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專利名稱：一種基于硝酸纖維素膜的便捷癌細(xì)胞捕獲芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物分析與檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)捕獲芯片。
背景技術(shù)：
循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)是指那些從腫瘤組織上脫落下來并進(jìn)入血液全身循環(huán)的癌細(xì)胞。它由普通癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來，并且隨時(shí)可以通過逆分化再次長出腫瘤組織，因此它與癌癥的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移密 切相關(guān)，是反映癌癥病情發(fā)展的風(fēng)向標(biāo)，對其進(jìn)行詳盡研究對于癌癥的早期診斷與治療具有決定性的意義。人體外周血液中CTC的含量很低，一般不會超過100個/mL,而其中的紅細(xì)胞白細(xì)胞等背景干擾細(xì)胞則高達(dá)IO9個，這對現(xiàn)有的分離分析方法來說是一個巨大的挑戰(zhàn)。總的來說，目前的研究亟需解決兩個方面的問題:一是怎樣把數(shù)量如此少的CTC從背景如此復(fù)雜的人血中分離出來？ 二是如何對分離的少量CTC進(jìn)行高靈敏的檢測計(jì)數(shù)和后續(xù)的生化分析。近十年來，關(guān)于循環(huán)腫瘤細(xì)胞的分離捕集研究受到了國內(nèi)外的廣泛關(guān)注，一系列研究成果也相繼被報(bào)道。美國強(qiáng)生公司推出了基于免疫磁珠分離的循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測與分析系統(tǒng)(CellSearchTM)，率先得到了美國食品藥品管理局(FDA)的認(rèn)證并已廣泛用于臨床診斷，不過費(fèi)用昂貴，而且假陽性率比較高。近來微流控芯片成為了 CTC分離研究的熱點(diǎn)，Nagrath等報(bào)道了基于EpCAM抗體組裝的微流體芯片陣列，對相應(yīng)的循環(huán)腫瘤細(xì)胞具有很高的捕獲效率；HOSOkawa等基于癌細(xì)胞與正常細(xì)胞的形態(tài)差異，制成了體積排阻分離裝置，擴(kuò)展了 CTC研究的思路；國內(nèi)的王樹濤也基于硅板表面的納米纖毛與癌細(xì)胞表面的結(jié)構(gòu)相互作用，開發(fā)了一種硅板芯片，其對癌癥病人血液樣本的檢測效果要好于當(dāng)前的Ce 11 Search 系統(tǒng)。目前報(bào)導(dǎo)的這些關(guān)于CTC芯片的最新研究成果，其對CTC的捕集效率較高，假陽性也控制得不錯，但是芯片的制備過程大多太復(fù)雜，而且重復(fù)性較差，很難大規(guī)模生產(chǎn)，嚴(yán)重妨礙了其在臨床應(yīng)用上的前景；另外由于芯片孔道的尺寸限制，對病人血液的分析耗時(shí)很長，而且捕獲的癌細(xì)胞也不方便進(jìn)行后續(xù)的再培養(yǎng)等生化分析。基于以上認(rèn)識，目前CTC的研究真正需要的是一種設(shè)計(jì)新穎，制備便捷，分析快速高效的CTC捕獲芯片。最近各種膜基底平臺開始廣受關(guān)注，因此我們設(shè)計(jì)研究了一種以硝酸纖維素膜(NCM)為基底的CTC高效捕集芯片。