配制的腺甘標準溶液進一步稀釋成0.4yg/ ml, 2· Ο μ g/ml, 4· Ο μ g/ml, 20. Ο μ g/ml, 80. Ο μ g/ml 不同濃度的校準曲線溶液； (3) 樣品提取：取待測樣品lOOmg進行粉碎，準確稱取粉碎后的樣品50mg置入25ml試 管中，加入20%的甲醇進行超聲提取lOmin，制得待測樣品提取液； (4) 配制待測樣品溶液：將步驟（3)中制得的樣品提取液5-10ml加入25ml的試管中， 加入100%的甲醇定容至刻度，超聲混勻lOmin，以3000-5000r/min的離心速度離心30min， 0. 45um微孔濾膜過濾，制得待測樣品溶液； (5) 冊1^：測定：冊^：的參數為：0丨3111〇118丨1(：18色譜柱，4.6\150)_，511111 ;柱 溫：25°C ;流速：l.Oml/min;進樣量：10μ 1紫外檢測器：波長254nm;流動相：10% 乙腈，90%濃度為0.02 mol/L的磷酸二氫鉀水溶液；將步驟（2)中配制的不同濃度的校準曲 線溶液及步驟（4)中配的待測樣品溶液分別采用HPLC進行測定，并繪制標準工作曲線，計 算腺甘含量。
[0019] 實施例3 一種牛樟芝保健食品中腺甘含量測定的方法，包括以下步驟： (1)配制腺甘標準溶液：準確稱取腺苷標準品20mg加至25ml試管中，向試管中加入去 離子水，配制成濃度為0. 8mg/ml的腺甘標準溶液； (2 )腺甘校準曲線溶液配制：將步驟（1)中配制的腺甘標準溶液進一步稀釋成0. 4 μ g/ ml, 2· 0 μ g/ml, 4· 0 μ g/ml, 20. 0 μ g/ml, 80. 0 μ g/ml 不同濃度的校準曲線溶液； (3) 樣品提取：取待測樣品80mg進行粉碎，準確稱取粉碎后的樣品40mg置入25ml試 管中，加入18%的甲醇進行超聲提取8min，制得待測樣品提取液； (4) 配制待測樣品溶液：將步驟（3)中制得的樣品提取液5-10ml加入25ml的試管 中，加入去離子水定容至刻度，超聲混勻5-10min，以4000r/min的離心速度離心25min，， 0. 45um微孔濾膜過濾，制得待測樣品溶液； (5) 冊1^：測定：冊^：的參數為：0丨3111〇118丨1(：18色譜柱，4.6\150)_，511111 ;柱 溫：25°C ;流速：l.Oml/min;進樣量：10μ 1紫外檢測器：波長254nm;流動相：10% 乙腈，90%濃度為0.01 mol/L的磷酸二氫鉀水溶液；將步驟（2)中配制的不同濃度的校準曲 線溶液及步驟（4)中配的待測樣品溶液分別采用HPLC進行測定，并繪制標準工作曲線，計
【權利要求】
1. 一種牛樟芝保健食品中腺甘含量測定的方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 配制腺甘標準溶液：準確稱取腺苷標準品10-30mg加至25ml試管中，向試管中加 溶劑，配制成濃度為0. 4-1. 2mg/ml的腺甘標準溶液； (2) 腺甘校準曲線溶液配制：將步驟（1)中配制的腺甘標準溶液進一步稀釋成不同濃 度的校準曲線溶液； (3) 樣品提取：取待測樣品50-100mg進行粉碎，準確稱取粉碎后的樣品20-50mg置入 25ml試管中，加入溶劑進行超聲提取，制得待測樣品提取液； (4) 配制待測樣品溶液：將步驟（3)中制得的樣品提取液5-10ml加入25ml的試管中， 加入溶劑定容至刻度，超聲混勻，離心，〇. 45um微孔濾膜過濾，制得待測樣品溶液； (5) HPLC測定：將步驟（2)中配制的不同濃度的校準曲線溶液及步驟（4)中配的待測 樣品溶液分別采用HPLC進行測定，并繪制標準工作曲線，計算腺甘含量。
2. 根據權利要求1所述的牛樟芝保健食品中腺甘含量測定的方法，其特征在于，步 驟（2)中所述的不同濃度的校準曲線溶液其濃度分別為0. 4μ g/ml，2. 0μ g/ml，4. 0μ g/ ml, 20. 0 μ g/ml, 80. 0 μ g/ml 〇
3. 根據權利要求1所述的牛樟芝保健食品中腺甘含量測定的方法，步驟（1)、（2)、（4) 中所加入的溶劑選自50%-100%的甲醇或去離子水中的一種。
4. 根據權利要求1所述的牛樟芝保健食品中腺甘含量測定的方法，其特征在于，步驟 (3)中中所述的樣品提取時加入的溶劑為15%-20%的甲醇。
5. 根據權利要求1所述的牛樟芝保健食品中腺甘含量測定的方法，其特征在于，步驟 (3) 中所述的超聲提取時間為5-10min，步驟（4)中所述的超聲混勻時間為5-10min。
6. 根據權利要求1所述的牛樟芝保健食品中腺甘含量測定的方法，其特征在于，步驟 (4) 中所述的離心時間為20-30min，離心速度為3000-5000r/min。
7. 根據權利要求1所述的牛樟芝保健食品中腺甘含量測定的方法，其特征在于，步驟 (5) 中所述的HPLC的參數為：Diamonsil C18色譜柱，4.6X150) mm，5um;柱溫：25°C;流 速：l.Oml/min;進樣量：10μ1紫外檢測器：波長254nm;流動相：10%乙腈，90%磷酸 二氫鉀水溶液。
8. 根據權利要求1所述的牛樟芝保健食品中腺甘含量測定的方法，其特征在于，所述 的磷酸二氫鉀水溶液的濃度為〇. 005-0. 02 mol/L。
9. 根據權利要求1所述的牛樟芝保健食品中腺甘含量測定的方法，其特征在于，步驟 (5)中所述的腺甘含量計算具體公式為：X=(CXV)/mX1000; X:待測樣品中腺甘含量（mg/ g) ;C :從標準工作曲線得到的待測樣品溶液中腺甘濃度（ug/ml) ;V :待測樣品定容體積；m : 待測樣品的質量。
【文檔編號】G01N30/88GK104111302SQ201410396715
【公開日】2014年10月22日 申請日期:2014年8月13日 優先權日:2014年8月13日
【發明者】劉巴寧, 鄭安喬 申請人:中山安蕎生物科技有限公司
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