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特異性多肽修飾的比色傳感器及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種特異性多肽修飾的比色傳感器及其制備方法，該比色傳感器用于銅離子的檢測。該傳感器利用金-巰鍵使特異性多肽修飾到金納米顆粒表面，加入待測銅離子后，銅離子使特異性多肽構(gòu)象發(fā)生改變，由α螺旋變?yōu)棣抡郫B，金納米顆粒借助表面修飾特異性多肽形成的β折疊片段互相結(jié)合聚集，從而改變?nèi)芤旱奈舛炔a(chǎn)生顏色差異。本發(fā)明首次利用特異性多肽修飾的金納米顆粒對銅離子進(jìn)行檢測，該特異性多肽修飾的金納米顆粒比色傳感器對銅離子有很高的靈敏性、簡便性和專一性，檢測范圍較廣，對飲用水、血清、河流、污水等溶液中銅離子含量的檢測有潛在的應(yīng)用價值，操作方便，靈敏度高，應(yīng)用前景廣泛。
【專利說明】特異性多肽修飾的比色傳感器及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種比色傳感器及其制備方法，特別是一種特異性多肽修飾的比色傳感器及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002]銅是動植物體內(nèi)必需的一種微量重金屬元素。在機體中，適量的銅在能量代謝、氧氣運輸和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生理過程中具有重要的作用。但是，銅在機體內(nèi)含量過高就會給生命帶來危害，機體內(nèi)過多的銅可能導(dǎo)致一系列神經(jīng)退行性疾病，比如:緬克斯綜合征、威爾森氏綜合征和阿茲海默癥等。美國環(huán)境保護(hù)局已規(guī)定飲用水中銅元素含量的安全界限為1.33ppm(約20μΜ)，我國國家標(biāo)準(zhǔn)委和衛(wèi)生部于2007年聯(lián)合發(fā)布的《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中也規(guī)定了飲用水中銅離子含量不高于1.0mg/L (約15.625μΜ)。由此可見，如何快速高效的檢測飲用水、污水、河流以及生物體中的銅離子就顯得十分重要和迫切。
[0003]比色傳感器是一類以吸光度改變或波峰位移加以測量并伴隨產(chǎn)生顏色差異的傳感器。比色傳感器以特定物質(zhì)在一定波長范圍內(nèi)對電磁波的吸收特性為依據(jù)而建立的定性及定量檢測工具，它因具有操作簡便、成本低廉、靈敏度高、特異性強和快速檢測等優(yōu)點而得到廣泛應(yīng)用。
[0004]近些年來，納米材料技術(shù)迅速發(fā)展并被廣泛應(yīng)用于重金屬離子檢測、藥物輸送、疾病診斷等領(lǐng)域。納米材料本身具有表面效應(yīng)、微尺寸效應(yīng)、量子效應(yīng)和宏觀量子隧道效應(yīng)等優(yōu)良特性，使其在發(fā)展新型高靈敏度、高穩(wěn)定性、低成本生物傳感器領(lǐng)域成為國內(nèi)外研究熱點。尤其是金納米材料，因其在可見光范圍內(nèi)具有優(yōu)異的光學(xué)性能，而成為研究的熱點材料，有著廣泛的應(yīng)用價值，目前已有商業(yè)化的基于金納米材料的傳感器在市場銷售，如早孕試紙。特異性多肽因其能夠與其相對應(yīng)的物質(zhì)(如離子、小分子、蛋白質(zhì)、核苷酸等)發(fā)生特異性的作用，同時又可以共價鍵形式(如金-巰鍵和酰胺鍵)修飾到其他材料上，而受到研究者的青睞，使得其在生物傳感器領(lǐng)域具有極大的應(yīng)用前景，目前研究者主要利用其特性去設(shè)計構(gòu)建用于酶活檢測和特定蛋白檢測的比色檢測體系，但在重金屬離子特別是銅離子的檢測方面還未見報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的之一在于提供一種特異性多肽修飾的比色傳感器。用以實現(xiàn)對銅離子的檢測。
[0006]本發(fā)明的目的之二在于提供該傳感器的制備方法。
[0007]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下機理:首先通過金-巰鍵將特異性多肽修飾到金納米顆粒表面，在銅離子存在的條件下促使金納米顆粒表面的特異性多肽的構(gòu)象由α螺旋轉(zhuǎn)變?yōu)棣抡郫B，從而引起金納米顆粒分散性的降低并直接致使金納米顆粒之間發(fā)生聚集，表現(xiàn)為在520nm波長處體系吸光度的降低和顏色的改變。