硝酸纖維素膜常用于免疫印跡(westernblotting)等生化分析中，利用其對蛋白質(zhì)優(yōu)良的吸附效能，可以方便地吸附上抗體進(jìn)行CTC特異性捕獲，簡便高效；另外還可利用其良好的生物親和性和在蛋白質(zhì)組學(xué)分析中的特殊作用，對捕集到的癌細(xì)胞進(jìn)行生物學(xué)再培養(yǎng)和單細(xì)胞蛋白質(zhì)組的研究。由于其在生物分析上的巨大優(yōu)勢和潛能，我們采用硝酸纖維素膜為基底吸附固定抗體來制備CTC芯片。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種制備簡便，對癌細(xì)胞捕集效率高，成本低易于大規(guī)模推廣應(yīng)用的CTC捕獲芯片。本發(fā)明提供的CTC捕獲芯片，以硝酸纖維素膜為主體，其透明軟化后固定在PMMA有機(jī)玻璃板上，然后直接吸附固定上抗體而組成，可以用來進(jìn)行癌細(xì)胞的特異性捕集。本發(fā)明中，硝酸纖維素膜的孔徑為0.2-0.45 Mm。本發(fā)明以硝酸纖維素膜為基底，其具有良好的生物親和性，廣泛應(yīng)用于westernblotting等生化分析，適宜作為生物分析檢測的平臺；同時(shí)硝酸纖維素膜具有對蛋白質(zhì)天然的吸附性能，因而可以直接物理吸附固定抗體，相比于化學(xué)結(jié)合的方法更為便捷，效率也更高；硝酸纖維素膜在乙醇中浸泡處理后會變軟變透明，可以方便地固定在PMMA基板上，同時(shí)也便于對捕獲到的癌細(xì)胞進(jìn)行光學(xué)檢測。本發(fā)明的CTC芯片的制備步驟如下:
(1)將商品化的硝酸纖維素膜切成1-3CmX 1-3 cm的小塊,然后放入純乙醇中浸泡3-15 S，讓其軟化變透明，并平鋪在預(yù)先剪裁好的PMMA平板上自然風(fēng)干，裝配制作出芯片基底；
(2)在吸附抗體以前，芯片基底需要在含10%-30%乙腈的1-5mM PBS緩沖液中浸泡
0.5-1 h活化；然后把20-60 μ L抗體(濃度為0.5 μ g/μ L)溶解在200 μ L含10%_30%質(zhì)量乙腈的1-5 mM PBS緩沖液中，均勻滴加在CTC芯片基底上，在37 °C下反應(yīng)0.5-1 h，利用靜電作用和疏水作用讓抗體吸附固定在CTC芯片上；然后用PBS緩沖液洗去多余的抗體，再加上50 μ L的BSA溶液(質(zhì)量濃度為0.1%-0.5%)封端半小時(shí)，以降低其對癌細(xì)胞的非特異性吸附。制備好的CTC芯片保存在4 °C冰箱備用。本發(fā)明CTC芯片用于捕獲癌細(xì)胞的過程如下:
把非小肺癌細(xì)胞NC1-H 1650培養(yǎng)收集起來后，用PBS稀釋成10-100個/ μ L的濃度，滴加一定數(shù)量的癌細(xì)胞液滴于CTC芯片上，在37 °C恒溫孵育箱中孵育0.5-1 h，PBS洗去未捕獲的癌細(xì)胞，然后進(jìn)行檢測計(jì)數(shù)。為了模擬病人血液中癌細(xì)胞的捕集，向1-5 mL新鮮采集的健康人外周全血樣品中加入100-20000個癌細(xì)胞，然后用0.15 M NH4Cl-K2CO3進(jìn)行紅細(xì)胞裂解，離心棄去上清，取下層單核細(xì)胞與CTC芯片孵育0.5-1 h，PBS沖洗后進(jìn)行計(jì)數(shù)檢測。本發(fā)明中所選用的抗體具有高度的特異性，使用FITC (異硫氰酸熒光素)熒光標(biāo)記的抗體結(jié)合目標(biāo)癌細(xì)胞并進(jìn)行流式分析，發(fā)現(xiàn)其對非小肺癌細(xì)胞NC1-H1650的結(jié)合特異性達(dá)到99.9%，而對其他陰性對照細(xì)胞的非特異性結(jié)合還不到0.1%。CTC芯片抗體吸附量也很大，通過用高效毛細(xì)管電泳HPCE來對比分析芯片吸附前后的抗體溶液，可計(jì)算出抗體吸附量為10 Pg/cm2，這么高的抗體結(jié)合也保證了芯片對癌細(xì)胞的捕獲效率。在對PBS緩沖液中的CTC進(jìn)行捕集時(shí)，捕獲效率可達(dá)70% ;在I mL全血中加入500個CTC進(jìn)行實(shí)際樣品模擬分析，最終檢測效率也超過30%，充分證明了我們的CTC芯片技術(shù)指標(biāo)上達(dá)到了實(shí)際應(yīng)用的要求，因而具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。


