一種競爭elisa試劑盒檢測牛布氏桿菌病的方法
【專利摘要】一種競爭ELISA試劑盒檢測牛布氏桿菌病的方法，屬于生物技術檢測領域，將超聲裂解處理的牛種布魯氏菌A99包被ELISA酶標板；再將抗布魯氏菌特異單克隆抗體bru-5C10和稀釋的待檢血清樣品加入酶標板的板孔中；并同時分別將抗布魯氏菌特異單克隆抗體bru-5C10分別和已知的陰、陽性血清加入酶標板的板孔中，水浴后用PBST洗滌，再向各板孔中分別加入抗小鼠IgG酶標抗體，孵育洗滌后，進行顯色反應，測得各板孔的OD450值，計算各板孔的抑制率。本發明利用建立的cELISA方法對小腸結腸炎耶爾森菌O9和大腸桿菌O157高免陽性血清進行檢測，PI值均低于30%，可以有效地排除假陽性結果的發生。
【專利說明】—種競爭ELISA試劑盒檢測牛布氏桿菌病的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物技術檢測領域，具體涉及對牛、羊的布魯氏菌病的一種檢測【技術領域】。
【背景技術】
[0002]布魯氏菌病(布病)是由布魯氏菌引起的一種重要的人獸共患病，反芻動物特別是牛和羊容易感染。根據抗原型和宿主類型將布魯氏菌分為6類，患病母畜一般癥狀是流產，雄性則引起不育等生殖障礙。近幾年在世界范圍內布病呈現出反彈的趨勢，在中國，牛種布魯氏菌(B.abortus)和羊種布魯氏菌(B.melitensis)造成的危害尤為廣泛和嚴重,該病給畜牧業和公共衛生事業造成巨大經濟損失，加強對布病的防控具有重要的現實意義。
[0003]對布病進行準確診斷是防止該病蔓延的首要措施，常見的布病血清學診斷方法主要有凝集試驗、補體結合試驗(CFT)、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)和熒光偏振試驗(FPA)。由于牛種布魯氏菌和某些桿菌(最主要的是小腸結腸炎耶爾森菌09、大腸桿菌0157)在脂多糖鏈(LPS)上存在共同的抗原位點，一般認為這些抗原位點屬于脂多糖上可溶的蛋白類物質，因此血清學檢測中往往因為交叉反應的存在而造成假陽性結果。相對而言，凝集試驗的特異性和敏感性均較低，在一些發達國家已停止使用。CFT雖然特異性和敏感性均比較高，但由于操作繁瑣，不適合常規檢驗，更不適合高通量檢測，往往只用于確診或作為其它診斷方法的仲裁。利用單克隆抗體(Mab)建立的檢測動物血清中抗體的競爭ELISA (cELISA)方法已然成為目前檢測布病的可靠方法之一。
[0004]目前為止，已制備針對位于脂多糖O鏈上(O-LPS)的A抗原、M抗原、C抗原和C/Y抗原的單克隆抗體；另一方面，學者們發現某些特定的外膜蛋白也存在免疫原性，如0MP31等利用這些單克隆抗體建立的cELISA方法早已應用于對布病的血清學檢測，但由于不同單抗靈敏度和特異性等因素的限定，以及交叉反應的干擾，在實際檢測當中往往會出現漏檢、錯檢的結果。事實上，經本發明人研究發現，利用補體結合實驗(CFT)和已建立的cELISA方法在檢測臨床樣品時存在一定的不吻合率，特別是對一些介于陰性和陽性之間的疑似樣品的判定。
【發明內容】
[0005]本發明目的是提出一種能夠提高檢測準確性的競爭ELISA試劑盒檢測牛布氏桿菌病的方法。
[0006]本發明的技術方案包括以下步驟:
1)將超聲裂解處理的牛種布魯氏菌A99包被ELISA酶標板；
2)將抗布魯氏菌特異單克隆抗體bru-5C10和稀釋的待檢血清樣品加入酶標板的板孔中；并同時分別將抗布魯氏菌特異單克隆抗體bru-5C10分別和已知的陰、陽性血清加入酶標板的板孔中，37°C水浴I小時后，用PBST洗滌，再向各板孔中分別加入抗小鼠IgG酶標抗體，孵育洗滌后，進行顯色反應； 3)測得各板孔的0D450值；
4)由公式IOOX(1-OD陰性對照/OD待檢樣品)％分別計算各板孔的抑制率；
其中，ODb31wm為加入了抗布魯氏菌特異單克隆抗體bru-5C10和已知的陰性血清的D45tl值畑_#@為加入了抗布魯氏菌特異單克隆抗體bru-5C10和稀釋的待檢血清樣品的板孔的 OD45tl 值；
5)判定待檢血清樣品:抑制率>30%，則判定待檢血清樣品為陽性。
[0007]本發明采用單克隆抗體Bru_5C10建立的cELISA通過軟件的ROC分析給出的最佳臨界值PI=25%，此時特異性為96.3%，敏感度為99.1% ;為了提高檢測過程中的特異性，本發明選擇PI=30%作為臨界值，此時特異性為98.8%，敏感度為96.2%。
[0008]本發明利用建立的cELISA方法對小腸結腸炎耶爾森菌09和大腸桿菌0157高免陽性血清進行檢測，PI值均低于30%，說明本發明可以有效地排除假陽性結果的發生。