[0008]一種特異性多肽修飾的比色傳感器，其特征在于該比色傳感器是在金納米顆粒表面，通過金-巰鍵修飾有特異性多肽，所述的特異性多肽與金納米顆粒的質(zhì)量比為:1:180-1:200 ;所述的金納米顆粒的粒徑:12.5-13nm ;所述的特異性多肽的序列為:Ac - Cys-Gly-Gly-Gly-Ser-1Ie-Arg-Lys-Leu-Glu-Tyr-Glu-1Ie-Glu-Glu-Leu-Arg-Leu-Arg-1Ie-Gly。
[0009]一種制備上述的特異性多肽修飾的比色傳感器的方法，其特征在于該方法的具體步驟為:將金納米顆粒分散在去離子水中配制成濃度為2.3-3.0nM/L的懸浮液；按所述的特異性多肽與金納米顆粒的質(zhì)量比為:1:180-1:200的比，將濃度為0.02mg/mL的特異性多肽的溶液與所述的金納米顆粒懸浮液混勻后室溫孵育過夜；離心分離機離心20min后去除上清液，得到特異性多肽修飾的金納米顆粒。
[0010]上述的金納米顆粒的制備方法為:將質(zhì)量濃度為0.01%的氯金酸溶液攪拌加熱至回流2?3分鐘后，加入質(zhì)量濃度為I %的檸檬酸三鈉溶液，當(dāng)反應(yīng)液顏色逐漸變?yōu)榫萍t色之后，停止加熱并繼續(xù)攪拌至室溫；所述的氯金酸與檸檬酸三鈉的質(zhì)量比為1:0.3-1:0.5。
[0011]最后，將混合物再次離心(1000rpm 20min)，用HEPES溶液進(jìn)行復(fù)溶，即得到ImL修飾特異性多肽的金納米顆粒。用紫外分光光度計分別檢測裸金納米顆粒和修飾特異性多肽的金納米顆粒的UV光譜。
[0012]不同濃度的銅離子存在下的UV光譜:取多個45μ?的修飾特異性多肽的金納米顆粒，向其中分別加入5μ?不同濃度的銅離子溶液，混合均勻，孵育90min后用移液槍加入到比色皿內(nèi)測量UV光譜。可以看到隨著銅離子濃度的增大，在520nm處吸光度下降也越大，并且峰位偏移量增多，并且在銅離子濃度低于?μΜ時吸光度變化相對較小，當(dāng)銅離子濃度大于150μΜ時擬合曲線趨于平緩。經(jīng)過對銅離子濃度范圍為10_150μΜ內(nèi)的特異性多肽修飾的金納米顆粒在520nm處的吸光度變化量進(jìn)行線性擬合，得到檢測銅離子的精確線性范圍為10_150μΜ，相關(guān)系數(shù)R2為0.99853，說明特異性多肽修飾的金納米顆粒可以對10_150μΜ濃度范圍的銅離子進(jìn)行檢測。
[0013]本發(fā)明的優(yōu)點和特點如下所述:
本發(fā)明第一次將特異性多肽修飾的金納米顆粒應(yīng)用于銅離子的檢測，觀察金納米顆粒在修飾前后光學(xué)特性的變化，研究隨時間推移銅離子引起特異性多肽修飾的金納米顆粒的聚集情況，和不同濃度的銅離子引起特異性多肽修飾的金納米顆粒的吸光度變化和顏色差異，同時觀察未修飾特異性多肽的金納米顆粒和修飾特異性多肽的金納米顆粒在銅離子存在下的聚集反應(yīng)引起吸光度和顏色差異的不同，以及特異性多肽修飾的金納米顆粒比色傳感器對銅離子檢測的高選擇性。結(jié)果表明，特異性多肽修飾的金納米顆粒能夠有效地檢測銅離子，在銅離子濃度為10-150μΜ范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2為0.99853。
[0014]本發(fā)明構(gòu)建了一種用于銅離子檢測的新型傳感器，將特異性多肽修飾的金納米顆粒應(yīng)用于銅離子的比色檢測，取得了滿意的結(jié)果。同樣的原理還可推廣到其它物質(zhì)的檢測，應(yīng)用前景廣泛。
[0015]本發(fā)明方法制備的特異性多肽修飾的金納米顆粒比色傳感器應(yīng)用于銅離子的檢測，具有實驗操作方便、靈敏性高、特異性強、檢測范圍廣等優(yōu)點。能夠成功檢測濃度范圍為10_150μΜ的銅離子，可以檢測的最低濃度為?μΜ。本發(fā)明首次將特異性多肽修飾的金納米顆粒作為銅離子檢測的比色傳感器，對飲用水、血清、河流、污水等液體中銅離子含量的檢測有潛在的應(yīng)用價值，同樣的原理可以用于其他離子的檢測，應(yīng)用前景廣泛。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1為不同濃度的銅離子與特異性多肽修飾的金納米顆粒孵育90min后的UV光譜圖。

【具體實施方式】
[0017]現(xiàn)將本發(fā)明的具體實施例敘述于后。
[0018]實施例1:
本實施例中特異性多肽修飾的金納米顆粒與銅離子作用的UV光譜測定方法和步驟如下:
(I)特異性修飾多肽的金納米顆粒的制備:首先，制備粒徑為13nm的金納米顆粒。將質(zhì)量濃度為0.01%的氯金酸溶液加入到裝有回流冷凝裝置的圓底燒瓶中，加熱并快速攪拌，當(dāng)氯金酸溶液沸騰2-3分鐘后，一次性快速加入3.5 mL質(zhì)量濃度為I %的檸檬酸三鈉溶液，再持續(xù)加熱15分鐘，當(dāng)溶液顏色逐漸變?yōu)榫萍t色之后,停止加熱并繼續(xù)攪拌30min，使其冷卻至室溫，于4°C儲存?zhèn)溆谩Ｈ缓螅?0μ?濃度為lmg/mL的特異性多肽溶液加入到980μ? HEPES溶液中混合均勻，得到ImL金納米顆粒的修飾溶液。取上述金納米顆粒溶液ImL,用高速離心機進(jìn)行離心(12000rpm 20min),除去上清液,然后加入等體積的多肽修飾液進(jìn)行復(fù)溶，室溫下孵育過夜。最后，將混合物再次離心(12000rpm 20min)，用HEPES溶液進(jìn)行復(fù)溶，即得到ImL修飾特異性多肽的金納米顆粒。用紫外分光光度計分別檢測裸金納米顆粒和修飾特異性多肽的金納米顆粒的UV光譜。可以發(fā)現(xiàn)，金納米顆粒在特異性多肽修飾前后的峰位發(fā)生了偏移，并且特異性多肽修飾的金納米顆粒的粒徑明顯大于裸金納米顆粒。
[0019](2)不同濃度的銅離子存在下的UV光譜:取多個45μ?的修飾特異性多肽的金納米顆粒，向其中分別加入5PL不同濃度的銅離子溶液，混合均勻，孵育90min后用移液槍加入到比色皿內(nèi)測量UV光譜。可以看到隨著銅離子濃度的增大，在520nm處吸光度下降也越大，并且峰位偏移量增多，并且在銅離子濃度低于ιμΜ時吸光度變化相對較小，當(dāng)銅離子濃度大于150μΜ時擬合曲線趨于平緩。經(jīng)過對銅離子濃度范圍為10_150μΜ內(nèi)的特異性多肽修飾的金納米顆粒在520nm處的吸光度變化量進(jìn)行線性擬合，得到檢測銅離子的精確線性范圍為10-150μΜ，相關(guān)系數(shù)R2為0.99853，說明特異性多肽修飾的金納米顆粒可以對10_150μΜ濃度范圍的銅離子進(jìn)行檢測。
[0020]比色法測定銅離子:
采用銅離子濃度分別為:0 μΜ, I MM, 10 μΜ, 20 μΜ, 30 μΜ,50 μΜ，80 μΜ, 100 μΜ, 150 μΜ,200 μΜ。
[0021]測試條件:以波長為400-800nm的光為光源，以90min作為孵育時間，在室溫條件下進(jìn)行不同濃度銅離子作用下的UV光譜測定。
[0022]參見附圖，圖1為不同濃度的銅離子與特異性多肽修飾的金納米顆粒孵育90min后的UV光譜圖。
[0023]由圖可見:隨著銅離子濃度的增大(隨箭頭方向)，在520nm處吸光度下降也越大，并且峰位偏移量增多。
【權(quán)利要求】
1.一種特異性多肽修飾的比色傳感器，其特征在于該比色傳感器是在金納米顆粒表面，通過金-巰鍵修飾有特異性多肽，所述的特異性多肽與金納米顆粒的質(zhì)量比為:1:180-1:200 ;所述的金納米顆粒的粒徑:12.5-13nm ;所述的特異性多肽的序列為:Ac - Cys-Gly-Gly-Gly-Ser-1Ie-Arg-Lys-Leu-Glu-Tyr-Glu-1Ie-Glu-Glu-Leu-Arg-Leu-Arg-1Ie-Gly。
2.一種制備根據(jù)權(quán)利要求1所述的特異性多肽修飾的比色傳感器的方法，其特征在于該方法的具體步驟為:將金納米顆粒分散在去離子水中配制成濃度為2.3-3.0nM/L的懸浮液；按所述的特異性多肽與金納米顆粒的質(zhì)量比為:1:180-1:200的比，將濃度為0.02mg/mL的特異性多肽的溶液與所述的金納米顆粒懸浮液混勻后室溫孵育過夜；離心分離機離心20min后去除上清液,得到特異性多肽修飾的金納米顆粒。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的金納米顆粒的制備方法為:將質(zhì)量濃度為0.01%的氯金酸溶液攪拌加熱至回流2?3分鐘后，加入質(zhì)量濃度為I %的檸檬酸三鈉溶液，當(dāng)反應(yīng)液顏色逐漸變?yōu)榫萍t色之后，停止加熱并繼續(xù)攪拌至室溫；所述的氯金酸與檸檬酸三鈉的質(zhì)量比為1:0.3-1:0.5。
【文檔編號】G01N21/33GK104165855SQ201410193866
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年5月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月9日
【發(fā)明者】李根喜, 陳紅霞, 張江江, 祁方杰 申請人:上海大學(xué)