圖1為CTC芯片的制備和癌細(xì)胞捕獲整體流程示意圖。圖2為抗體特異性結(jié)合癌細(xì)胞的流式分析圖。圖3為CTC芯片實(shí)物以及癌細(xì)胞捕獲效果圖。其中，a.連接了抗體的芯片捕獲的細(xì)胞；b.未連接抗體芯片的對照實(shí)驗(yàn)；c.同一芯片上是否連接抗體的細(xì)胞對照捕獲；d.制備好的CTC芯片圖片。
圖4為不同孵育時(shí)間下CTC的捕獲效率。圖5為不同細(xì)胞數(shù)量下CTC的捕獲效率。
具體實(shí)施例方式通過實(shí)施例對本發(fā)明提供的CTC捕獲芯片制備過程及其在癌細(xì)胞捕集中的應(yīng)用作出進(jìn)一步說明。實(shí)施例1 CTC捕獲芯片的制備
商品化的硝酸纖維素膜切成I CmXl cm的小塊,然后放入純乙醇中浸泡10 s,讓其軟化透明，并平鋪在預(yù)先剪裁好的PMMA平板上自然風(fēng)干，裝配成芯片基底。在吸附抗體以前，需要在含10%乙腈的PBS緩沖液中浸泡一小時(shí)活化；然后把20 μ L抗體(0.5 yg/μ L)溶解在200 UL含10%乙腈的I mM PBS緩沖液中，均勻滴加在CTC芯片上，并在37 °C下反應(yīng)
0.5 h，然后用PBS洗去多余的抗體；再加上50 μ L的BSA溶液(0.5%)封端半小時(shí)，以降低其對癌細(xì)胞的非特異性吸附。制得的CTC芯片保存在4 °C冰箱備用。實(shí)施例2 CTC芯片對PBS緩沖液中的癌細(xì)胞進(jìn)行捕獲
非小肺癌細(xì)胞NC1-H1650于含5%(v/v)二氧化碳的37 °C恒溫培養(yǎng)箱中，使用添加10%(v/v)胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細(xì)胞培養(yǎng)成熟后用0.25% (w/w) trypsin-EDTA孵育3 min消化下來，并用PB S緩沖液洗滌3次后配制成一定濃度的細(xì)胞懸液。把細(xì)胞液滴加在CTC芯片上，放入37 1:恒溫箱孵育一定時(shí)間后，用PBS洗去未捕獲的細(xì)胞，然后進(jìn)行顯微鏡成像計(jì)數(shù)和后續(xù)的檢測。實(shí)施例3調(diào)整CTC芯片與癌細(xì)胞接觸孵育的時(shí)間分別為5 min、15 min、30min、45 min和I h，然后對捕獲到的癌細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，結(jié)果見圖4所示。實(shí)施例4調(diào)整加入CTC芯片上的癌細(xì)胞數(shù)量分別為10000、2000、400、100、20個，然后對捕獲的癌細(xì)胞計(jì)數(shù)并計(jì)算捕獲效率，結(jié)果見圖5所示。實(shí)施例5 CTC芯片對血液樣品中癌細(xì)胞的捕集
為模擬癌癥病人實(shí)際血樣中CTC的檢測，我們向I mL新鮮采集的人外周全血樣品中加入500個癌細(xì)胞，然后加入9 mL 0.15 M NH4C1-K2C03紅細(xì)胞裂解液，室溫放置15 min讓血液中紅細(xì)胞充分裂解，以減少癌細(xì)胞捕獲的干擾；離心棄去上清，取下層沉積的單核細(xì)胞與CTC芯片孵育0.5 h，PBS沖洗未特異性吸附的血細(xì)胞后進(jìn)行計(jì)數(shù)檢測。實(shí)施例6抗體與癌細(xì)胞結(jié)合特異性考察