[0009]為了建立更準確的檢測布病的cELISA方法，本發明利用滅活的牛種布魯氏菌2308免疫小鼠，通過細胞融合技術獲得I株對牛種布魯氏菌有良好反應性的單克隆抗體，命名為單克隆抗體bru-5C10。本發明的單克隆抗體bru-5C10為雜交瘤細胞株bru_5C10分泌獲得。
[0010]本發明的單克隆抗體bru-5C10，于2014年5月7日保藏于北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏號CGMCC N0.9219，
生物材料:Bru-5C10，分類命名:雜交瘤細胞株。
[0011]另外，將超聲裂解處理的牛種布魯氏菌A99按1.75μδ/孔溶于ρΗ=9.6的碳酸鹽緩沖液中，ΙΟΟμΙ/孔加入酶標版中，4°C孵育12h，棄去酶標板中的液體后，用PBST配制的5%脫脂乳，ΙΟΟμΙ/孔加入酶標版中，封閉后于37°C放置，3h后棄去封閉液，再用PBST洗滌2次，即得包被牛種布魯氏菌A99的ELISA酶標板。該酶標板包被抗原的獲得采用超聲裂解法，相對于熱酚法降低了繁瑣度并保證了有效性；其中包被過程中，各條件的選擇都采用控制單一變量原則經實驗分析得出，保證了最佳反應性。
[0012]所述超聲裂解處理的牛種布魯氏菌A99的方法是:用生理鹽水洗下在胰蛋白胨大豆瓊脂培養基(簡稱:TSA，由酪蛋白、大豆粉木瓜、氯化鈉、瓊脂等組成)上生長的牛種布魯氏菌S2308，置于80°C水浴滅活2h后調節菌液濁度，使其濁度約為lX101(lCFU/ml ;然后以頻率為30HZ的超聲裂解破碎菌體3?4次，15min/次。
[0013]本研究所建立的檢測牛布氏桿菌病的cELISA方法，通過對320份臨床牛血清樣品的檢測并與商品化布病cELISA試劑盒(Svanova公司)比較，結果顯示兩者的符合率為95.6%，且經第三方實驗(補體結合實驗)驗證不吻合樣品，本研究所建立的方法有更高的符合率。其意義在于本方法對布氏桿菌病的血清學檢測特異性更強，敏感性更好。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0014]圖1為單抗Bru_5C10的免疫印跡試驗圖。
【具體實施方式】
[0015]一、通過細胞融合技術獲得對牛種布魯氏菌有良好反應性的單克隆抗體bru-5C10:取經過常規免疫后小鼠的脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞按照標準程序進行細胞融合。收集雜交瘤細胞上清，用間接酶聯免疫吸附實驗法(iELISA)篩選與牛種布魯氏菌A99粗提的LPS具有強反應，而與小腸結腸炎耶爾森菌09粗提的LPS無反應的陽性雜交瘤細胞株。按照有限稀釋法進行2次亞克隆獲得單克隆抗體bru-5C10。
[0016]二、單克隆抗體bru_5C10的保存證明信息:
保藏號CGMCC N0.9219，保藏地址為:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏日:2014年5月7日。生物材料:Bru-5C10，分類命名:雜交瘤細胞株。
[0017]三、制作牛種布魯氏菌A99包被ELISA酶標板:
用生理鹽水洗下在胰蛋白胨大豆瓊脂培養基(簡稱:TSA。胰蛋白胨大豆瓊脂培養基由酪蛋白、大豆粉木瓜、氯化鈉、瓊脂等組成)上生長的牛種布魯氏菌S2308，置于80°C水浴滅活2h，調節菌液濁度，使其濁度約為I X 1010CFU/ml ;然后再利用超聲裂解破碎菌體:超聲頻率為30HZ，15min/次，進行3~4次。
[0018]將超聲裂解處理過的牛種布魯氏菌A99按1.75μδ/孔溶于ρΗ=9.6的碳酸鹽緩沖液中，100μΙ/孔加入酶標版中，4°C孵育12h。棄去酶標板中的液體后，用PBST配制的5%脫脂乳，100μΙ/孔加入酶標版中，封閉后于37°C放置，3h后棄去封閉液，再用PBST洗滌2次，即得包被牛種布魯氏菌A99的ELISA酶標板。
[0019]四、檢測試驗:
以PBST為緩沖液， 將待檢樣本稀釋20倍，待用。
[0020]以PBST為緩沖液，分別將牛的陰性血清和陽性血清稀釋20倍，待用。
[0021]向包被牛種布魯氏菌A99的ELISA酶標板的各孔分別加入50μ1稀釋后的待檢樣品和50μ1用PBST按照1:4000進行稀釋的單克隆抗體Bru_5C10。
[0022]同時取標準陰性血清和陽性血清作為陰陽對照組，向包被牛種布魯氏菌A99的ELISA酶標板的A1-A2孔中分別加入50μ1稀釋后的陰性血清和50μ1工作濃度的單克隆抗體bru-5C10，向包被牛種布魯氏菌A99的ELISA酶標板的A3-A4孔中分別加入50μ1稀釋后的陽性血清和50μ1工作濃度的單克隆抗體bru-5C10。
[0023]分別將各孔中的體系充分混勻后，將酶標板在37°C孵育30min后，再分別以PBST洗滌4次。再向每孔加入100μΙ HRP標記的羊抗鼠IgG，37°C孵育30min后，以PBST洗滌5次。然后加入底物顯色液室溫作用IOmin,以2M硫酸終止。
[0024]分別讀取各孔的0D450值。
[0025]OD83ft5iwS加入了抗布魯氏菌特異單克隆抗體bru_5C10和已知的陰性血清的板孔的OD45tl值加入了抗布魯氏菌特異單克隆抗體bru-5C10和稀釋的待檢血清樣品的板孔的OD45tl值。
[0026]并根據公式100 X (1-0D陰性對照/OD待檢樣品)%分別計算抑制率(PI)。
[0027]計算結果:已知的陽性血清相應的抑制率(PI)≥30%,已知的陰性血清相應的抑制率(PI) < 30%。
[0028]以此為標準，將待檢樣本各孔的抑制率(PI)進行加合后求平均值，如平均值為^ 30%，則待檢樣本為陽性；如平均值為< 30%，則待檢樣本為陰性。
[0029]五、cELISA的重復性:經重復性實驗結果證明，本發明所建立的cELISA批內重復性的平均變異系數為2.2% ;批間重復性的平均變異系數為5.9%，表明該cELISA方法具有良好的可重復性。
[0030]六、試劑盒中的單克隆抗體與小腸結腸炎耶爾森菌09、大腸桿菌0157沒有交叉反應。
[0031]如圖1的單抗Bru_5C10的免疫印跡試驗圖所示，其中:
I顯示了牛種布魯氏菌S2308超聲裂解后的上清液與單抗Bru-5C10反應結果；
2顯示了牛種布魯氏菌A99超聲裂解后上清液與單抗Bru-5C10反應結果；
3顯示了小腸結腸炎耶爾森菌09超聲裂解后上清液與單抗Bru-5C10反應結果；
4顯示了大腸桿菌0157超聲裂解后上清液與單抗Bru-5C10反應結果。
【權利要求】
1.一種競爭ELISA試劑盒檢測牛布氏桿菌病的方法，其特征在于包括以下步驟: 1)將超聲裂解處理的牛種布魯氏菌A99包被ELISA酶標板； 2)將抗布魯氏菌特異單克隆抗體bru-5C10和稀釋的待檢血清樣品加入酶標板的板孔中；并同時分別將抗布魯氏菌特異單克隆抗體bru-5C10分別和已知的陰、陽性血清加入酶標板的板孔中，37°C水浴后，用PBST洗滌，向各板孔中分別加入抗小鼠IgG酶標抗體，孵育洗滌后，進行顯色反應； 3)測得各板孔的OD45tl值； 4)由公式100X(1-OD陰性對照/OD待檢樣品)％分別計算各板孔的抑制率； 其中，ODPj3ft5iw為加入了抗布魯氏菌特異單克隆抗體bru-5C10和已知的陰性血清的板孔的OD45tl值；00#|&#@為加入了抗布魯氏菌特異單克隆抗體bru-5C10和稀釋的待檢血清樣品的板孔的OD45tl值； 5)判定待檢血清樣品:抑制率>30%，則判定待檢血清樣品為陽性。
2.根據權利要求1所述競爭ELISA試劑盒檢測牛布氏桿菌病的方法，其特征在于單克隆抗體bru-5C10為雜交瘤細胞株bru-5C10分泌獲得。
3.根據權利要求1所述競爭ELISA試劑盒檢測牛布氏桿菌病的方法，其特征在于將超聲裂解處理的牛種布魯氏菌A99按1.75μδ/孔溶于pH為9.6的碳酸鹽緩沖液中，ΙΟΟμΙ/孔加入酶標版中，4°C孵育12h，棄去酶標板中的液體后，用PBST配制的5%脫脂乳，ΙΟΟμΙ/孔加入酶標版中，封閉后于37°C放置，3h后棄去封閉液，再用PBST洗滌2次，即得包被牛種布魯氏菌A99的ELISA酶標板。
4.根據權利要求1或2或3所述競爭ELISA試劑盒檢測牛布氏桿菌病的方法，其特征在于所述超聲裂解處理的牛種布魯氏菌A99的方法是:用生理鹽水洗下在胰蛋白胨大豆瓊脂培養基上生長的牛種布魯氏菌S2308，置于80°C水浴滅活2h后調節菌液濁度，使其濁度約為I X 1010CFU/ml ;然后以頻率為30HZ的超聲裂解破碎菌體3?4次，15min/次。
【文檔編號】G01N33/577GK103995123SQ201410266781
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年6月16日 優先權日:2014年6月16日
【發明者】秦愛建, 王志明, 丁家波, 邵紅霞, 錢琨, 馮忠武 申請人:揚州大學
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