向溶于PBS的NC1-H1650細(xì)胞懸液中加入FITC熒光修飾的EpCAM抗體，在37 °C孵育反應(yīng)0.5 h后,離心3次洗去未充分結(jié)合的抗體,然后把熒光標(biāo)記的癌細(xì)胞進(jìn)入流式分析，檢測結(jié)合效率。
權(quán)利要求
1.一種CTC捕獲芯片，其特征在于，以硝酸纖維素膜為主體，其透明軟化后固定在PMMA有機(jī)玻璃板上，然后直接吸附固定上抗體而組成。
2.如權(quán)利要求1所述的CTC捕獲芯片，其特征在于，所述硝酸纖維素膜的孔徑為0.2-0.45μιτι ο
3.—種如權(quán)利要求1所述的CTC捕獲芯片的制備方法，其特征在于具體步驟如下: (1)將商品化的硝酸纖維素膜切成1-3CmX 1-3 cm的小塊,然后放入純乙醇中浸泡3-15 S，讓其軟化變透明，并平鋪在預(yù)先剪裁好的PMMA平板上自然風(fēng)干，裝配制作出芯片基底； (2)在吸附抗體以前，芯片基底需要在含10%-30%乙腈的1-5mM PBS緩沖液中浸泡0.5-1 h活化；然后把濃度為0.5 Ug/μ L的20-60 μ L抗體溶解在200 μ L含10%_30%乙腈的1-5 mM PBS緩沖液中，均勻滴加在CTC芯片基底上，在37 °C下反應(yīng)0.5-1 h，利用靜電作用和疏水作用讓抗體吸附固定在CTC芯片上；然后用PBS緩沖液洗去多余的抗體，再加上質(zhì)量濃度為0.1%-0.5%的50 μ L的BSA溶液封端0.5-1 h。
4.如權(quán)利要求1所述的CTC捕獲芯片在癌細(xì)胞捕獲實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用，其特征在于把非小肺癌細(xì)胞NC1-H1650培養(yǎng)收集起來后，用PBS稀釋成10-100個/ μ L的濃度，滴加一定數(shù)量的癌細(xì)胞液滴于CTC芯片上，在37 °C恒溫孵育箱中孵育0.5-1 h，PBS洗去未捕獲的癌細(xì)胞，然后進(jìn)行檢測計(jì)數(shù)。`
5.一種利用如權(quán)利要求1所述的CTC捕獲芯片來模擬人全血中CTC檢測計(jì)數(shù)的方法，其特征在于向1-5 mL新鮮采集的健康人外周全血樣品中加入100-20000個癌細(xì)胞，然后用`0.15 M冊14(:1-1(20)3進(jìn)行紅細(xì)胞裂解，離心棄去上清，取下層單核細(xì)胞與CTC芯片孵育0.5-1h，PBS沖洗后進(jìn)行計(jì)數(shù)檢測。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物分析與檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)捕獲芯片及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明CTC芯片以硝酸纖維素膜為主體，利用其對蛋白質(zhì)的超強(qiáng)吸附能力來固定抗體，進(jìn)而特異性捕集血液中的癌細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本CTC芯片對非小肺癌細(xì)胞NCI-H1650具有很高的捕獲效能，并成功分離檢測出了人全血中的微量癌細(xì)胞。本發(fā)明新穎便捷，實(shí)用高效，具有巨大的臨床推廣應(yīng)用潛力。
文檔編號G01N33/531GK103235124SQ20131013967
公開日2013年8月7日 申請日期2013年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月22日
發(fā)明者高明霞, 張祥民, 張鵬 申請人:復(fù)旦大學(xué)